動(dòng)物腸類器官培養(yǎng)技術(shù)

陳奡蕾,黃德如,安婭菲,李守軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642)

腸類器官(intestinal organoid)是由離體的干性細(xì)胞如成體干細(xì)胞(adult stem cells, ASCs)、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)及其分化形成的多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells, PSCs)、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)或腸隱窩(intestinal crypts)組織,在基質(zhì)膠(matrigel)和特殊生長因子的培養(yǎng)條件下,自發(fā)組織增殖和分化且表現(xiàn)明顯腸組織特性的空心細(xì)胞團(tuán)塊[1]。它們高度折疊,呈腸纖毛和隱窩樣(圖1)。

圖1 腸類器官模型Fig.1 Intestinal organoid model

2007年Clevers研究組[2]利用小鼠體內(nèi)試驗(yàn)證明了Lgr5+上皮細(xì)胞屬于腸道上皮干細(xì)胞。2009年該研究組成員Sato等[3]在Nature上展示了團(tuán)隊(duì)成功利用單一的Lgr5+細(xì)胞培養(yǎng)出小腸絨毛狀上皮結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)不但具有完整的腸道上皮結(jié)構(gòu)特性,且含腸道內(nèi)各種分化的功能細(xì)胞,包括腸上皮細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和Lgr5+干細(xì)胞[3]。隨后的多項(xiàng)研究也證明,離體的腸道干細(xì)胞和隱窩可以在3D培養(yǎng)條件下形成腸道類器官,也稱為“迷你腸”(mini-gut),它們能呈現(xiàn)源組織的典型功能[4-10]。

目前報(bào)道培養(yǎng)人和小鼠的腸類器官的文獻(xiàn)比較豐富,但伴侶動(dòng)物和家畜動(dòng)物的相關(guān)報(bào)道較少。然而伴侶動(dòng)物和家畜動(dòng)物仍存在很多傳染性和非傳染性的腸道疾病,需要新型的研究模型。為此,本文將綜述動(dòng)物腸類器官的培養(yǎng)進(jìn)展,旨在為構(gòu)建不同動(dòng)物的腸類器官提供參考。

1 腸類器官的培養(yǎng)方法

目前腸類器官的培養(yǎng)方法主要有兩種:Sato等[3]在2009年發(fā)表的“浸泡培養(yǎng)法”(submerged method)和Wang等[11]在2015年發(fā)表的“氣液雙向培養(yǎng)法”(air-liquid method)。前者是將分離的樣品與基質(zhì)膠混合后,滴加到培養(yǎng)皿正中間使之呈圓滑的“水珠狀”,待基質(zhì)膠凝固后加入含有特殊生長因子的類器官生長培養(yǎng)基并浸沒樣品基質(zhì)膠混合物以實(shí)現(xiàn)3D培養(yǎng);后者是利用Transwell小室,在一個(gè)培養(yǎng)板中間放置一個(gè)底下可以允許生長培養(yǎng)基通過的濾膜皿,在濾膜皿底部先鋪一層基質(zhì)膠,再在上層加入基質(zhì)膠和樣品混合物,最后在培養(yǎng)板中加入完全類器官培養(yǎng)基,構(gòu)建“大皿套小皿”的方式培養(yǎng)。這兩種方法都可使腸ASCs在體外培養(yǎng)條件下自發(fā)分化成各種成熟細(xì)胞,并重現(xiàn)與源組織相同的結(jié)構(gòu)和功能。前者單次培育的成熟類器官較少,而后者單次培育的類器官數(shù)量更多。除了在類器官培育數(shù)量上有區(qū)別外,更重要的是,后者的培養(yǎng)方式改變了小腸上皮細(xì)胞的極性,使單層上皮細(xì)胞的小腸絨毛面朝向培養(yǎng)液,便于進(jìn)行小腸功能探索與評(píng)估或宿主與病毒關(guān)系的試驗(yàn)[6,12-13]。

2 不同動(dòng)物的腸類器官培養(yǎng)

2.1 鼠腸類器官

2009年,Clevers團(tuán)隊(duì)[3]首次利用ENR培養(yǎng)條件,即利用富含表皮生長因子(EGF)、頭蛋白(Noggin)和Wnt激活劑R-spondin-3的培養(yǎng)基成功構(gòu)建鼠小腸類器官。2018年,Wang等[14]從成年小鼠的黏膜下組織和固有層中分離出了腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(EGCs),Baghdadi和Kim[15]在Wang等的研究基礎(chǔ)上將ENR培養(yǎng)基和從EGCs培養(yǎng)中分離的條件培養(yǎng)基相結(jié)合,發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)系統(tǒng)會(huì)顯著促進(jìn)鼠小腸新隱窩的形成,增強(qiáng)干細(xì)胞活性,該培養(yǎng)系統(tǒng)可以用于研究鼠小腸類器官和EGCs通過分泌因子產(chǎn)生的相互作用。

