IL-17A基因敲除對氟誘導小鼠肝炎癥反應(yīng)和肝細胞凋亡的影響

趙陽飛,于洋歡,王金明,張建海,孫子龍,牛瑞燕,王俊東

(山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院,太谷 030801)

由于地理因素和環(huán)境因素的影響,氟廣泛存在于人畜生活的水和食物中。長期過量的氟暴露能夠?qū)е氯诵蠓卸?。畜禽氟中毒導致繁殖率、生產(chǎn)性能、使用價值降低,使其成為威脅我國畜牧業(yè)發(fā)展的潛在因素[1-2]。肝作為機體重要的解毒和代謝器官,前期研究氟能夠?qū)е赂谓Y(jié)構(gòu)和功能的損傷[3]。肝損傷能夠?qū)е聶C體物質(zhì)代謝紊亂和有害物質(zhì)的蓄積,進而影響畜禽的生產(chǎn)性能和動物性食品安全。因此,深入探究氟致肝損傷的致病機理尋找可能的治療靶點對于維持畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和動物性食品安全具有重要意義。

IL-17作為Th17細胞分泌的促炎因子,其家族包含IL17A～F。IL-17家族中IL-17A含量最多,且生物活性最強,通常所說的IL-17即IL-17A[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)氟暴露后肝中IL-17A顯著升高。IL-17A的高表達將導致中性粒細胞的募集和免疫細胞的慢性浸潤[5]。同時,IL-17A可通過IL-17A受體通路促進細胞因子的產(chǎn)生,導致自身免疫和組織損傷[6]。最近的研究發(fā)現(xiàn),IL-17A能夠調(diào)節(jié)多種細胞的凋亡過程[7]。凋亡作為清除受損和有害細胞的程序性死亡過程,其與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。凋亡能夠促進炎癥病灶受損細胞的清除,而炎癥反應(yīng)過程中產(chǎn)生的炎癥因子能夠促進凋亡的增加[8-9]。然而,炎癥反應(yīng)和凋亡在氟誘導肝損傷中的相互作用關(guān)系,及IL-17A在該過程中的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。

為此,本研究建立IL-17A基因敲除氟中毒小鼠模型,運用HE染色、ELISA、流式細胞術(shù)、免疫組化等技術(shù)檢測肝的組織形態(tài)變化、炎癥細胞含量、炎癥因子水平和凋亡情況,進而探究氟對肝炎癥反應(yīng)和凋亡的影響,并明確IL-17A在該過程中的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

C57小鼠和IL-17A基因敲除小鼠購自南模生物有限公司;氟化鈉購自Sigma公司;HE染色試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒購自索萊寶科技有限公司;ELISA試劑盒購自西唐生物科技有限公司;JC-1和Annexin V購自碧云天生物技術(shù)研究所;流式細胞抗體購自BD Pharmingen公司;免疫組化一抗和二抗購自武漢三鷹生物科技有限公司。

1.2 動物模型

24只野生型8周齡C57成年雄性小鼠隨機分為對照組和NaF組,12只8周齡IL-17A基因敲除雄性小鼠作為KO+NaF組(體重20～25 g)。對照組飲用去離子水,NaF組和KO+NaF組飲用50 mg·L-1NaF的去離子水[5]。標準實驗室條件下按照試驗分組飼養(yǎng)12周。飼養(yǎng)結(jié)束后眼球采血,斷頸處死小鼠,收集肝樣品。

1.3 HE染色

小鼠處死后立即取適量大小肝組織固定于4%多聚甲醛。固定后的組織塊進行沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片制成5 μm的石蠟切片。然后,石蠟切片經(jīng)過脫蠟至水、蘇木精(5 min)和伊紅(1 min)浸染、脫水、透明、封片。最后400倍鏡下隨機挑選10個區(qū)域觀察組織中的異常病理變化并記錄,并根據(jù)記錄綜合評定每組肝的損傷情況。

肝的組織形態(tài)。

1.4 透射電鏡

透射電鏡用于觀察肝的超微結(jié)構(gòu)變化。快速切取2 mm3的新鮮肝組織放入預冷的2.5%戊二醛溶液中固定2 h。組織塊經(jīng)乙醇和丙酮常規(guī)脫水,環(huán)氧樹脂包埋。然后,用超薄切片機制作50～70 nm切片,并用醋酸鈾染色液 (30 min)和檸檬酸鉛染色液(10 min)染色。最后,用透射電鏡觀察肝超微結(jié)構(gòu)。

