實(shí)驗(yàn)用榮昌豬SLA-1等位基因鑒定及分子遺傳特征分析

劉弘毅,羅霆宇,李昌文,于海波,路小野,陳洪巖,夏長友,高彩霞

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所,動(dòng)物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家禽類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源庫,哈爾濱 150069)

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)是一組編碼主要組織相容性抗原的基因群總稱,最早在小鼠體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[1-2]。MHC作為組織細(xì)胞的遺傳標(biāo)記分子,與動(dòng)物的抗病性、抗原識別、遞呈和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[3-5]。此外,MHC編碼的高度多態(tài)的蛋白對器官移植成功與否具有關(guān)鍵作用[6-9]。豬MHC又稱豬白細(xì)胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA),位于豬第7號染色體并橫跨著絲點(diǎn),是包含豬基因組中許多免疫相關(guān)基因的緊密連鎖區(qū)域[10-11]。SLA基因包含高度多態(tài)的SLA I類、SLA II類和相對保守的SLA Ⅲ類基因,高度多態(tài)的SLA-1基因是經(jīng)典的SLA I類基因,目前IPD-MHC(Immuno Polymorphism Database-MHC)數(shù)據(jù)庫共收錄了89個(gè)SLA-1基因(Release 3.9.0.1 07/2022 build 209)。SLA-1基因編碼的SLA I類分子通過內(nèi)源性抗原遞呈,將胞內(nèi)的抗原肽遞呈到細(xì)胞表面,經(jīng)CD8+T細(xì)胞識別并引起細(xì)胞免疫,對于機(jī)體的健康以及對疾病的抗病性具有重要作用。SLA-1包含8個(gè)外顯子,第1外顯子編碼前導(dǎo)多肽鏈,第2～4外顯子分別編碼α1～α3胞外域,第5外顯子編碼跨膜結(jié)構(gòu)域,第6～8外顯子編碼胞內(nèi)域,其中,第2和第3外顯子編碼的α1和α2胞外域多態(tài)性最高,二者形成的抗原肽結(jié)合槽(peptide-binding groove,PBG)決定了與之結(jié)合的T淋巴細(xì)胞表位的特異性[12]。有研究利用SLA-1分子體外構(gòu)建SLA I類復(fù)合體研究與病毒T細(xì)胞表位結(jié)合的特異性,發(fā)現(xiàn)不同SLA-1分子結(jié)合T細(xì)胞表位的能力不同[13],這就提示攜帶不同SLA-1等位基因的豬對疫病的抵抗力不同。

豬是世界范圍內(nèi)廣泛培育的重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,是人們?nèi)粘Ｉ钪饕膭?dòng)物蛋白來源,而且由于豬與人類在基因組、血液生理指標(biāo)、解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和成分等方面高度相似,使其逐漸成為一種重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,應(yīng)用于臨床器官移植、動(dòng)物疾病模型構(gòu)建和病原致病機(jī)制研究等領(lǐng)域[14-17]。榮昌豬是中國西南地區(qū)的本土豬種,由于其肉質(zhì)好和抗逆性強(qiáng)成為中國主要的優(yōu)良豬種之一,目前,已在各領(lǐng)域表現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值,如用于建立人類醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型,MITF-M基因突變形成的白化耳聾榮昌豬可以作為一種人類遺傳性神經(jīng)性聽力缺陷的大型哺乳動(dòng)物模型,在人工耳蝸應(yīng)用以及研究中國耳聾遺傳方面具有十分重要的意義[18-20]。同時(shí)榮昌豬具有較強(qiáng)的抗病性,已用于建立豬病原感染模型并研究自身免疫機(jī)制,為重大疫病防控提供支撐,同時(shí)也用于篩選獨(dú)特的免疫相關(guān)分子,為抗病育種奠定基礎(chǔ)。2019年,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所從重慶市畜牧科學(xué)院生物工程研究所引入27頭榮昌豬,屏障環(huán)境飼養(yǎng)繁育,主要用于培育標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)豬種群,同時(shí)開展了疫病凈化、疾病模型構(gòu)建及應(yīng)用研究。本研究就該榮昌豬種群SLA-1基因特征進(jìn)行分析,旨在為標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)榮昌豬的培育和推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ),也為異種移植研究提供遺傳學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