盡管小鼠小腸類器官的培養(yǎng)條件已經(jīng)相對(duì)成熟,構(gòu)建長期穩(wěn)定的小鼠結(jié)腸類器官仍存在培養(yǎng)條件上的挑戰(zhàn)。為此,Sato等[16]開始改良ENR培養(yǎng)條件。研究發(fā)現(xiàn)鼠小腸類器官可持續(xù)表達(dá)Wnt信號(hào),而結(jié)腸隱窩在培養(yǎng)開始不久后便失去Wnt信號(hào),他們推測(cè)結(jié)腸類器官缺乏Wnt配體,因此不能長期維持結(jié)腸干細(xì)胞的穩(wěn)定[16];該課題組在ENR條件培養(yǎng)基中添加Wnt-3A,結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸隱窩的培養(yǎng)效率增加了10倍,最終成功探索出小鼠結(jié)腸類器官的培養(yǎng)條件[16];此外,他們還發(fā)現(xiàn)新鮮分離的結(jié)腸隱窩上部完全成熟細(xì)胞會(huì)干擾腸類器官的生長[16]。將結(jié)腸隱窩輕度消化成小簇細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng),會(huì)極大提高結(jié)腸類器官形成的效率。

Yilmaz等[17]發(fā)現(xiàn)潘氏細(xì)胞能夠通過檢測(cè)腸干細(xì)胞代謝狀態(tài)來調(diào)節(jié)自身活動(dòng)。Sato等[18]研究發(fā)現(xiàn)無論是在小鼠的體內(nèi)或體外,Lgr5+干細(xì)胞的生長維持都與潘氏細(xì)胞有密切的聯(lián)系。潘氏細(xì)胞能夠表達(dá)EGF、Wnt3、TGF-α等多種培養(yǎng)干細(xì)胞所必須的信號(hào)分子,將分選出的Lgr5+干細(xì)胞與潘氏細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著提高腸類器官培養(yǎng)的成功率。

2.2 豬腸類器官

2013年,Gonzalez-Cordero等[19]從野生型約克夏仔豬中獲取腸道組織,采用免疫熒光法及電鏡首次鑒定了豬腸細(xì)胞譜系,包括腸道干/祖細(xì)胞系,吸收細(xì)胞系及分泌細(xì)胞系。同時(shí),構(gòu)建了豬腸類器官長期培養(yǎng)體系,成功培養(yǎng)和傳代豬腸類器官,為利用豬作為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)[19]。為了更好地研究腸道上皮細(xì)胞的更新情況,Thorne團(tuán)隊(duì)[20]成功開發(fā)了“單層類器官”的培養(yǎng)方法,并證實(shí)“單層類器官”具有增殖和分化區(qū),自我更新,組織極性及分化主要腸道細(xì)胞類型的特性。van der Hee等[21]利用完全酶解法將類器官分離為多細(xì)胞系懸液,取代了用機(jī)械破碎法獲得腸道隱窩或腸道干細(xì)胞。這樣不僅能提高單層類器官培養(yǎng)效率還能減少機(jī)械分離對(duì)細(xì)胞的損傷。利用上述培養(yǎng)方法,Li等[12]成功將3D豬腸類器官制成2D單層類器官,用于研究PEDV感染宿主腸道的致病機(jī)制。2020年,Li等[22]通過去除豬腸類器官培養(yǎng)系統(tǒng)中的基質(zhì)膠并利用超低吸附培養(yǎng)板,使原本腸絨毛內(nèi)置的豬腸類器官在懸浮培養(yǎng)時(shí)發(fā)生極性反轉(zhuǎn),培養(yǎng)出了絨毛外置的豬腸類器官,為研究豬腸道病原體與宿主的相互作用提供了適宜的模型。

