基于生物網(wǎng)絡(luò)功能模塊整合組方規(guī)律分析四黃止痢顆粒治療仔豬腹瀉的作用機(jī)制

周煒煒,王雪峰,張夢(mèng)潔,楊 娟,孫悅龍,張祖烽,張宇欣,豆佳紅,王梓穎,戴小楓*,李秀梅*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,哈爾濱 150076;3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457)

仔豬腹瀉作為養(yǎng)殖業(yè)中常見的仔豬疾病之一,病因復(fù)雜多樣,主要包括傳染性因素(病毒、細(xì)菌、寄生蟲等)及非傳染性因素(仔豬自身免疫不足、斷奶應(yīng)激、飼養(yǎng)環(huán)境等)[1]。它可引起仔豬食欲下降、生產(chǎn)性能下降,甚至導(dǎo)致較高病死率。目前常采用抗生素等藥物治療方法,雖成本低、見效快,但易產(chǎn)生較高耐藥性,且復(fù)發(fā)率高。中獸醫(yī)理論認(rèn)為,仔豬腹瀉是因體虛、正氣不足及濕熱等外邪侵入體內(nèi)所致。為達(dá)到“標(biāo)本兼治、扶正祛邪”的目的,部分中藥復(fù)方已被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療仔豬腹瀉[2-5]。其中,四黃止痢顆粒因治療雞、豬的濕熱瀉痢效果顯著而逐漸受到關(guān)注。

四黃止痢顆粒是由黃連、黃柏、大黃、黃芩、板藍(lán)根、甘草6味中藥組成的中藥成方制劑,收錄于2020年版《中華人民共和國(guó)獸藥典》[6]。四黃止痢顆粒具有清熱瀉火、止痢的功效,臨床上多用于治療濕熱引起的雞、豬瀉痢以及細(xì)菌、病毒引起的熱性疾病[7-8]。雖療效顯著,但其藥味組成較多、配伍關(guān)系復(fù)雜,其相關(guān)功效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚未闡明,且多數(shù)研究?jī)H限于單一成分、單一靶點(diǎn),缺少?gòu)南到y(tǒng)網(wǎng)絡(luò)水平來(lái)探索其配伍關(guān)系及作用機(jī)制方面的內(nèi)容,限制了其臨床應(yīng)用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種以藥物與疾病的相互作用為基礎(chǔ),通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析闡明中藥復(fù)方作用機(jī)制的新方法[9]。生物網(wǎng)絡(luò)功能模塊的識(shí)別和特征分析可在一定程度上簡(jiǎn)化網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),揭示其關(guān)鍵環(huán)節(jié)和核心機(jī)制[10]。MCODE(molecular complex detection)作為一種非交疊式聚類算法,最初用于檢測(cè)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)復(fù)合物,目前主要用于檢測(cè)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中緊密連接的區(qū)域,即功能模塊的識(shí)別[11]。因此,本研究嘗試在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)上,參考“模塊藥理學(xué)”的研究思路[12-13],使用MCODE聚類算法對(duì)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分解和解構(gòu),篩選獲得藥物特異性高、疾病針對(duì)性強(qiáng)的網(wǎng)絡(luò)(功能模塊),再對(duì)其進(jìn)行通路富集與比較分析以及歸經(jīng)分析,從而全面揭示中藥方劑的功效物質(zhì)和作用機(jī)理。

本研究依據(jù)中獸醫(yī)理論,嘗試從“中藥靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)-生物通路-功能模塊”多個(gè)層次進(jìn)行關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析,多維度揭示四黃止痢顆粒的作用機(jī)制,闡釋其君臣佐使配伍規(guī)律,明確各單味藥在復(fù)方發(fā)揮整體藥效過(guò)程中的貢獻(xiàn),從而為新中獸藥復(fù)方的發(fā)現(xiàn)以及應(yīng)用提供參考[14]。