表1 榮昌豬SLA-1等位基因Table 1 SLA-1 allele of Rongchang pig

1.2 主要試劑

豬外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限公司,Simply總RNA提取試劑盒購自Biosharp公司,DNA膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司,One step PCR試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和載體pMD18-T vector均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 外周血淋巴細(xì)胞的分離和RNA的提取

根據(jù)豬外周血淋巴細(xì)胞分離液說明書,將豬外周血淋巴細(xì)胞分離,-80 ℃保存。根據(jù)Simply總RNA提取試劑盒說明書提取外周血淋巴細(xì)胞總RNA,利用超微量分光光度計(jì)(NanoPhotometer,德國)測量總RNA濃度,-80 ℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中大白豬H01單倍型序列(登錄號:AJ251829),利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SLA-1基因,擴(kuò)增片段約為1 537 bp。SLA1-F:5′-CTCAGCTTCTCCCCAGACCCCGA-GGCTGAGGATC-3′,SLA1-R:5′-GGATTCTGGAAGGTTCTCAATCCTTCCATTTATTTCCTC-3′。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.5 SLA-1的擴(kuò)增和測序

利用One Step PCR試劑盒以及合成的引物對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)體系50 μL:PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL,2×1 step Buffer 25 μL,上、下游引物(10 pmol·μL-1)各1.5 μL,RNA模板2 μL(約300 ng·μL-1),RNase Free H2O 18 μL。PCR反應(yīng)條件:50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min;94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35次循環(huán);72 ℃延伸8 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,由吉林省庫美生物科技有限公司直接測序。對于雜合子,利用膠回收試劑盒純化目的片段,與pMD-18 T載體在16 ℃條件下連接2 h,然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,并利用含Amp抗性的LB平板進(jìn)行篩選。鑒定陽性單克隆菌落后,送至吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.6 序列比對及分析

測序獲得的原始序列數(shù)據(jù)通過Chromas Version 2.6.6進(jìn)行人工編輯,校對電泳峰圖與堿基對應(yīng)關(guān)系。利用MEGA 7.0軟件對直接測序和克隆測序結(jié)果進(jìn)行比對,根據(jù)不同豬個(gè)體中SLA-1基因序列差異確定等位基因序列。當(dāng)同一個(gè)體克隆測序中至少3個(gè)單克隆的序列相同且該序列在不同個(gè)體的直接或克隆測序中多次出現(xiàn),判定為一個(gè)等位基因,即一個(gè)等位基因的判定必須至少出現(xiàn)在2個(gè)不同的個(gè)體或來自2個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)。利用DnaSP 5.10.01軟件進(jìn)行等位基因多態(tài)性分析,利用DNASTAR Lasergene軟件進(jìn)行同源性分析,以人白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)頻率最高的HLA-A*02:01等位基因(GenBank登錄號:FN806801)為參照[21],利用MEGA 7.0采用鄰接法(Neighbor-Joining,N-J)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。所有序列提交GenBank獲得登錄號。將新等位基因提交國際動(dòng)物遺傳學(xué)學(xué)會(The International Society of Animal Genetics,ISAG)SLA命名委員會獲得官方命名。SLA等位基因的命名采用HLA命名系統(tǒng),等位基因前兩位數(shù)字用于指定具有相似DNA序列的等位基因組(“組”是基于系統(tǒng)發(fā)育分析和DNA序列基序的識別);第3和第4位數(shù)字用于指定具有不同蛋白質(zhì)序列的等位基因;第5和第6位數(shù)字用于指定因同義核苷酸替換而不同的等位基因;以冒號(:)作為區(qū)域分隔符。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增與克隆

RT-PCR擴(kuò)增獲得1 537 bp左右的目的條帶(圖1),清晰且單一,表明已成功擴(kuò)增SLA-1基因。將27頭豬的擴(kuò)增產(chǎn)物全部進(jìn)行直接測序,分析測序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)4頭豬測序結(jié)果為單峰(豬編號為3、9、13和27),且序列相同,表明是純合子個(gè)體,對其中1頭(3號豬)進(jìn)行了克隆。其它23頭豬均為套峰,表明為雜合子個(gè)體,將具有相同雜合套峰的個(gè)體進(jìn)行分類后,分別對10個(gè)個(gè)體(豬編號為3、5、10、15、16、17、18、19、23和24)進(jìn)行了克隆。所有克隆鑒定陽性單克隆菌落并測序(圖2)。