2.3 犬腸類器官

近年來,人們建立并不斷探索犬腸類器官的改良培養(yǎng)方案以期提高培養(yǎng)效率[16]。Powell和Behnke[23]利用可分泌Wnt3a、R-spondin-1和Noggin(WRN)的小鼠纖維原細(xì)胞系,構(gòu)建了50% L-WRN(條件培養(yǎng)基),并證明了WRN是犬類器官生長所需要的因子。在該培養(yǎng)方案下,犬腸類器官能穩(wěn)定傳代40代以上。Kramer等[24]采取Fujii團(tuán)隊(duì)[25]的經(jīng)驗(yàn)策略,通過移除煙酰胺、p38-MAPK抑制劑、N2和EGF及增添IGF1及FGF2,調(diào)制出改良培養(yǎng)系統(tǒng)。該培養(yǎng)系統(tǒng)在促進(jìn)細(xì)胞分化的同時(shí)還能保持腸道干細(xì)胞的增殖。

此外,由于每個(gè)腸段都有特定的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能,研究者開始探索更精準(zhǔn)的腸段類器官。Chandra和同事們[26]在試驗(yàn)中分離健康犬和炎性腸炎病(IBD)及腸道腫瘤病犬的空腸、十二指腸、回腸組織和結(jié)腸,并在改良的人腸類器官培養(yǎng)基(WRN、ROCK抑制劑和GSK3β)中培養(yǎng)出了對(duì)應(yīng)的類器官。研究發(fā)現(xiàn)IBD犬源的類器官和健康犬源的類器官在形態(tài)學(xué)上無明顯差異,且都能穩(wěn)定傳代20代以上。與傳統(tǒng)截取腸段組織不同,該研究利用內(nèi)窺鏡對(duì)不同腸段進(jìn)行活檢采樣,所得樣本均能順利形成對(duì)應(yīng)的類器官,擴(kuò)大了犬腸類器官的供體來源。就犬隱窩分離方法而言,Powell和Chandra團(tuán)隊(duì)使用的方法略有差異:前者使用膠原酶消化達(dá)到隱窩分離的效果,而后者使用EDTA螯合法[23,26]。從分離效果上來看,使用EDTA進(jìn)行隱窩分離顯著提高了隱窩上皮的純度,并減少了其他細(xì)胞類型的污染[26]。哺乳類動(dòng)物腸道干細(xì)胞的分離具有種屬差異,消化試劑濃度和孵育時(shí)間與對(duì)應(yīng)種屬腸道絨毛的長度、數(shù)量和大小相關(guān)[3,26-27]。

與人和小鼠的腸道類器官相似,犬Lgr5+腸道干細(xì)胞主要集中在腸道類器官及空腸組織的隱窩區(qū)域[26]。犬腸道類器官與犬全層空腸組織的免疫組化對(duì)比結(jié)果顯示,犬腸道類器官為上皮細(xì)胞群組成,不含潘氏細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞及免疫細(xì)胞且犬腸道干細(xì)胞能分化成杯狀細(xì)胞、小腸內(nèi)分泌細(xì)胞及空腸組織[26]。這些細(xì)胞的類型及空間定位與源組織一致,證明犬腸道類器官能較好地還原源組織的結(jié)構(gòu)和功能[28]。

2.4 貓腸類器官

目前,僅有一例報(bào)道描述了貓腸類器官的培養(yǎng),但培養(yǎng)的結(jié)果并不理想。Powell和Behnke[23]利用L-WRN條件培養(yǎng)基養(yǎng)出貓腸類器官,但貓腸類器官在P10代次前后停止擴(kuò)增,并在P13～P18代次前后開始出現(xiàn)生長停滯。與此同時(shí),他們觀察到了一種間充質(zhì)樣細(xì)胞類型在貓腸類器官生長出現(xiàn)停滯前數(shù)量減少且貓腸類器官表達(dá)的波形蛋白(VIM)比對(duì)照組多,提示這類細(xì)胞可能是貓腸類器官生長的必需成分。Powell和Behnke[23]根據(jù)間充質(zhì)/基質(zhì)成分與腸隱窩共培養(yǎng)的要求,嘗試了添加多種用于誘導(dǎo)人和小鼠的腸類器官生長或由隱窩間充質(zhì)/基質(zhì)細(xì)胞分泌的因子,但培養(yǎng)結(jié)果依然沒有太大的改善,說明貓腸類器官的培養(yǎng)條件仍需要更多探索。

2.5 禽腸類器官

目前,關(guān)于禽腸道類器官的報(bào)道較少。Pierzchalska等[29]首次利用雞胚的上皮組織成功建立禽腸道類器官,并發(fā)現(xiàn)前列腺素E2(PGE2)可替代WRN培養(yǎng)體系中的R-spondin1和Noggin而不影響類器官球的生長。與哺乳類動(dòng)物的腸類器官不同,禽腸類器官較少出現(xiàn)出芽樣的隱窩[29-30]。