1.5 ELISA檢測

用預冷的PBS洗滌肝,并切取適量組織加入到10倍體積的PBS中。組織勻漿后,4 ℃ 離心(12 000g,15 min),吸取上清備用。然后,BCA測定蛋白濃度,并按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測勻漿液中炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-17、TGF-β、INF-γ、IL-1β、IL-23)的含量。最后,計算每mg肝組織勻漿液中炎癥因子含量=炎癥因子含量/蛋白濃度。

1.6 流式細胞檢測

本研究分別用CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD68、CD11c、CD56、CC1、γδTCR流式抗體標記CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞、γδT 細胞。小鼠處死后,取新鮮肝組織制備細胞懸液。細胞懸液經(jīng)過濾和洗滌后,用裂解液破碎紅細胞。隨后用流式抗體(1∶100)孵育30 min(對于胞內(nèi)蛋白在抗體孵育前進行固定和破膜)。洗滌3次后上機(BD LSRFortessa細胞分析儀),并使用FlowJo處理數(shù)據(jù)。

1.7 免疫組化

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶,并用檸檬酸鈉-EDTA抗原修復液100 ℃修復15 min。PBS洗滌后,兔抗鼠一抗(Caspase3和Cyt-c,1∶100)4 ℃孵育過夜,生物素化的山羊抗兔二抗(1∶1 500)室溫下孵育1 h。然后,用DAB顯色(試驗過程中防止組織干燥),并用中性樹脂封片。最后,用普通顯微鏡觀察和圖像分析軟件(Image-Pro Plus)分析光密度值。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié) 果

2.1 IL-17A基因敲除對氟誘導的肝組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)損傷的影響

通過HE染色和透射電鏡觀察組織病理學和超微結(jié)構(gòu)變化(圖1)。

黃色箭頭:炎癥細胞;藍色剪頭:顆粒變性;黃色箭頭:空炮變性;橙色箭頭:核固縮;紫色箭頭:核溶解;N. 細胞核;M. 線粒體;E. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Yellow arrow: inflammatory cells; Blue arrow: particle denaturation; Yellow arrow: vacuolar denaturation; Orange arrow: nuclear solidification; Purple arrow: karyolysis; N. Nuclear; M. Mitochondria; E. Endoplasmic reticulum圖1 HE染色(400×,n=6)和透射電鏡結(jié)果(20 000×,n=3)Fig.1 The results of HE staining (400×, n=6) and transmission electron microscopy (TEM, 20 000×, n=3)

結(jié)果顯示,對照組小鼠的肝形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,肝索排列緊密且有規(guī)則,線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常,無明顯異常。然而,氟暴露后肝中炎癥細胞浸潤增加,肝細胞間隙增大,顆粒變性、空泡變性、核固縮、核溶解肝細胞數(shù)量增多,線粒體畸形和脊損傷增加,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張和破碎增加。與NaF組相比,IL-17A基因敲除后肝組織結(jié)構(gòu)損傷減輕,核固縮和核溶解細胞數(shù)量減少,炎癥細胞浸潤降低,畸形線粒體數(shù)量降低,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷減輕、數(shù)量增多。結(jié)果表明,IL-17A緩解了氟誘導的肝組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)損傷。

2.2 IL-17A基因敲除對氟誘導肝炎癥因子表達改變的影響

本研究運用ELISA檢測炎癥反應(yīng)過程中關(guān)鍵炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-17、TGF-β、INF-γ、IL-1β、IL-23)在肝中的含量(圖2)。與對照組相比,NaF組肝中TNF-α、IL-17、INF-γ、IL-23、TGF-β的含量顯著升高(P<0.05,P<0.01),IL-1β的含量顯著降低(P<0.01),然而,與NaF組相比,KO+NaF組肝中TNF-α、IL-17、INF-γ、IL-23、TGF-β的含量顯著降低(P<0.05,P<0.01),IL-1β的含量顯著升高(P<0.01)。IL-6含量在NaF組和KO+NaF組無顯著變化。這些結(jié)果表明,IL-17A基因敲除緩解了氟誘導的肝炎癥因子表達改變。

