基于全基因組重測(cè)序?qū)x汾白豬單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)鑒定和篩選

路 暢,董 磊,2,張萬鋒,高鵬飛,郭曉紅,蔡春波,曹果清,李步高*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,太谷 030801;2.山西省長治市潞城區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心,長治 047500)

中國地方豬種肉品質(zhì)好、抗逆性強(qiáng),但生長速度慢、飼養(yǎng)周期長使得其難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；蜕虡I(yè)化飼養(yǎng),因此,通過利用地方品種對(duì)國外豬種進(jìn)行改良,快速開展新品種培育工作和評(píng)價(jià),對(duì)豬種性能改進(jìn)和提高、充分利用雜種優(yōu)勢(shì)和豐富現(xiàn)有種質(zhì)資源具有重要意義。近年來,動(dòng)物育種(尤其是品種改良)已經(jīng)從群體水平進(jìn)入了分子水平,主要通過利用測(cè)序技術(shù)在基因組水平獲取更為準(zhǔn)確的遺傳信息,包括基因圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀定位、標(biāo)記輔助選擇以及基因組選擇等,為動(dòng)物重要經(jīng)濟(jì)性狀研究、起源進(jìn)化以及疾病發(fā)生機(jī)制解析提供新的手段[1-2]。

隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,以二代測(cè)序技術(shù)為主的高通量全基因組重測(cè)序技術(shù)推動(dòng)了動(dòng)植物單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)的挖掘與注釋工作[3-4]。全基因組重測(cè)序技術(shù)將基因組測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)分析,能夠獲得包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)等大量的遺傳變異信息,為發(fā)掘畜禽種質(zhì)特性、篩選影響畜禽生產(chǎn)性能的關(guān)鍵通路以及主效基因提供良好的平臺(tái)[5]。SNPs作為基因組中最常見的遺傳變異,被廣泛應(yīng)用于重要經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)鍵基因挖掘、種質(zhì)鑒定、分子育種等方面[6-7]。在影響重要經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)鍵基因挖掘方面,Li等[3]對(duì)太湖豬、長白豬、杜洛克豬、滇南小耳豬和藏豬進(jìn)行全基因組測(cè)序,共獲得了132 078個(gè)太湖豬特異性的SNPs位點(diǎn),并發(fā)現(xiàn)BMPR1B內(nèi)含子上的雌激素應(yīng)答元件ERE通過順式調(diào)控作用影響豬的繁殖力;Wang等[8]將25頭香豬基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)與藏豬、梅山豬、杜洛克和約克夏的數(shù)據(jù)比較,篩選了3 985 444個(gè)特異性SNPs位點(diǎn),鑒定了NR6A1和LTBP2基因的錯(cuò)義突變可能與香豬脊椎骨數(shù)量較少有關(guān)。在種質(zhì)鑒定方面,岳陽等[9]對(duì)7個(gè)太湖流域品種與5個(gè)西方引進(jìn)豬種進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序,鑒定并驗(yàn)證了小梅山豬中5個(gè)高等位基因突變率的SNPs位點(diǎn),為小梅山豬種質(zhì)鑒定提供了科學(xué)依據(jù);劉刁等[10]鑒定了深縣豬21 602 538個(gè)特異性SNPs位點(diǎn)和580個(gè)受選擇位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)其主要參與激素合成、卵細(xì)胞成熟、脂質(zhì)代謝以及免疫等信號(hào)通路,為深縣豬遺傳特性研究提供參考。在分子育種方面,張昌政等[11]利用GWAS和Fst篩選了與體尺性狀和乳頭數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNPs(32和90個(gè)),以及與體長、胸圍、管圍和總?cè)轭^數(shù)性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)(4個(gè)),為蘇山豬初生體尺與乳頭數(shù)性狀遺傳改良提供了重要的分子標(biāo)記。

晉汾白豬是由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)主持培育而成的瘦肉型豬品種,2014年通過國家畜禽遺傳資源委員會(huì)審定[12]。晉汾白豬將馬身豬的抗逆基因、太湖豬(二花臉)的高繁殖特性、長白豬和大白豬的生長速度和瘦肉基因匯聚一身,具有肉質(zhì)好、產(chǎn)仔多、生長速度快、胴體品質(zhì)好、腸道微生物種類豐富、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)[13-14]。晉汾白豬作為培育品種,在長期選育過程中產(chǎn)生了大量的變異位點(diǎn),如何有效發(fā)掘和利用變異位點(diǎn)進(jìn)行種質(zhì)特性研究尤為重要。故本研究采用全基因組重測(cè)序技術(shù)對(duì)30頭晉汾白豬和18頭馬身豬進(jìn)行基因組測(cè)序,并整合晉汾白豬親本重測(cè)序數(shù)據(jù),鑒定晉汾白豬特異性SNPs并進(jìn)行特征功能分析,為晉汾白豬種質(zhì)特性發(fā)掘、利用和評(píng)價(jià)工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