1 材料與方法

1.1 四黃止痢顆粒的組方理論

方中黃連藥性苦、寒,歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng),善于清中焦脾胃的濕熱,為君藥。黃柏歸腎、膀胱經(jīng),善于清下焦?jié)駸?黃芩歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng),善于清上焦?jié)駸?。黃柏、黃芩藥性苦、寒,二者配合可清上下焦?jié)駸?為臣藥,與黃連配伍加強(qiáng)清熱燥濕,瀉火解毒之效。大黃藥性苦寒,善于瀉下胃腸濕熱;板藍(lán)根有清熱涼血的功效。大黃、板藍(lán)根二者均能瀉熱,共為佐藥。方中甘草調(diào)和諸藥、緩急和中,為使藥。諸藥合用,共奏清熱燥濕,涼血止痢之功。

1.2 四黃止痢顆粒活性成分的收集及藥物靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

通過(guò)檢索TCMSP(https://tcmsp-e.com/)、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)、HERB(http://herb.ac.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)收集四黃止痢顆粒(黃柏、黃芩、黃連、大黃、板藍(lán)根、甘草)的成分,利用口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%及類藥性(drug-like index, DL)≥0.18作為篩選條件獲得四黃止痢顆粒的潛在活性成分,同時(shí)篩選每個(gè)活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.3 仔豬腹瀉疾病相關(guān)基因與藥物相關(guān)基因的差異分析

以“piglet diarrhea”為關(guān)鍵詞分別檢索GeneCards、NCBI、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲取豬腹瀉的相關(guān)靶點(diǎn)基因,去冗余后得到仔豬腹瀉的潛在疾病靶點(diǎn)。使用Venny 2.1軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取四黃止痢顆粒的藥物靶點(diǎn)和豬腹瀉相關(guān)疾病靶點(diǎn)的交集,比較四黃止痢顆粒中6味中藥的藥物相關(guān)基因與仔豬腹瀉疾病相關(guān)基因間的異同,分析二者的重疊基因和差異基因。

1.4 靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network, PPI)的構(gòu)建及功能模塊的識(shí)別

將上述重疊基因?qū)險(xiǎn)niProt(https://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得物種為“PIG”的標(biāo)準(zhǔn)蛋白名,上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖,設(shè)置物種為“Susscrofa”,置信度≥0.04;運(yùn)用Cytoscape 3.5.1軟件構(gòu)建四黃止痢顆粒的藥物靶點(diǎn)-仔豬腹瀉靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 模塊的功能富集分析

應(yīng)用MCODE插件對(duì)上述PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能模塊識(shí)別。MCODE聚類算法主要通過(guò)頂點(diǎn)加權(quán)的方式生成聚類,包括3個(gè)步驟:1)基于局部網(wǎng)絡(luò)密度的節(jié)點(diǎn)賦權(quán)重;2)模塊預(yù)測(cè);3)后期處理操作。應(yīng)用David數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析,探討四黃止痢顆粒治療仔豬腹瀉的關(guān)鍵靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路。

2 結(jié) 果

2.1 四黃止痢顆粒中活性成分的檢索及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

由表1可知,通過(guò)檢索TCMSP、TCMID、HERB數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得活性成分180個(gè)。其中黃連活性成分10個(gè)(生物堿類8個(gè)、黃酮類1個(gè)、苷類1個(gè)),黃柏活性成分21個(gè)(生物堿類12個(gè)、黃酮類1個(gè),苷類2個(gè)、其它6個(gè)),黃芩活性成分30個(gè)(生物堿類2個(gè)、黃酮類21個(gè)、苷類1個(gè)、其它6個(gè)),大黃活性成分9個(gè)(蒽醌類2個(gè)、黃酮類1個(gè)、苷類3個(gè)、其它3個(gè)),板藍(lán)根活性成分27個(gè)(生物堿類2個(gè)、酮類4個(gè)、其它21個(gè)),甘草活性成分83個(gè)(黃酮類51個(gè)、其它32個(gè))。由圖1可知,除佐藥含有蒽醌類代表性成分外,君、臣、佐藥均含有生物堿、黃酮及苷類成分。通過(guò)檢索GeneCards、NCBI以及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲得四黃止痢顆粒的藥物靶點(diǎn)共88個(gè)。