M. DL 2000 DNA分子標(biāo)記;1. PCR產(chǎn)物(豬編號2);2.PCR產(chǎn)物(豬編號3);3. PCR產(chǎn)物(豬編號5);4. PCR產(chǎn)物(豬編號10);5. PCR產(chǎn)物(豬編號14);6. PCR產(chǎn)物(豬編號15);7. PCR產(chǎn)物(豬編號17);8. PCR產(chǎn)物(豬編號18)M. DL 2000 DNA marker; 1. PCR product of No. 2; 2.PCR product of No. 3; 3. PCR product of No. 5; 4. PCR product of No. 10; 5. PCR product of No. 14; 6. PCR product of No. 15; 7. PCR product of No. 17; 8. PCR product of No. 18圖1 SLA-1基因部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.1 Partial amplification results of SLA-1

2.2 SLA-1等位基因序列分析

分析27頭榮昌豬SLA-1基因直接測序和克隆測序結(jié)果,根據(jù)等位基因的判定原則共鑒定出11個(gè)等位基因(表1),將其提交GenBank數(shù)據(jù)庫和IPD-MHC數(shù)據(jù)庫,分別獲得登錄號和ISAG SLA命名委員會的官方命名(表2)。與IPD-MHC數(shù)據(jù)庫中已提交的89個(gè)SLA-1等位基因序列相比較,獲得2個(gè)已知等位基因,SLA-1*11:03和SLA-1*15:03,分別存在于韓國地方豬種和中國融水小型豬、皖南花豬中。此外,發(fā)現(xiàn)9個(gè)新等位基因,命名為SLA-1*02:04、02:05、10:03、16:05、16:06、18:03、23:05、24:01和25:01。27頭榮昌豬均至少包含1個(gè)SLA-1新等位基因,且10頭榮昌豬中至少包含3個(gè)SLA-1等位基因,編號10的個(gè)體中含有4個(gè)不同的SLA-1等位基因,表明SLA-1是雙拷貝基因。在該群體中,對被鑒定出在SLA-1基因座上具有兩個(gè)以上等位基因的個(gè)體進(jìn)行等位基因之間的兩兩組合分析,對在不同基因型個(gè)體中出現(xiàn)次數(shù)超過3次以上的組合確定為同一條染色體上的雙拷貝等位基因,在編號分別為1、6、10、18、24、25的個(gè)體中不僅鑒定出SLA-1*23:05、SLA-1*11:03等位基因而且還有其他等位基因存在,因此在該群體中SLA-1*23:05與SLA-1*11:03,SLA-1*02:04與SLA-1*18:03之間存在連鎖關(guān)系。連鎖的等位基因SLA-1*23:05和SLA-1*11:03以及SLA-1*02:04和SLA-1*18:03分別用雙拷貝等位基因A和B表示,等位基因SLA-1*02:05、SLA-1*10:03、SLA-1*15:03、SLA-1*16:05、SLA-1*16:06、SLA-1*24:01、SLA-1*25:01分別用等位基因C、D、E、F、G、H、I表示,該群體在SLA-1基因座上共獲得11種基因型(表1)。群體的等位基因頻率顯示,頻率最高的是等位基因H(SLA-1*24:01),頻率為44.23%,其次是雙拷貝等位基因A(SLA-1*23:05,SLA-1*11:03)和等位基因E(SLA-1*15:03),頻率分別為19.23%、17.31%,H(SLA-1*24:01)是該榮昌豬群體中最流行的等位基因(圖3)。

表2 榮昌豬SLA-1等位基因提交信息Table 2 Submission information for SLA-1 allele in Rongchang pig