近期,Zhao等[30]采用L-WRN條件培養(yǎng)基,利用雞胚的小腸組織和肉雞或蛋雞的盲腸成功構(gòu)建了可傳代、可凍存的禽腸類器官,并用RT-PCR和Western blot證實(shí)了禽小腸類器官不僅有干細(xì)胞還有成熟的分化細(xì)胞,包括上皮細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。而外源添加物的濃度和種類可改變禽腸類器官的數(shù)量、表面積和干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)量[30-32]。為了提高構(gòu)建禽腸類器官的可重復(fù)性,除了培養(yǎng)體系方面的改良,Panek等[33]還應(yīng)用懸滴法培養(yǎng)以雞胚為材料的禽腸類器官,不但提升了培養(yǎng)效率而且還降低實(shí)驗(yàn)成本。

2.6 反芻動(dòng)物及草食動(dòng)物的腸類器官

由于反芻動(dòng)物(牛、羊)及草食動(dòng)物(馬、兔)的飲食特性,其消化道進(jìn)化為與之適應(yīng)的特殊解剖結(jié)構(gòu)。例如牛和羊具有四個(gè)胃,馬和兔子的盲腸和結(jié)腸發(fā)達(dá)。盡管反芻動(dòng)物及草食動(dòng)物的腸道與人和小鼠的腸道不同,但利用改良的人或小鼠腸道類器官培養(yǎng)系統(tǒng)如L-WRN、BEM或商品化培養(yǎng)基IntestiCultTM仍能培養(yǎng)出相應(yīng)的反芻動(dòng)物及草食動(dòng)物的3D腸類器官,而Mussard等發(fā)現(xiàn)利用化學(xué)抑制劑的2Ki培養(yǎng)基更適用于增殖兔腸類器官,而低濃度(5%)的L-WRN更適合誘導(dǎo)分化兔腸類器官[23,34-38]。

3 動(dòng)物腸類器官的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)

3.1 優(yōu)點(diǎn)

動(dòng)物腸類器官是功能介于2D細(xì)胞系模型和動(dòng)物模型之間的體外模型。它既具有某些2D細(xì)胞系模型或活體動(dòng)物模型的優(yōu)勢(shì),又能彌補(bǔ)他們?cè)谀承┭芯可系牟蛔恪?/p>

Caco-2細(xì)胞單層模型是藥物研究常用的2D細(xì)胞系模型,但該模型無法模擬腸道真實(shí)結(jié)構(gòu)和腸道細(xì)胞間的互作[39-40]。而與廣泛使用的癌細(xì)胞系和永生細(xì)胞系構(gòu)建的2D單層細(xì)胞系模型不同,3D腸類器官模型能更好地再現(xiàn)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,以及原始組織的遺傳和表觀遺傳特征,是更加真實(shí)可靠的模型[4,41-44]。

與活體動(dòng)物模型相比,類器官不僅能模擬疾病在體內(nèi)發(fā)生和發(fā)展的情況,還能更容易地進(jìn)行基因操作,使之更好地研究特定細(xì)胞之間的聯(lián)系和形態(tài)結(jié)構(gòu)[45-46]。除此以外,類器官培養(yǎng)所需的原代細(xì)胞來源廣泛,可從外科切除的組織、活檢樣品和屠宰組織中獲得,極高效地利用組織,減少使用活體動(dòng)物,符合實(shí)驗(yàn)3R原則[26,47-49]。由于類器官能很好地反映樣本個(gè)體特征,因此也可服務(wù)于病患個(gè)體的精準(zhǔn)醫(yī)療[35,50]。

3.2 缺點(diǎn)

和所有正在發(fā)展的技術(shù)一樣,類器官培養(yǎng)技術(shù)也有其短板。腸類器官的3D培養(yǎng)體系所用的基質(zhì)膠是來自小鼠的肉瘤,而這些動(dòng)物來源的基質(zhì)膠成分復(fù)雜,組分無法標(biāo)準(zhǔn)化,具有傳播動(dòng)物源病原的風(fēng)險(xiǎn)。此外,這種腫瘤源基質(zhì)不能有效地模擬天然腸道的微環(huán)境。上述缺點(diǎn)可能會(huì)限制腸類器官廣泛地應(yīng)用在機(jī)制研究和臨床試驗(yàn)中[50]。Gjorevski等[51]首次提出人造水凝膠替代基質(zhì)膠,但由于類器官生長的不同階段需要不同硬度的細(xì)胞外基質(zhì),因此人造水凝膠的培養(yǎng)效果不如動(dòng)物源基質(zhì)膠。隨后人們開始嘗試不同的非腫瘤源生物基質(zhì)膠,并發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)性質(zhì)與基質(zhì)膠相當(dāng),甚至更優(yōu),如蛋白、腸道細(xì)胞外間質(zhì)水凝膠和去細(xì)胞化的豬消化道[52-54]。這些嘗試為以后生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化基質(zhì)膠提供了理論基礎(chǔ)[54]。