晉汾白豬和馬身豬飼養(yǎng)于大同市種豬場(chǎng),采集晉汾白豬種豬30頭(9公、21母)、馬身豬18頭(11公、7母),剪取面積為1 cm2的耳組織3塊,放入1.5 mL離心管內(nèi)液氮保存。長白豬、大白豬和太湖豬(二花臉)基因組數(shù)據(jù)從NCBI SRA數(shù)據(jù)庫下載獲得(表1)。

表1 長白豬、大白豬和太湖豬(二花臉)基因組數(shù)據(jù)Table 1 The genome data set of Landrace, Large White and Taihu (Erhualian) pigs

1.2 數(shù)據(jù)分析軟件與儀器設(shè)備

本研究中用到的數(shù)據(jù)分析軟件主要包括:minimap2、SAMTOOLS、GATK和DAVID生物信息學(xué)網(wǎng)站。用到的主要儀器設(shè)備包括:移液器(Eppendorf,德國)、PCR儀(Eppendorf,德國)、高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf,德國)、電泳儀(六一儀器廠,北京)、水平電泳槽(六一儀器廠,北京)、凝膠成像系統(tǒng)(六一儀器廠,北京)和高壓滅菌鍋(Sanyo,日本)。

1.3 耳組織DNA提取

取耳組織剪碎置于1.5 mL離心管,加入組織抽提液、蛋白酶K、SDS消化過夜,加入酚-氯仿-異戊醇、無水乙醇進(jìn)行基因組DNA的提取,后用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和完整性,將合格樣品放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 全基因組重測(cè)序及比對(duì)

1.4.1 DNA文庫的構(gòu)建與測(cè)序 經(jīng)檢驗(yàn)合格的DNA用于文庫構(gòu)建和測(cè)序,均由康普森公司完成。主要包括Covaris破碎機(jī)將DNA隨機(jī)打碎為350 bp的片段,后經(jīng)末端修復(fù)、加多聚A尾巴、加測(cè)序接頭、片段純化、PCR擴(kuò)增等步驟。質(zhì)檢合格后經(jīng)Illumina HiSeq對(duì)48個(gè)樣品的DNA片段進(jìn)行雙末端測(cè)序,獲得的原始reads以fastq格式保存。

1.4.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控及過濾 將測(cè)序獲得的讀段用fastqc軟件進(jìn)行堿基質(zhì)量和GC含量分析,使用Trimmomatic軟件去除接頭序列、過濾含N堿基數(shù)目大于20%的reads、去除低質(zhì)量堿基以及reads,獲得Clean reads。

1.4.3 序列比對(duì)參考基因組 使用minimap2軟件(參數(shù):-t 10-K 1G-a-x sr-cs)將Clean reads比對(duì)到豬的參考基因組(版本:Sscrofa11.1),并對(duì)比對(duì)率、測(cè)序深度和覆蓋度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 SNPs位點(diǎn)的檢測(cè)與注釋

將每個(gè)樣品比對(duì)后產(chǎn)生的SAM文件使用SAMTOOLS進(jìn)行排序并去重復(fù),用GATK軟件(v4.0.2)檢測(cè)變異位點(diǎn)并保存為VCF文件格式,使用VariantRecaliration對(duì)每個(gè)豬種進(jìn)行位點(diǎn)重比對(duì),后用VariantFilteration對(duì)SNPs位點(diǎn)過濾,得到每個(gè)品種SNPs變異位點(diǎn)集合。最后使用VEP軟件對(duì)其進(jìn)行注釋,統(tǒng)計(jì)SNPs的分類和在染色體上的分布。