圖1 君臣佐使藥的主要活性成分Fig.1 Main active ingredients of traditional Chinese medicine named monarch, minister, assistant and guide medicines

表1 四黃止痢顆粒的主要活性成分Table 1 Main active ingredients of Sihuang Zhili granules

2.2 仔豬腹瀉疾病相關(guān)基因與藥物相關(guān)基因的差異分析

由表2及圖2可知,利用GeneCards、NCBI、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲取豬腹瀉相關(guān)靶點(diǎn)并去重后得到470個(gè),與四黃止痢顆粒藥物靶點(diǎn)求交集得到35個(gè)。其中,君藥、臣藥、使藥均能調(diào)控BCL2L1、CASP3、CAV1等28個(gè)靶點(diǎn);佐藥調(diào)控EDN1、HP、NR3C1及UCP2等17個(gè)靶點(diǎn)。另外,臣藥還能調(diào)控靶點(diǎn)CYCS、NR3C1;使藥能調(diào)控靶點(diǎn)HMGCR及SLPI。

圖2 四黃止痢顆粒與仔豬腹瀉交集靶點(diǎn)的Venny圖Fig.2 Venny diagram of the intersection targets between Sihuang Zhili granules and piglet diarrhea

表2 四黃止痢顆粒的關(guān)鍵靶點(diǎn)Table 2 Key targets of Sihuang Zhili granules

2.3 靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及功能模塊的識(shí)別

由圖3可知,靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)包含33個(gè)節(jié)點(diǎn)、175條邊。MCODE 算法是根據(jù)復(fù)合物中每個(gè)蛋白的平均連接數(shù)量(即 MCODE 評(píng)分,MCODE 評(píng)分=密度×節(jié)點(diǎn)數(shù))對(duì)模塊進(jìn)行排序。MCODE算法在該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)圖中共識(shí)別1個(gè)模塊(節(jié)點(diǎn)數(shù)>3),包含17個(gè)節(jié)點(diǎn)(CASP3、EDN1、IL1B、IL1A、SERPINE1、CRP、NOS2、NOS3、SELE、BCL2L1、IFNG、TNF、NFKBIA、FOS、HMOX1、IL10、IL6)和103條邊,評(píng)分12.875。

圓形代表關(guān)鍵靶點(diǎn)(紅色代表模塊1的靶點(diǎn)),灰色線條代表相互作用關(guān)系The circle represents the key target (red represents the target of module 1), and the gray line represents the interaction relationship圖3 四黃止痢顆粒治療豬腹瀉的PPI網(wǎng)絡(luò)圖及其功能模塊Fig.3 The PPI network and functional module of Sihuang Zhili granules for treatment of piglet diarrhea

比較君、臣、佐、使藥作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)和模塊1包含的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn),除EDNI外,模塊1中16個(gè)蛋白與君、臣藥作用的靶點(diǎn)存在交集,占比94%(16/17);7個(gè)蛋白與佐藥作用的靶點(diǎn)存在交集,占比41%(7/17)。可見,君、臣、使藥作用的靶點(diǎn)基本包含模塊1的整個(gè)模塊,進(jìn)一步確定模塊1屬于整個(gè)復(fù)方的功能模塊,即發(fā)揮功效的關(guān)鍵靶點(diǎn)的集合。

2.4 功能富集分析及比較

由圖4可知,四黃止痢顆粒中君藥的作用靶點(diǎn)主要涉及IL-17、TNF、Inflammatory bowel disease等26個(gè)信號(hào)通路;臣藥主要涉及IL-17、Salmonella infection、TNF等26個(gè)信號(hào)通路;佐藥主要涉及IL-17、Estrogen、HIF-1等13個(gè)信號(hào)通路,使藥主要涉及IL-17、TNF、Inflammatory bowel disease等26個(gè)信號(hào)通路;模塊1主要涉及TNF、IL-17、HIF-1、NF-κB等17個(gè)信號(hào)通路。整個(gè)復(fù)方中君、臣、使藥作用的主要信號(hào)通路基本一致;相較于君、臣、使藥,佐藥作用的通路數(shù)量減少,但均包含于它們作用的26個(gè)信號(hào)通路中;模塊1作用的通路數(shù)量較佐藥多,同樣包含于它們作用的26個(gè)信號(hào)通路中。