當(dāng)前類器官主要指上皮源性的類器官。而這些類器官幾乎只含干細(xì)胞/足細(xì)胞及其分化的特異性上皮細(xì)胞,不含有成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管細(xì)胞等間基質(zhì)細(xì)胞[26]。這限制了類器官技術(shù)在模擬炎癥反應(yīng)、免疫細(xì)胞調(diào)控機(jī)制和模擬體內(nèi)微環(huán)境等方面的研究[50]。當(dāng)試驗(yàn)需要更復(fù)雜,更接近生理的研究模型時(shí),單個(gè)類器官或簡單的共培養(yǎng)系統(tǒng)則不能滿足此要求。為此,科學(xué)家開發(fā)了類器官芯片(organoid-on-chips),以更好地模擬生理微環(huán)境[55-56]。

腸上皮細(xì)胞具分泌物質(zhì)、消化大分子、吸收營養(yǎng)、抵抗病原體和自我更新的功能,其特殊細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)絨毛和微絨毛面向腸腔,具有極性[57]。研究腸類器官上皮細(xì)胞與其他物質(zhì)或病原體之間的關(guān)系需要通過微注射方法[58]。這種高要求的操作技術(shù)限制了相關(guān)研究的發(fā)展。因此,探索培養(yǎng)絨毛外翻的腸類器官具有迫切性。2D類器官很好地解決了上述的難題。首先在培養(yǎng)皿中鋪上基質(zhì)膠薄層,待基質(zhì)膠凝固后加入含基質(zhì)膠的腸隱窩或腸干細(xì)胞與混合物,然后加入ENR培養(yǎng)液,即可構(gòu)建出細(xì)胞基底面朝向基質(zhì)膠,細(xì)胞頂端面朝向培養(yǎng)液的單層腸類器官[12,20-21,59]。此外,Nash等[60]利用懸浮法培養(yǎng)建立了腸絨毛外翻的禽腸類器官。

4 小結(jié)與展望

Clevers實(shí)驗(yàn)室開創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)Lgr5+干細(xì)胞標(biāo)記物,自此引起了探索人和動(dòng)物的腸類器官構(gòu)建、鑒定與改良的熱潮。得益于腸類器官的立體結(jié)構(gòu)及細(xì)胞異質(zhì)性等特性,人們對(duì)這種新型的、更好模擬體內(nèi)腸道生理結(jié)構(gòu)和功能的體外模型產(chǎn)生巨大需求。為此,研究者紛紛開始探索和改良的類器官培養(yǎng)體系,以期望提高腸類器官的培養(yǎng)效率并根據(jù)研究需要開發(fā)出不同腸段的腸類器官。目前的培養(yǎng)體系和培養(yǎng)技術(shù)能快速成熟地培養(yǎng)出人、小鼠和犬不同腸段的腸類器官。利用改良的人和鼠腸類器官培養(yǎng)體系,也能順利培養(yǎng)出反芻動(dòng)物和草食動(dòng)物的腸類器官;然而相似的培養(yǎng)體系在貓腸道類器官中的培養(yǎng)效率卻較低。相反,由于沒有太多研究和文獻(xiàn)報(bào)道,禽腸類器官的培養(yǎng)體系沒有其他物種的腸類器官培養(yǎng)體系豐富,仍有待繼續(xù)優(yōu)化。

無論是3D腸類器官抑或是2D單層腸類器官,這些研究平臺(tái)都能高度還原源組織的表型和功能。因此在不久的將來,當(dāng)類器官培養(yǎng)體系能更標(biāo)準(zhǔn)化時(shí),結(jié)合如CRISPR/Cas9基因編輯、細(xì)胞共培養(yǎng)、大數(shù)據(jù)和人工智能等技術(shù),動(dòng)物腸類器官能進(jìn)一步服務(wù)于疾病診斷、藥物篩選、器官修復(fù)或移植等研究領(lǐng)域,推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。