與對照組相比,*.P<0.05,**.P<0.01;#.P<0.05,與NaF組相比,##.P<0.01;下同*.P<0.05, **.P<0.01, vs control group; #.P<0.05, ##.P<0.01, vs NaF group; The same as below圖2 肝炎癥因子ELISA檢測結(jié)果Fig.2 ELISA detection results of hepatic inflammatory factors (n=8,

2.3 IL-17A基因敲除對氟誘導肝CD4+T細胞和CD8+T細胞水平改變的影響

本研究用流式細胞術(shù)檢測了肝中CD4+T細胞和CD8+T細胞。如圖3所示,氟暴露后肝CD4+T細胞和CD4+T細胞/CD8+T細胞比值顯著降低(P<0.05)。然而,與NaF組相比,IL-17A基因敲除顯著增加了肝中CD4+T細胞和CD4+T細胞/CD8+T細胞比值(P<0.05)。CD8+T細胞在NaF組和KO+NaF組中無顯著差異。

圖3 CD4+T細胞和CD8+T細胞含量流式檢測結(jié)果Fig.3 The flow cytometry results of CD4+ T cell and CD8+ T cell contents (n=6,

2.4 IL-17A基因敲除對氟誘導肝炎癥細胞水平改變的影響

本研究通過流式細胞術(shù)檢測肝中樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、自然殺傷細胞、γδT 細胞含量觀察IL-17A基因敲除對氟誘導肝炎癥細胞水平改變的影響(圖4)。結(jié)果顯示,與對照組相比,NaF組肝中自然殺傷細胞和γδT 細胞顯著降低,M2型巨噬細胞和樹突狀細胞顯著升高(P<0.05)。IL-17A基因敲除后肝中樹突狀細胞與NaF組相比顯著降低(P<0.05)。同時,KO+NaF組中的γδT 細胞和M2型巨噬細胞與對照組比無顯著差異。上述結(jié)果表明,IL-17A基因敲除緩解了氟誘導的肝炎癥細胞水平改變。

圖4 巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞、γδT 細胞含量流式檢測結(jié)果Fig.4 The flow cytometry results of macrophages, dendritic cells, natural killer cells, mast cells, and γδT cells contents (n=6,

2.5 IL-17A基因敲除對氟誘導肝細胞凋亡的影響

為探究IL-17A基因敲除對氟誘導的肝細胞凋亡的影響,本研究運用流式細胞術(shù)和免疫組化檢測了凋亡肝細胞數(shù)和凋亡標志蛋白Caspase3和Cyt-c的蛋白表達水平。Annexin V和PI雙染法是流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的經(jīng)典方法,流式結(jié)果如圖5所示,與對照組相比,NaF組中肝細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。然而,與NaF組相比,KO+NaF組中肝細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。與流式結(jié)果相似,免疫組化結(jié)果顯示(圖6,表1),與對照組相比,NaF組肝中Caspase3和Cyt-c的蛋白表達水平極顯著增加(P<0.01),而IL-17A基因敲除顯著降低了Caspase3和Cyt-c蛋白表達與NaF組相比(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果表明,IL-17A基因敲除減輕了氟誘導的肝細胞凋亡。

表1 肝Caspase3和Cyt-c蛋光密度值統(tǒng)計結(jié)果Table 1 The optical density value statistical results of Caspase3 and Cyt-c protein in the liver (n=5,

圖5 肝細胞凋亡流式檢測結(jié)果Fig.5 The flow cytometry results of hepatocyte apoptosis (n=6,

圖6 肝Caspase3和Cyt-c蛋白免疫組化結(jié)果(400×)Fig.6 Caspase3 and Cyt-c immunohistochemical results (400×)

3 討 論

氟中毒是一種廣泛分布于世界許多國家和地區(qū)的人畜共患性地方病,中國是受其危害較為嚴重的國家之一[10]。氟中毒主要是由于長期慢性的氟暴露引起,并造成機體多種組織和器官的損傷。肝是氟中毒的重要靶器官,氟能夠損傷肝的結(jié)構(gòu)和功能,進而影響機體的物質(zhì)代謝和有害物質(zhì)的蓄積[1]。在一項關(guān)于美國青少年血氟含量與肝功能相關(guān)性調(diào)查的研究發(fā)現(xiàn)血清氟含量與肝功能呈負相關(guān),氟暴露影響肝功能,反過來肝功能損傷會影響氟的吸收和代謝過程,這樣的惡性循環(huán)進一步加重了氟對肝的危害[11]。同時,大量研究發(fā)現(xiàn)氟暴露能夠?qū)е赂沃泻斯炭s、核溶解、空泡變性、脂肪變性增多,線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷,以及炎癥細胞的浸潤[5,12]。與上述研究結(jié)果相似,在本研究中氟暴露導致了肝組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)損傷。在前期研究中,作者發(fā)現(xiàn)氟暴露后肝中IL-17A含量和炎癥細胞浸潤顯著增加[5]。IL-17A作為重要的促炎因子,其在炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[13]。因此,作者推測IL-17A在氟誘導了肝的炎癥損傷中發(fā)揮重要的作用。