2.5 四黃止痢顆粒歸經(jīng)分析

由圖5可知,君藥黃連歸脾、胃、大腸、心、膽、肝經(jīng);臣藥黃芩歸脾、大腸、膽、肺、小腸經(jīng),黃柏歸腎、膀胱經(jīng);佐藥大黃歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng),板藍(lán)根歸胃、心經(jīng);使藥甘草歸脾、胃、心、肺經(jīng)。整個(gè)復(fù)方覆蓋了動(dòng)物機(jī)體的11個(gè)臟腑經(jīng)絡(luò),且主要?dú)w脾、胃經(jīng),其次是大腸、心、肝、膽、肺、小腸、腎、膀胱和心包經(jīng)。

藍(lán)色橢圓形代表臟腑經(jīng)絡(luò),橙色長(zhǎng)方形代表藥物,線條代表藥物對(duì)臟腑經(jīng)絡(luò)有調(diào)控作用(黃色線條代表君藥對(duì)脾、胃、大腸、心、膽、肝經(jīng)存在調(diào)控作用)The blue oval represents collateral channel of internal organ, the orange rectangle represents medicine, and the line represents the regulatory effect of medicine on collateral channel of internal organ (The yellow line represents the regulatory effect of monarch medicine on the spleen, stomach, large intestine, heart, gall bladder and liver meridians)圖5 四黃止痢顆粒的歸經(jīng)分析Fig.5 The analysis of channel tropism of Sihuang Zhili granules

3 討 論

3.1 四黃止痢顆粒的主要功效物質(zhì)基礎(chǔ)