圖3 SLA-1等位基因及頻率分布Fig.3 The distribution of SLA-1alleles and frequency

2.3 SLA-1等位基因多態(tài)性與二級結(jié)構(gòu)分析

11個(gè)SLA-1等位基因編碼區(qū)(coding sequences,CDS)DNA多態(tài)性分析顯示(圖4),堿基變異(base variation,S)主要集中在225～325 bp和500～575 bp兩個(gè)區(qū)域,核苷酸多樣度(nucleotide diversity,Pi)的變化趨勢與堿基變異數(shù)的分布趨勢基本保持一致,而且兩者的峰值均處于第2和第3外顯子區(qū)域內(nèi),表示該區(qū)域是SLA-1基因的高頻變異位點(diǎn)區(qū)。在CDS區(qū)內(nèi),整體的Pi為0.044 9,單倍型多樣度(haplotype diversity,Hd)為1,平均核苷酸差異數(shù)(average number of nucleotide differences,K)為48.782,G+C含量為64.9%,在所編碼的361個(gè)氨基酸中,產(chǎn)生了75個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)(amino acid variable sites,AV);在1～1 086 bp的核苷酸位點(diǎn)中,涵蓋了127個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn),其中,包含簡約信息位點(diǎn)85個(gè),單一多態(tài)位點(diǎn)42個(gè),此外,核苷酸多態(tài)位點(diǎn)包含18個(gè)同義單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)和109個(gè)非同義單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。第2和第3外顯子區(qū)域的多態(tài)性規(guī)律與整個(gè)CDS區(qū)變異相似(表3)。

表3 SLA-1等位基因序列多態(tài)性分析Table 3 Polymorphism analysis of SLA-1 allele sequences

圖4 SLA-1等位基因堿基變異位置分布(A)和核苷酸多樣度變化趨勢(B)Fig.4 The distribution of base variation positions (A) and nucleotide diversity (B) of SLA-1 allele sequence

由于SLA提呈不同抗原,因此第2和第3外顯子編碼的α1和α2結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的PBG多態(tài)性較高,對榮昌豬SLA-1編碼蛋白的α1和α2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變異性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,有14個(gè)氨基酸位點(diǎn)的Wu-Kabat指數(shù)高于6.0,其中,第74個(gè)氨基酸指數(shù)最高,達(dá)到13.8(圖5A)。第2外顯子區(qū)域的氨基酸變異程度高于第3外顯子,且變異程度最高的位點(diǎn)位于第2外顯子區(qū)域。此外,由于SLA-1*04:01分子所編碼的蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析[22],共存在33個(gè)關(guān)鍵氨基酸組成PBG的A～F 6個(gè)口袋,因此將獲得的榮昌豬SLA-1的α1和α2結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與SLA-1*04:01進(jìn)行比對分析,結(jié)果顯示,182個(gè)氨基酸位點(diǎn)中,121個(gè)位點(diǎn)完全保守,而33個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)中,11個(gè)氨基酸位點(diǎn)完全保守,分別為Leu5(L)、Tyr7(Y)、Met45(M)、Tyr59(Y)、Leu81(L)、Tyr84(Y)、Tyr123(Y)、Lys146(K)、Tyr159(Y)、Leu160(L)、Tyr171(Y),其余22個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生高頻率突變(圖5B)。比對HLA-A*02:01、HLA-A*11:01與榮昌豬SLA-1等位基因氨基酸序列,結(jié)果顯示,在與β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2 m)結(jié)合的19個(gè)氨基酸位點(diǎn)中,有10個(gè)氨基酸在人HLA-A與榮昌豬SLA-1等位基因中保持一致,分別是Tyr7(Y)、Phe8(F)、Val25(V)、Tyr27(Y)、Phe33(F)、Phe36(F)、His93(H)、Leu110(L)、Gly112(G)和Gln115(Q)。另外,比較人和榮昌豬CD8分子與MHC結(jié)合的7個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)(223～229)[23],只有225(T/S)和228(T/M)兩個(gè)位點(diǎn)存在差異,其它位點(diǎn)高度保守(表4)。二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),榮昌豬不同SLA-1等位基因顯示出SLA-1基因的典型二級結(jié)構(gòu),α1和α2區(qū)主要為α-螺旋和β-折疊,α1區(qū)具有1個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊,α2區(qū)具有4個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊(圖5B)。