1.6 特異SNPs位點(diǎn)的篩選

通過對(duì)晉汾白豬、大白豬、馬身豬、長白豬和太湖豬(二花臉)的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行比較分析篩選晉汾白豬特異SNPs。特異性SNPs位點(diǎn)應(yīng)滿足以下篩選條件:1)等位基因頻率(AF)大于0.1;2)僅在晉汾白豬群體中出現(xiàn)的SNPs。提取VEP軟件的注釋信息,統(tǒng)計(jì)在染色體上的分布和分類,將變異位點(diǎn)所在基因利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG富集分析,篩選特異SNPs中分類為錯(cuò)義突變SNPs位點(diǎn)所影響的生物學(xué)過程和信號(hào)通路。

2 結(jié) 果

2.1 基因組樣品檢測(cè)及測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

本研究對(duì)30頭晉汾白豬耳組織進(jìn)行基因組DNA提取。電泳檢測(cè) DNA樣品條帶單一,且OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm在1.88～2.10之間,說明DNA純度和完整性較好,符合建庫和測(cè)序要求。

將30份晉汾白豬樣品經(jīng)Illumina平臺(tái)上機(jī)進(jìn)行全基因組重測(cè)序,共獲得11 909 696 916條Raw reads(1 786 454 537 400 bp),將低質(zhì)量的堿基以及reads去除后共得到11 759 401 450條Clean reads(1 761 731 736 206 bp),平均每個(gè)樣品數(shù)據(jù)量為58 724 391 207 bp,Q20≥96.1%,Q30≥89.9%,Q30均值為91.77%,GC含量介于42.62%～43.74%之間(表2)。以上結(jié)果表明數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,可用于后續(xù)分析。

2.2 重測(cè)序數(shù)據(jù)基因組比對(duì)

將過濾獲得的Clean reads比對(duì)到豬的參考基因組(版本:Sscrofa11.1),由表2可知,30頭晉汾白豬基因組測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)率在74.76%～76.59%之間,平均比對(duì)率為75.61%,平均覆蓋深度為14.7 X,平均覆蓋率為96.95%,1 X覆蓋度在95.83%以上,5 X覆蓋度均值為91.84%,15 X覆蓋度均值為48.67%。說明本研究中的30頭晉汾白豬基因組DNA測(cè)序深度和樣品比對(duì)率均較高,可用于后續(xù)基因組變異檢測(cè)分析。

2.3 單核苷酸多態(tài)性特征分析

將晉汾白豬測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對(duì),共檢測(cè)到99 420 798個(gè)SNPs,平均每個(gè)樣品包含3 314 026.6個(gè)SNPs,去冗余后共得到14 680 807個(gè)SNPs(8 259 439個(gè)SNPs可比對(duì)到SNP數(shù)據(jù)庫),轉(zhuǎn)換顛換比(Ti/Tv)平均值為2.55,與之前的結(jié)果類似[15-16]。SNPs在豬的每條染色體上分布較均勻且染色體末端分布較多(圖1A),其中1號(hào)染色體上分布最多(1 341 385個(gè)SNPs),13號(hào)染色體次之,Y染色體分布最少(50 625個(gè)SNPs)(圖1B)。以上結(jié)果說明,染色體長度越長,分布的SNPs位點(diǎn)越多。

圖1 晉汾白豬SNPs的染色體密度(A)、數(shù)目(B)和類型(C)Fig.1 Density (A), number (B) and type (C) of SNPs loci on chromosomes in Jinfen White pigs

對(duì)SNPs的類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì),有708 428(4.83%)和741 843(5.05%)個(gè)SNPs分別位于基因上、下游,308 103個(gè)SNPs(2.10%)位于外顯子區(qū),內(nèi)含子區(qū)SNPs變異最多,有7 194 452 個(gè)(49.01%),其次位于基因間隔區(qū)(37.53%),剪接位點(diǎn)區(qū)域內(nèi)的SNPs數(shù)目最少,有22 028個(gè)(圖1C)。

2.4 晉汾白豬特異SNPs位點(diǎn)的篩選

為了篩選晉汾白豬特異性SNPs位點(diǎn),本研究隨后對(duì)18頭馬身豬基因組進(jìn)行重測(cè)序, 并在NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫下載30頭長白豬、17頭大白豬、40頭太湖豬(二花臉)的基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)(表1,表3)。對(duì)以上5個(gè)品種豬基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,共測(cè)到5 772.84 Gb的原始數(shù)據(jù),經(jīng)過質(zhì)控和過濾后共得到5 584.50 Gb的純凈數(shù)據(jù),共有31 560 947 644條reads可以比對(duì)到參考基因組(表3)。

表3 5個(gè)品種豬重測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 3 Summary of resequencing data in 5 different pig breeds