IL-17A參與急慢性炎癥過程,IL-17A的高表達能夠促進免疫細胞的慢性浸潤和多種炎癥因子的表達,并最終導致炎癥反應(yīng)和組織損傷[14-15]。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn),IL-17A功能的阻斷能夠有效緩解膽汁淤積誘導的肝細胞壞死和肝損傷。同時,Gomes等[17]的研究也發(fā)現(xiàn)阻斷IL-17A信號傳導可減少脂肪變性和肝損傷,并預防肝細胞癌。相似地,在本研究中IL-17A的基因敲除緩解了氟誘導的肝組織形態(tài)損傷。為探究IL-17A基因敲除緩解肝損傷的機制,本研究進一步檢測了肝中炎癥因子和炎癥細胞的變化情況。

炎癥反應(yīng)是機體抵御不良刺激的一種防御反應(yīng),但過強或長期的炎癥反應(yīng)能夠誘導機體組織器官的功能損傷[18]。已有大量的研究報道外源性毒物能夠?qū)е赂沃醒装Y因子和炎性細胞的水平改變,進而引發(fā)肝炎癥[19]。同時,研究發(fā)現(xiàn)氟作為廣泛存在與水和食物中的外源性毒物能夠增加肝中炎癥因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-13、IL-21、TNF-α和TGF-β水平升高,以及IFN-γ/IL-4和IL-2/IL-10比值的降低[20]。與上述結(jié)果相似,本研究中氟暴露增加了肝中TNF-α、IL-17A、INF-γ、IL-23、TGF-β含量,以及M2型巨噬細胞和樹突狀細胞水平。同時,氟暴露降低了IL-1β、自然殺傷細胞、γδT 細胞和CD4+T細胞水平,以及CD4+T細胞/CD8+T細胞比值。IL-23、IL-17、TNF-α、INF-γ、IL-1β是關(guān)鍵的促炎細胞因子,TGF-β是關(guān)鍵的抑炎細胞因子[21]。巨噬細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞、自然殺傷細胞、γδT 細胞能夠產(chǎn)生炎癥因子,并介導炎癥反應(yīng)過程[18]。CD4+T細胞是機體免疫力的重要指標,其含量降低表明機體免疫力減弱。CD4+T細胞/CD8+T細胞比值是免疫調(diào)節(jié)的一項重要指標,其比值的異常表明免疫功能的紊亂[22]。這些結(jié)果表明氟暴露降低了肝的免疫能力,擾亂了肝炎癥平衡,增加了肝的炎癥反應(yīng)。IL-17A作為炎癥反應(yīng)過程中重要的促炎因子,其不僅能夠增加炎癥因子的分泌,而且能夠促進炎癥細胞在受損組織中的浸潤[14]。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)阻斷IL-17A的作用顯著減少肝中促炎細胞因子、中性粒細胞、巨噬細胞的流入。在本試驗中,與NaF組相比,IL-17A基因敲除降低了肝中TNFα、IL-17A、INF-γ、IL-23、TGF-β的表達水平和樹突狀細胞含量,增加了IL-1β的表達水平。雖γδT 細胞和M2型巨噬細胞與氟組無顯著差異,但其與對照組比無顯著差異。有趣的是在本研究中IL-1β、自然殺傷細胞和γδT細胞在氟組降低,且IL-17A基因敲除增加了IL-1β水平。IL-1β結(jié)果可能的機制:IL-1β作為組織的細胞防御和組織修復的關(guān)鍵因子,其在細胞增殖、分化和凋亡等生物過程中發(fā)揮重要作用。肝作為自我修復能力較強的器官,受到氟的損傷后啟動修復機制,抑制了IL-1β的表達。IL-17A基因的敲除能夠緩解氟誘導的肝損傷,從而促進IL-1β的表達趨于正常。自然殺傷細胞和γδT細胞結(jié)果可能的機制:自然殺傷細胞和γδT細胞較為敏感,容易受到外源性毒物氟的刺激,激活細胞的凋亡程序,進而導致肝中自然殺傷細胞和γδT細胞數(shù)量的降低。自然殺傷細胞和γδT細胞作為機體重要的免疫細胞,其數(shù)量的減少能夠降低機體的免疫力,進一步影響機體的炎癥反應(yīng)。同時,IL-17A基因的敲除未參與到上述誘導自然殺傷細胞和γδT細胞凋亡的過程。因此,IL-17A基因的敲除未緩解氟誘導的上述改變。在未來的研究中作者將進一步探究IL-1β、自然殺傷細胞和γδT細胞在氟致肝損傷中的作用機制。上述結(jié)果表明,IL-17A基因敲除緩解了氟誘導的肝炎癥損傷。已有大量研究發(fā)現(xiàn),炎癥反應(yīng)與細胞凋亡密切相關(guān),一方面大量的炎癥因子能夠誘導細胞凋亡的發(fā)生,另一方面細胞凋亡能夠清除炎癥病灶內(nèi)中性粒細胞和其他滯留細胞,限制組織損傷,促進炎癥吸收[23]。因此,本研究進一步探究了IL-17A基因敲除對氟誘導的肝細胞凋亡的影響。