▼.人白細(xì)胞抗原(HLA)與β2-微球蛋白(β2m)結(jié)合位點(diǎn),*.SLA-1*04:01等位基因抗原肽結(jié)合槽關(guān)鍵位點(diǎn)▼. Amino acid position binding human leukocyte antigen (HLA) and β2-microglobulin (β2m), *. Key amino acid position of PBG located in SLA-1*04:01 allele圖5 榮昌豬SLA-1等位基因第2和第3外顯子區(qū)域氨基酸變異性(A)和氨基酸序列比對(B)Fig.5 The amino acid variability (A) and comparison (B) of exon 2 and exon 3 of SLA-1 alleles in Rongchang pig

表4 人和榮昌豬CD8分子與MHC結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸氨基酸位點(diǎn)比較Table 4 Comparison of key amino acid position of human and Rongchang pig CD8 molecules combine with MHC

2.4 SLA-1等位基因同源性分析

榮昌豬不同SLA-1等位基因的核苷酸相似性為93.6%～99.4%,氨基酸相似性為86.5%～98.3%,其中,SLA-1*02:04和SLA-1*02:05同源性最高,核苷酸和氨基酸相似性分別為99.4%和98.3%,二者存在7個(gè)核苷酸變異和6個(gè)氨基酸變異。榮昌豬與IPD-MHC數(shù)據(jù)庫中已提交的69個(gè)具有CDS全長序列的SLA-1等位基因相似性分析顯示,核苷酸序列和氨基酸序列分別為92.6%～99.9%和85.9%～99.4%。榮昌豬SLA-1等位基因和人群中流行的HLA-A*02:01和HLA-A*11:01等位基因的核苷酸相似性為83.3%～86.8%,氨基酸相似性為70.3%～76.9%,其中,與HLA-A*02:01相似性最高的等位基因是SLA-1*10:03(核苷酸85.0%,氨基酸74.4%),與HLA-A*11:01相似性較高的等位基因是SLA-1*18:03(核苷酸86.8%,氨基酸76.9%)(表5)。

表5 榮昌豬SLA-1和IPD-MHC數(shù)據(jù)庫中提交的SLA-1以及人HLA-A流行等位基因的相似性比較Table 5 Comparison of nucleotide and amino acid homology among SLA-1 alleles of Rongchang pig, SLA-1 alleles submitted in IPD-MHC database and frequent human HLA-A alleles %

2.5 SLA-1等位基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從IPD-MHC數(shù)據(jù)庫中選取與榮昌豬SLA-1等位基因核苷酸相似性較高(93.3%～99.9%)的31個(gè)具有CDS全長的SLA-1等位基因,與榮昌豬獲得的11個(gè)SLA-1等位基因序列比對,以人群中HLA-A頻率最高的HLA-A*02:01和HLA-A*11:01等位基因?yàn)橥馊簩φ?利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)。結(jié)果顯示,榮昌豬中9個(gè)新等位基因分布在不同聚類分支中,根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹,ISAG SLA命名委員會對其進(jìn)行了命名。SLA-1*02:04和SLA-1*02:05聚在02等位基因組分支中,SLA-1*02:05與SLA-1*02:02具有3個(gè)核苷酸差異,SLA-1*02:04與SLA-1*02:01具有4個(gè)核苷酸差異,與多種豬品種和豬細(xì)胞系親緣關(guān)系較近,如:

▲.榮昌豬SLA-1等位基因▲. SLA-1 alleles of Rongchang pig圖6 榮昌豬SLA-1等位基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of SLA-1 allele from Rongchang pig