將30頭晉汾白豬樣品作為一個(gè)群體,其余品種作為另一個(gè)群體,基于等位基因頻率(AF>0.1)篩選晉汾白豬特異SNPs,共獲得了87 366個(gè)特異的SNPs位點(diǎn),平均每28.44 kb就有1個(gè)特異SNP(豬基因組總長2.44 Gb)(圖2A)。其中2號(hào)染色體上分布最多(8 650個(gè)SNPs),1號(hào)和15號(hào)染色體次之(7 477和7 267個(gè)SNPs),Y染色體分布最少,僅有530個(gè),且這些特異性的SNPs分布于25 606個(gè)基因上(圖2B)。對(duì)晉汾白豬特異SNPs進(jìn)行分類,發(fā)現(xiàn)這些特異性的SNPs類型占比與晉汾白豬所有SNPs的類型占比相似,主要分布在內(nèi)含子區(qū)(49.50%)和基因間區(qū)(37.58%),剪接位點(diǎn)和5′非翻譯區(qū)最少,均不到1%(圖2C)。

圖2 晉汾白豬特異性SNPs的染色體密度(A)、數(shù)目(B)和類型(C)Fig.2 Density (A), number (B) and type (C) of specific SNPs loci on chromosomes in Jinfen White pigs

2.5 特異SNPs功能富集分析

有993個(gè)特異性SNPs位點(diǎn)位于外顯子區(qū),其中包括555個(gè)同義突變SNPs,437個(gè)錯(cuò)義突變SNPs和1個(gè)無義突變SNPs,這些錯(cuò)義突變SNPs位點(diǎn)分布在343個(gè)基因上,包括影響豬肌肉生長發(fā)育的基因ITGA4、MYH和ANK1,影響免疫應(yīng)答的基因FN1、DNER和ITSN2等。對(duì)以上343個(gè)基因進(jìn)行GO富集分析,共富集到245個(gè)條目,包括生物學(xué)過程(137)、分子功能(51)和細(xì)胞組分(57),其中包括17個(gè)顯著富集的條目(P<0.05),細(xì)胞組分富集的條目最多(12個(gè))。大部分基因(gene number>15)富集在胞內(nèi)無膜細(xì)胞器(intracellular non-membrane-bounded organelle)、無膜細(xì)胞器(non-membrane-bounded organelle)、退化的細(xì)胞器組分(absolete organelle part)、退化的胞內(nèi)細(xì)胞器組分(absolete intracellular organelle part)等過程(圖3A)。此外,對(duì)以上343個(gè)基因進(jìn)行KEGG富集分析,共富集到178個(gè)信號(hào)通路,顯著富集到9個(gè)信號(hào)通路(P<0.05),包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)(regulation of actin cytoskeleton)、初級(jí)膽汁酸生物合成(primary bile acid biosynthesis)、腸道免疫系統(tǒng)IgA的合成(intestinal immune network for IgA production)、過氧化物酶(peroxisome)、粘著斑(focal adhesion)、磷脂酶D信號(hào)通路(phospholipase D signaling pathway)、脂肪酸降解(fatty acid degradation)、軸突導(dǎo)向(axon guidance)、急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia),其中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)信號(hào)通路富集的基因最多(8個(gè)),脂肪酸降解和初級(jí)膽汁酸生物合成通路只富集到了2個(gè)基因(圖3B)。通過以上富集分析,發(fā)現(xiàn)IGTA4、SLC27A2、MYH、PIK3R、PDFGA、FN1、SSH、CEBPE、PAK3、MHC2、ROBO3、APC5、MAP3K14、CSF1R等富集于上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育、腸道免疫、脂質(zhì)代謝等過程,以上基因的特異性SNPs位點(diǎn)的鑒定將為晉汾白豬種質(zhì)特異性研究提供參考依據(jù)。

圖3 晉汾白豬特異性錯(cuò)義突變SNPs位點(diǎn)所在基因的GO(A)和KEGG(B)富集分析(P<0.05)Fig.3 GO (A) and KEGG (B) enrichment analyses of specific missense mutation SNPs loci in Jinfen White pigs (P<0.05)