細胞凋亡是一種維持細胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的細胞自主性和程序性死亡方式。在生理條件下,機體通過凋亡去除不需要的和異常的細胞。而在病理條件下,受不利條件刺激細胞凋亡增加,導致正常細胞損傷[24]。已有研究發(fā)現(xiàn),氟可導致肝細胞的凋亡增加[25-26]。例如,Ouyang等[25]報道氟通過Cyt-c/Caspase3/9通路誘導了鴨肝細胞的凋亡。Lu等[26]報道氟通過氧化應(yīng)激和凋亡導致了小鼠肝損傷。與上述研究結(jié)果相似,本研究中氟暴露增加了肝中的凋亡細胞,以及凋亡關(guān)鍵基因Cyt-c和Caspase3的蛋白表達水平。Cyt-c是凋亡Caspase級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白酶激活因子,Caspase3是介導凋亡信號和執(zhí)行細胞凋亡的關(guān)鍵激酶[8]。同時,本研究發(fā)現(xiàn)IL-17A基因敲除減輕了氟誘導的肝細胞凋亡,降低了Cyt-c和Caspase3的蛋白表達水平。在外源性毒物誘導肝炎癥的研究發(fā)現(xiàn),IL-17A作為重要炎癥因子,其能夠刺激多種細胞釋放金屬蛋白酶和炎癥因子,促進炎癥細胞的募集和肝炎癥反應(yīng)[14]。最近研究發(fā)現(xiàn),IL-17A能夠通過IL-17A受體通路調(diào)節(jié)細胞自噬、線粒體損傷、凋亡等生物過程[27-28]。例如,Kim等[27]研究發(fā)現(xiàn)IL-17A通過損傷線粒體功能誘導滑膜成纖維細胞的凋亡。因此,IL-17A緩解氟誘導的肝細胞凋亡的機制可能是氟引起了肝的炎癥反應(yīng),炎癥因子的大量釋放刺激肝細胞的凋亡,同時氟作為外源性毒物能夠激活I(lǐng)L-17A受體通路誘導肝細胞凋亡。然而,IL-17A基因的敲除緩解了氟誘導的肝炎癥反應(yīng),減輕了炎癥因子刺激的凋亡,并阻斷了IL-17A受體通路誘導的肝細胞凋亡。

4 結(jié) 論

氟暴露損傷了肝的組織形態(tài),并改變了肝內(nèi)炎癥因子(TNF-α、IL-17、INF-γ、IL-23、TGF-β、IL-1β)和炎癥細胞(M2型巨噬細胞、樹突狀細胞、CD4+T細胞、自然殺傷細胞、γδT 細胞)的水平。同時,氟暴露誘導了肝細胞凋亡。然而,IL-17A基因敲除能夠緩解氟誘導的肝炎癥反應(yīng),并減輕氟誘導的肝細胞凋亡。本研究明確了IL-17A在氟誘導肝炎癥反應(yīng)和凋亡中的作用,并進一步揭示了氟肝毒性的內(nèi)在機理,為氟中毒的防治提供了理論依據(jù)。