辛克萊小型豬、NIH小型豬和小型豬腎細(xì)胞系等。SLA-1*10:03等位基因與漢福德、大花白以及融水小型豬中獲得的SLA-1*10:01等位基因聚于同一分支,與SLA-1*10:01具有5個(gè)核苷酸差異。SLA-1*16:05和SLA-1*16:06遺傳距離較近,與SLA-1*16:03聚為一支,屬于16等位基因組,特別是SLA-1*16:05與SLA-1*16:03僅有一個(gè)核苷酸差異,兩個(gè)等位基因均與亞洲野豬的親緣關(guān)系較高。SLA-1*18:03與SLA-1*18:01聚于同一分支。SLA-1*23:05獨(dú)立聚為一支,表明有特定的肽結(jié)合基序,而且與SLA-1*11:10和SLA-1*23:01聚為一大類分支,表明與巴馬小型豬親緣關(guān)系較近。SLA-1*24:01與亞洲野豬、巴馬小型豬中獲得的SLA-1*19:01聚于一大支,表明榮昌豬和其親緣關(guān)系較近。SLA-1*25:01獨(dú)立分為一支,表明也具有獨(dú)特的肽結(jié)合基序。此外,已知的SLA-1*11:03和SLA-1*15:03等位基因在韓國地方豬、中國融水小型豬和皖南花豬也存在,表明這些品種豬可能有相同血緣關(guān)系的祖先。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)豬在畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)揮重要作用,被廣泛用于研究病原致病機(jī)制、T細(xì)胞表位識別和疫苗評估等,在這些研究中SLA對抗原的識別具有嚴(yán)格的MHC限制性,從而引起個(gè)體差異[24-27]。因此鑒定SLA基因可減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳背景差異對各項(xiàng)研究結(jié)果的影響。經(jīng)典的SLA I類基因SLA-1編碼的I類分子主要參與內(nèi)源性抗原遞呈,識別抗原并誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。SLA-1基因具有高度多態(tài)性,目前IPD-MHC數(shù)據(jù)庫共收錄了89個(gè)SLA-1等位基因(Release 3.9.0.1 07/2022 build 209),存在于不同的豬品種或豬細(xì)胞系。榮昌豬是我國優(yōu)良的地方豬品種,已作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在動(dòng)物醫(yī)學(xué)模型、藥物評價(jià)模型和異種器官供體等研究中廣泛應(yīng)用,但目前尚未對榮昌豬的SLA-1基因進(jìn)行系統(tǒng)鑒定,本研究在榮昌豬SLA-1基因座上共獲得11個(gè)等位基因,其中,9個(gè)為新等位基因,2個(gè)為已知等位基因,在現(xiàn)有群體數(shù)量有限的情況下SLA-1基因座表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。

榮昌豬SLA-1基因也發(fā)現(xiàn)了雙拷貝現(xiàn)象。在之前的研究中,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SLA-1基因座雙拷貝現(xiàn)象在韓國本地豬、SNU小型豬、NIH小型豬、巴克夏豬、約克夏豬、杜洛克豬、長白豬、梅山豬和巴馬小型豬等眾多豬品種中均存在,且部分雙拷貝現(xiàn)象在某些SLA單倍型中持續(xù)存在[28-31]。一般認(rèn)為,基因多樣性或雜合度的增加有利于機(jī)體抵御不良環(huán)境,但無論是不同SLA基因座的等位基因雜合還是SLA-1基因座雙拷貝雜合,在病原體和SLA等位基因之間的關(guān)系都是較為復(fù)雜的。首先,在同一個(gè)SLA基因座存在多個(gè)等位基因可能會增加其對不同抗原的結(jié)合能力,從而提高生存概率;其次,如果在群體中不存在對特定病原敏感的特定等位基因,即便雜合度很高,該種群對于病原的抵抗力依然較弱,而存在特定等位基因的純合子群體卻能夠獲得高的抵抗力,這可以從雜合子優(yōu)勢假說以及稀有等位基因優(yōu)勢假說得到解釋[32-33]。

SLA-1基因的第2和第3外顯子所編碼的抗原肽結(jié)合槽相較于其它區(qū)域具有非常高的多態(tài)性,這種現(xiàn)象在不同豬品種中都存在[34-36]。本研究對榮昌豬SLA-1等位基因的DNA多態(tài)性進(jìn)行了分析,從核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量占比和非同義核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量的比例發(fā)現(xiàn),第2和第3外顯子區(qū)域都表現(xiàn)出絕對的優(yōu)勢。氨基酸變異位點(diǎn)數(shù)量以及氨基酸變異系數(shù)和位置與核苷酸多態(tài)性具有相似性,同樣證明SLA-1基因的高度多態(tài)區(qū)域集中于第2和第3外顯子。