3 討 論

近年來,以二代測(cè)序技術(shù)為代表的全基因組測(cè)序推動(dòng)了畜禽動(dòng)物基因組的注釋以及分析工作,與從頭測(cè)序不同,全基因組重測(cè)序(resequencing)是指對(duì)已知物種個(gè)體基因組再次測(cè)序,并同參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析,獲得遺傳變異信息,在個(gè)體和群體差異比較、進(jìn)化研究、重要經(jīng)濟(jì)性狀候選基因篩選等方面起到了重要的作用[17]。Jiang等[18]通過對(duì)無后肢突變豬、親代母豬和同代正常仔豬進(jìn)行全基因組重測(cè)序并進(jìn)行比較基因組學(xué)分析,篩選出6個(gè)可能導(dǎo)致表型變異的候選基因(包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP7),為解析肢體表型變異原因提供了參考。此外,Miller等[19]對(duì)1只大角羊進(jìn)行三代基因組重測(cè)序并與其他綿羊基因組比對(duì),共發(fā)現(xiàn)1 562萬個(gè)遺傳變異,其中同義和非同義突變SNPs所在基因主要富集于精子發(fā)生和乳腺上皮細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控等信號(hào)通路,為綿羊遺傳機(jī)制的解析和育種奠定了理論基礎(chǔ)。Herrero-Medrano等[20]對(duì)歐洲豬種進(jìn)行重測(cè)序,鑒定了99個(gè)同義突變SNPs(65個(gè)基因),并篩選AZGP1和TAS2R40作為環(huán)境適應(yīng)性候選基因。Liu等[21]對(duì)清平豬和其他品種豬全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合,篩選了10 342 544個(gè)高質(zhì)量的SNPs位點(diǎn)并結(jié)合RNA-Seq數(shù)據(jù),鑒定出EGFR可能與豬的妊娠期長短有關(guān)。

測(cè)序質(zhì)量的好壞通常用測(cè)序深度和覆蓋度來衡量[22]。測(cè)序深度反映測(cè)序量的大小,與結(jié)果的準(zhǔn)確性成正比,一般的測(cè)序深度可達(dá)到10 X～30 X,且覆蓋度與測(cè)序深度呈一致性。李文婷[23]對(duì)6個(gè)豬種進(jìn)行重測(cè)序,平均測(cè)序深度和覆蓋率分別為10 X和 94%。Choi等[24]對(duì)韓國本土豬、野豬和歐洲豬種進(jìn)行基因組重測(cè)序,平均測(cè)序深度和覆蓋率高達(dá)11.7 X和 99.2%。本研究共得到約1 786.45 Gb的重測(cè)序數(shù)據(jù),Q30高達(dá)89.9%,平均測(cè)序深度高達(dá)14.7 X,且平均覆蓋率為96.95%,參考基因組平均比對(duì)率為75.61%。說明晉汾白豬基因組重測(cè)序與其他豬種研究結(jié)果類似,具有數(shù)據(jù)大、覆蓋率高、質(zhì)量和比對(duì)情況良好等特征,為后續(xù)數(shù)據(jù)分析提供了可靠的保障。

通過去冗余共鑒定了14 680 807個(gè)SNPs位點(diǎn),主要分布于1號(hào)染色體,Y染色體分布最少(0.34%)。與崔清明等[25]利用RAD-Seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序結(jié)果相似,在480份大圍子豬保種核心群中鑒定了387 935個(gè)SNPs位點(diǎn),其中有27 906個(gè)分布于1號(hào)染色體(7.17%),僅有1 143個(gè)分布于Y染色體(0.19%),說明染色體上SNPs的分布可能與染色體的長度有關(guān)。此外,本研究大部分SNPs分布在內(nèi)含子區(qū)和基因間隔區(qū),外顯子區(qū)和剪接位點(diǎn)分布的最少。與任鈺為等[26]的研究結(jié)果類似,五指山豬和杜洛克豬的基因組重測(cè)序結(jié)果中大部分SNPs分布于內(nèi)含子區(qū)域和基因間區(qū),而編碼區(qū)的SNPs則較少。以上結(jié)果說明,與多數(shù)研究結(jié)果類似,編碼區(qū)的SNPs少于非編碼區(qū),這可能與基因組的非編碼區(qū)占比高有關(guān),也可能與其分布在啟動(dòng)子區(qū)或者非編碼區(qū)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能有關(guān)[26-27]。