《素問(wèn)·至真要大論》:“主病之謂君,佐君之謂臣,應(yīng)臣之謂使”。組成方劑的藥物可按其在方劑中所起的作用分為君、臣、佐、使藥。君指方劑中針對(duì)主證起主要治療作用的藥物;臣指輔助君藥治療主證,或主要治療兼證的藥物;佐指配合君臣藥治療兼證,或抑制君臣藥的毒性,或起反佐作用的藥物;使指引導(dǎo)諸藥直達(dá)病變部位,或調(diào)和諸藥的藥物。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選發(fā)現(xiàn),黃連、黃柏、板藍(lán)根的功效物質(zhì)為生物堿及苷類成分,黃芩、甘草的功效物質(zhì)為黃酮及苷類成分,大黃的功效物質(zhì)為蒽醌及苷類成分;比較分析四黃止痢顆粒中君(黃連)、臣(黃柏、黃芩)、佐(大黃、板藍(lán)根)、使(甘草)藥的成分后發(fā)現(xiàn),除佐藥含有蒽醌類代表性成分外,君、臣、佐藥均含有生物堿、黃酮、苷類成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),黃連主要含有生物堿類成分,可減弱特異性免疫功能,同時(shí)具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用。黃連總生物堿中小檗堿含量最高,達(dá)10%,其次是巴馬汀、黃連堿、小檗紅堿等,均具有顯著的藥理活性[15]。其中小檗堿可通過(guò)抑制細(xì)菌內(nèi)毒素、細(xì)菌表面蛋白排序酶活性[16]以及逆轉(zhuǎn)大腸桿菌相關(guān)毒素的分泌[17]、調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)[18]、改善腸屏障功能治療各種細(xì)菌相關(guān)性腹瀉[19]。黃連堿、巴馬汀可抑制大腸桿菌、腸炎沙門菌、金黃色葡萄球菌等的活性[20],且黃連堿具有保護(hù)胃黏膜的作用[21]。小檗紅堿作為小檗堿的主要代謝物之一,其抗炎、抗真菌效果顯著[22-23]。黃柏主要含有生物堿、黃酮類成分,其中小檗堿不僅含量高達(dá)6%,且抗炎效果顯著[24-26]。黃芩的主要成分為黃酮及其苷類成分,達(dá)130余種,具有顯著的抗菌、抗病毒、抗炎及增強(qiáng)免疫功能的作用。其中黃芩苷、黃芩素可通過(guò)直接調(diào)節(jié)線粒體的凋亡途徑,加速活化B、T細(xì)胞的凋亡發(fā)揮抗炎作用[27-28]。大黃的主要活性成分是蒽醌類,含量達(dá)3%～5%,共分離得到34種,其中蘆薈大黃素、大黃素可通過(guò)抑制MAPK、核轉(zhuǎn)錄因子-κB和胞內(nèi)磷脂酰肌醇-3激酶途徑抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中炎癥因子的產(chǎn)生,從而發(fā)揮抗炎作用;大黃酸可通過(guò)影響Toll樣受體5 (TLR5)/NF-κB信號(hào)通路, 減少炎癥因子的分泌和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn), 從而緩解小鼠潰瘍性結(jié)腸炎[29-30]。板藍(lán)根作為預(yù)防和治療流感病毒的代表藥,已有200余種化學(xué)成分被分離和鑒定,其中生物堿類成分具有抗炎、抗病毒、解熱等藥理作用;黃酮類成分具有較強(qiáng)的抗病毒作用[31-32]。甘草作為臨床常用配伍藥材,共分離得到300余種黃酮類化合物。甘草總黃酮可通過(guò)抑制ERK/MAPK、NF-κB通路及活化PPAR-γ通路,抑制炎癥因子的表達(dá)從而發(fā)揮抗炎效果,其中有14種黃酮化合物能清除羥自由基、超氧陰離子自由基、過(guò)氧化氫、單線態(tài)氧以達(dá)到抗氧化的目的[33]。

綜合以往的研究發(fā)現(xiàn),6味藥中生物堿、黃酮、蒽醌、苷類成分不僅含量豐富,且具有顯著的藥理活性。本研究表明,四黃止痢顆粒復(fù)方的主要功效物質(zhì)并非單一的某個(gè)或某類成分,復(fù)方藥效是多類成分共同作用的結(jié)果,這與本研究中網(wǎng)絡(luò)篩選的結(jié)果一致。依據(jù)四黃止痢顆粒的組方理論進(jìn)一步推測(cè),各單味藥之間可能通過(guò)共有成分相互聯(lián)系、相互配合以發(fā)揮復(fù)方的整體藥效。黃連作為復(fù)方君藥,主要通過(guò)生物堿類成分對(duì)仔豬腹瀉產(chǎn)生治療作用;臣藥中生物堿類成分可能輔助君藥以增強(qiáng)胃腸道的調(diào)控功能及抗菌、抗炎作用;佐藥中蒽醌、苷類成分均有較好的抗炎活性,可進(jìn)一步配合君臣藥發(fā)揮治療作用;使藥甘草的活性成分最多,藥理作用廣泛,可調(diào)和諸藥藥性。此推測(cè)在一定程度上符合復(fù)方的組方規(guī)則,且本研究也嘗試從物質(zhì)基礎(chǔ)層面闡釋四黃止痢顆粒中君臣佐使的配伍規(guī)律以及明確各單味藥在復(fù)方發(fā)揮整體抗腹瀉作用過(guò)程中的貢獻(xiàn),但后續(xù)仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 四黃止痢顆粒的作用靶點(diǎn)及功能模塊

蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果發(fā)現(xiàn),四黃止痢顆粒主要通過(guò)作用于35個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白治療仔豬腹瀉,黃連作用于其中28個(gè)靶點(diǎn),占比80%(28/35);黃柏、黃芩不僅作用于黃連調(diào)控的所有靶點(diǎn),還能調(diào)控靶點(diǎn)CYCS、NR3C1,甘草還能調(diào)控HMGCR、SLPI;大黃、板藍(lán)根調(diào)控EDN1、HP、NR3C1等17個(gè)靶點(diǎn),其中13個(gè)靶點(diǎn)與黃連的靶點(diǎn)重合。結(jié)果表明,黃連調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn)與其它藥均存在較高的重合率,是四黃止痢復(fù)方中發(fā)揮主要治療作用的藥物,為君藥;其它藥物能夠輔助或配合黃連發(fā)揮藥效,符合中藥復(fù)方的組方規(guī)則。在此基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步識(shí)別并確定模塊1為整個(gè)復(fù)方的功能模塊。除EDNI外,其包含的16個(gè)蛋白與君藥調(diào)控的靶點(diǎn)存在交集。CASP3,又稱胱天蛋白酶3,屬于細(xì)胞凋亡信號(hào)分子。有研究發(fā)現(xiàn)木犀草素、川芎嗪等中藥成分能通過(guò)調(diào)控CASP3介導(dǎo)的外源性死亡受體和內(nèi)源性線粒體凋亡途徑抑制病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[34-36]。EDN1基因編碼的蛋白為內(nèi)皮素-1,是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的多功能肽類激素。有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs與其結(jié)合后可參與奶牛乳脂代謝的調(diào)控[37]。IL-1是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子,局部低濃度的IL-1主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。IL1A、IL1B是其兩種不同的形式,二者結(jié)合相同的受體復(fù)合物,具有相似的生物學(xué)活性。IL1A主要參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫反應(yīng)[38]。IL1B可通過(guò)抑制鈉-鉀-ATP酶的活性,抑制水、鈉的吸收,促進(jìn)腹瀉及腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂的發(fā)生[39]。SERPINE1是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑,可介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的降解,促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[40-41]。NOS屬于一氧化氮合酶,參與產(chǎn)生信號(hào)分子NO。NOS2為鈣非依賴型,在腸道炎癥的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)和破壞的雙重作用[42]。NOS3屬于內(nèi)皮型一氧化氮合酶,是內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的關(guān)鍵酶,有研究發(fā)現(xiàn)黃連素可上調(diào)一氧化氮合酶的基因和蛋白表達(dá)[43]。SELE是在免疫黏附中起作用的細(xì)胞表面糖蛋白,可參與機(jī)體腸胃炎性反應(yīng)[44]。BCL2L1屬于細(xì)胞死亡的有效抑制劑,可減輕炎癥損害,抑制IL1B的釋放,參與機(jī)體多種炎性反應(yīng)[45]。IFNG是由T細(xì)胞和NK細(xì)胞等產(chǎn)生的II型干擾素,通過(guò)激活效應(yīng)免疫細(xì)胞和增強(qiáng)抗原呈遞,在抗菌、抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[46]。TNF是在急性炎癥期間由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種炎癥細(xì)胞因子[47]。IL-10是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎細(xì)胞因子[48]。IL-6是在免疫、組織再生和代謝中具有多種生物學(xué)功能的促炎細(xì)胞因子[49]。NFKBIA是調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進(jìn)出細(xì)胞核的抑制劑[50]。FOS在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖和分化中具有重要作用[51]。HMOX1是一種血紅素加氧酶,能催化血紅素分解代謝,促使血紅素分解為膽綠素、亞鐵離子和一氧化碳[52]。以往的研究結(jié)果表明模塊1包含的靶點(diǎn)蛋白主要參與調(diào)控機(jī)體的炎癥、免疫調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激等過(guò)程。因此,本研究通過(guò)富集分析模塊1的功能和通路有利于進(jìn)一步探討四黃止痢顆粒治療仔豬腹瀉的作用機(jī)制。