SLA I類分子主要通過遞呈病原的抗原肽給CD8+T淋巴細(xì)胞識別[37],繼而誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷效應(yīng)清除感染性細(xì)胞。抗原肽是通過結(jié)合SLA I類分子PBG中的6個(gè)口袋(A～F),然后與β2 m形成復(fù)合物遞呈在細(xì)胞表面供T細(xì)胞識別[38-39]。因此不同等位基因和遞呈抗原肽的差異會對PBG的立體結(jié)構(gòu)造成影響,利用已解析的SLA-1*04:01的三維結(jié)構(gòu),對榮昌豬SLA-1等位基因6個(gè)口袋的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)有較高的差異性,提示獲得的等位基因可能展現(xiàn)出與SLA-1*04:01不同的三維結(jié)構(gòu)。

豬已被選定是最佳的異種移植供體,但豬-人異種器官/細(xì)胞移植主要障礙是人體對植入外源器官的免疫反應(yīng),其中SLA是與同種和異種免疫識別密切相關(guān)的一個(gè)重要分子標(biāo)記基因,能被各種人類免疫細(xì)胞亞群直接識別[40]。因此異種移植成功與否的前提在于豬SLA與人HLA之間的適配性所導(dǎo)致的急性或慢性免疫排斥反應(yīng)能否得到解決。比較榮昌豬SLA-1與β2 m結(jié)合以及人和榮昌豬CD8分子與MHC結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)氨基酸位點(diǎn)保守性較高。將獲得的SLA-1等位基因與人群體中頻率較高的等位基因進(jìn)行同源性分析,顯示SLA-1*10:03和SLA-1*18:03相似性最高,預(yù)示著攜帶這兩個(gè)等位基因的豬可能和人之間存在較高的適配性。

目前,IPD-MHC數(shù)據(jù)庫已收錄了世界各類豬種以及豬細(xì)胞系的SLA-1等位基因,選取與榮昌豬相似性較高的SLA-1等位基因建立了系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)榮昌豬種群中獲得的SLA-1*15:03和SLA-1*11:03也分別存在于中國融水小型豬、皖南花豬以及韓國本地豬中,這些豬種起初都源自亞洲。獲得的新SLA-1等位基因少部分與各類豬源細(xì)胞系親緣性較高,大多數(shù)均與亞洲豬種親緣性較高,因此可推測榮昌豬可能和這些豬種存在血緣相同的祖先。

本研究獲得的榮昌豬SLA-1等位基因遺傳信息僅針對于飼養(yǎng)于屏障設(shè)施中這個(gè)小型封閉群,并不能代表全國整個(gè)榮昌豬品種的群體遺傳信息,但是對標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)榮昌豬的培育和推廣應(yīng)用必不可少。此外在榮昌豬上獲得的SLA-1基因也可用于深入研究病原的抗原遞呈機(jī)制,篩選豬重要病原的SLA限制性T細(xì)胞表位,對開發(fā)安全有效的表位肽疫苗意義重大。

4 結(jié) 論

本研究通過對榮昌豬SLA-1基因CDS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序,成功獲得了11個(gè)SLA-1等位基因,其中,9個(gè)為新發(fā)現(xiàn)等位基因,SLA-1*24:01是該榮昌豬群體中最流行的等位基因。SLA-1基因多態(tài)性主要集中在第2和第3外顯子區(qū)域,PBG中的33個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)有11個(gè)位點(diǎn)完全保守;與β2 m結(jié)合的19個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)有10個(gè)位點(diǎn)在人與榮昌豬之間保持一致,CD8分子與MHC結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)高度保守,只有225(Thr/Ser)和228(Thr/Met)位點(diǎn)不同。同源性以及系統(tǒng)進(jìn)化樹表明,SLA-1*10:03和SLA-1*18:03分別與人HLA-A*02:01和HLA-A*11:01等位基因的同源性最高,榮昌豬與亞洲野豬、巴馬小型豬和融水小型豬等亞洲豬種具有較近的親緣關(guān)系。本研究結(jié)果為榮昌豬SLA遺傳背景的研究以及抗原遞呈過程中SLA與不同抗原肽的相互作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)。