通過將晉汾白豬的SNPs與馬身豬、長白豬、大白豬、太湖豬(二花臉)的SNPs進(jìn)行特異性比較分析,基于等位基因頻率共鑒定了87 366個(gè)(0.6%)晉汾白豬特異性SNPs位點(diǎn)。這些位點(diǎn)主要分布于25 606個(gè)基因上,覆蓋了基因組大部分區(qū)域,且多數(shù)位于2號(hào)染色體。李文婷[23]利用6個(gè)品種共48頭豬全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù),獲得了132 078個(gè)太湖豬特有的SNPs位點(diǎn),高于本研究中篩選的晉汾白豬特異性SNPs位點(diǎn),可能是由于品種遺傳多樣性不同而產(chǎn)生的差異。

錯(cuò)義突變將對(duì)編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響,可能直接或者間接造成品種間性狀差異。因此,對(duì)包含有錯(cuò)義突變SNPs位點(diǎn)的343個(gè)基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析,發(fā)現(xiàn)主要影響細(xì)胞器和細(xì)胞器組分等生物學(xué)過程,且部分基因顯著富集于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、初級(jí)膽汁酸生物合成、腸道免疫系統(tǒng)IgA的產(chǎn)生、過氧化物酶、磷脂酶D、脂肪酸降解、急性髓細(xì)胞白血病等過程,說明這些SNPs位點(diǎn)可能影響細(xì)胞生長、骨骼肌生長發(fā)育、機(jī)體代謝和免疫等信號(hào)通路。在以上所有富集的生物學(xué)過程(245個(gè))和信號(hào)通路(178個(gè))中包括影響機(jī)體發(fā)育的基因MYH(蛋白結(jié)合、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、血管平滑肌收縮)和ANK1(細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、代謝途徑),影響免疫應(yīng)答的基因FN1(肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)、黏著斑信號(hào)通路、ECM受體互作、癌癥蛋白聚糖等)、DNER(細(xì)胞膜)和ITSN2(結(jié)合)。MYH作為肌球蛋白重鏈的組成部分不僅可以影響骨骼生長發(fā)育而且可以調(diào)控肌纖維類型,進(jìn)而改善豬肉品質(zhì)[28-30]。Lee等[31]對(duì)181頭杜洛克豬和14個(gè)肉品質(zhì)相關(guān)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因上的SNPs位點(diǎn)與肉品質(zhì)相關(guān),其中就包括ANK1。此外,ANKI作為轉(zhuǎn)錄因子在造血干細(xì)胞向髓系祖細(xì)胞分化過程中表達(dá)量上調(diào)并發(fā)揮作用[32]。Xie等[33]為了研究miR-183對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的斷奶仔豬海馬體氧化應(yīng)激的調(diào)控作用,通過轉(zhuǎn)染miR-183 mimic以及利用熒光素酶報(bào)告基因等試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)miR-183可通過靶向FN1調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。Wang等[34]發(fā)現(xiàn),Delta和Notch樣內(nèi)皮生長因子相關(guān)受體DNER,可作為跨膜蛋白傳遞神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞間的信號(hào),通過抑制TOR4A表達(dá)和功能影響膠質(zhì)瘤產(chǎn)生。此外,ITSN2作為一種多器官高度保守的支架蛋白,主要參與T細(xì)胞活性和卵母細(xì)胞發(fā)育等過程[35-36]。在雞骨骼肌發(fā)育過程中,ITSN2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的環(huán)狀RNA circITSN2可充當(dāng)分子海綿結(jié)合miR-218-5p增加LMO7的表達(dá)促進(jìn)雞胚胎成肌細(xì)胞的增殖和分化[37]。以上結(jié)果說明,晉汾白豬可能在肌肉生長發(fā)育和免疫應(yīng)答方面有別于親本,但又繼承了親本的優(yōu)點(diǎn)。在后續(xù)的工作中,將對(duì)特異性SNPs進(jìn)一步篩選,用于分子標(biāo)記開發(fā)基因組選種芯片檢測(cè)試劑盒,以及晉汾白豬純種鑒定和種質(zhì)資源采集。

4 結(jié) 論

本研究通過對(duì)30頭晉汾白豬基因組重測(cè)序,共得到了14 680 807個(gè)SNPs位點(diǎn),基于等位基因頻率剔除與親本相關(guān)的變異位點(diǎn),篩選到87 366個(gè)晉汾白豬特異SNPs,包括影響機(jī)體發(fā)育的基因MYH和ANK1和影響免疫應(yīng)答的基因FN1、DNER和ITSN2等。本研究結(jié)果從基因組水平上解析了晉汾白豬種質(zhì)特征形成基礎(chǔ),為晉汾白豬選育、純種鑒定和核心種質(zhì)的篩選提供了理論依據(jù)。