3.3 四黃止痢顆粒治療仔豬腹瀉的信號(hào)通路

比較君、臣、佐、使藥及模塊1的KEGG通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),君、臣、使藥能作用于相同的26條信號(hào)通路,佐藥、模塊1作用的信號(hào)通路均包含其中,進(jìn)一步表明臣、佐、使藥能輔助、配合君藥發(fā)揮治療作用,同時(shí)證明模塊1是中藥復(fù)方四黃止痢的功能模塊。模塊1主要涉及的通路包括TNF、IL-17、NF-κB等17個(gè)炎癥相關(guān)信號(hào)通路。TNF-α是免疫的中間調(diào)節(jié)因子[53],通過(guò)刺激NF-κB p65的磷酸化使其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,同時(shí)激活多種靶基因[54],形成促炎反應(yīng)的積極循環(huán)[55]。NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)是一種關(guān)鍵的促炎途徑[56]。富集分析結(jié)果表明,四黃止痢顆粒主要通過(guò)作用于炎癥相關(guān)信號(hào)通路以達(dá)到治療仔豬腹瀉的目的。

3.4 四黃止痢顆粒的歸經(jīng)分析

歸經(jīng),即藥物作用的定位。歸經(jīng)分析是指把藥物作用與動(dòng)物機(jī)體的臟腑經(jīng)絡(luò)密切聯(lián)系起來(lái),以說(shuō)明藥物作用對(duì)機(jī)體某部分的選擇性[57]。本研究通過(guò)對(duì)各單味藥進(jìn)行歸經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),復(fù)方四黃止痢顆粒能作用于動(dòng)物機(jī)體11個(gè)臟腑經(jīng)絡(luò),且主要?dú)w脾、胃經(jīng),其次是大腸、心等,表明四黃止痢顆粒趨向于選擇調(diào)節(jié)脾、胃為主的多個(gè)臟腑經(jīng)絡(luò)以發(fā)揮止瀉作用,從而為該復(fù)方的應(yīng)用提供理論參考。

本研究通過(guò)綜合分析四黃止痢顆粒的主要功效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用靶點(diǎn)及功能模塊、信號(hào)通路、歸經(jīng),再次驗(yàn)證了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑以及多個(gè)作用部位的藥理作用特點(diǎn)。此外,通過(guò)查閱《中華人民共和國(guó)獸藥典》發(fā)現(xiàn),四黃止痢顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不完善,定性鑒別部分僅考慮君藥黃連(鹽酸小檗堿)、臣藥黃芩(黃芩苷)、佐藥大黃的薄層色譜鑒別,含量測(cè)定部分僅考慮黃芩苷的含量(每1 g四黃止痢顆粒含黃芩以黃芩苷計(jì),不得少于4.8 mg)[58]?？梢?四黃止痢顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍缺少臣藥黃柏、佐藥板藍(lán)根、使藥甘草的定性鑒別以及其他有效成分的含量鑒定。本研究通過(guò)開展中藥靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)-生物通路-功能模塊多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析不僅揭示了四黃止痢顆粒治療仔豬腹瀉的關(guān)鍵作用機(jī)制,其篩選得到的生物堿、黃酮、蒽醌、苷類成分可作為反映中獸藥復(fù)方四黃止痢顆粒的潛在質(zhì)量標(biāo)志物(quality marker, Q-markers)[59],為進(jìn)一步提高和完善四黃止痢顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

4.1生物堿、黃酮、蒽醌、苷類成分是四黃止痢顆粒復(fù)方的主要物質(zhì)基礎(chǔ),具有抗菌、抗炎、抗氧化等作用。方中君臣佐使藥的主要活性成分種類各異,可能通過(guò)共有成分相互聯(lián)系、相互配合以發(fā)揮四黃止痢顆粒復(fù)方的整體藥效。

4.2四黃止痢顆粒主要通過(guò)作用于功能模塊1調(diào)控TNF、IL-17、NF-κB等信號(hào)通路,調(diào)節(jié)脾、胃等臟腑經(jīng)絡(luò),進(jìn)而發(fā)揮治療仔豬腹瀉的作用。