mRNA疫苗及其在動(dòng)物傳染病中的研究展望

陳 鑫,秦 彤

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

mRNA疫苗是指通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄(invitrotranscription,IVT)技術(shù)合成病原的mRNA,經(jīng)遞送系統(tǒng)遞送至靶細(xì)胞,并在細(xì)胞核糖體內(nèi)被翻譯為目的抗原,進(jìn)而啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的新型核酸疫苗。mRNA疫苗是繼第一代減毒/滅活疫苗和第二代亞單位疫苗基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的第三代疫苗,具有針對(duì)病原體變異反應(yīng)速度快、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、易規(guī)?；瘮U(kuò)大等特點(diǎn)。

mRNA疫苗的研究最早可追溯到1990年,Wolff等[1]發(fā)現(xiàn)在被注射含有特定基因的質(zhì)粒DNA或mRNA的小鼠肌肉組織局部會(huì)產(chǎn)生該基因編碼的蛋白產(chǎn)物。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn),這種被核酸免疫的動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生針對(duì)該核酸編碼抗原的特異性免疫反應(yīng)[2]。但由于mRNA不穩(wěn)定、在組織內(nèi)易被降解、細(xì)胞吸收率較低等缺陷,其研發(fā)進(jìn)展緩慢。21世紀(jì)后,隨著mRNA合成、修飾和遞送技術(shù)的發(fā)展,上述缺陷逐漸得到克服,mRNA疫苗的研發(fā)也重新得到重視。2005年,Weissman和Karik通過(guò)試驗(yàn)證明,使用修飾的核苷(假尿苷)代替尿苷可以降低體外轉(zhuǎn)錄mRNA的免疫原性[3],提高mRNA在機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)定性,并使mRNA具有更高的翻譯水平[4],這為后期研發(fā)mRNA疫苗奠定了基礎(chǔ)。隨著全球新冠肺炎疫情的暴發(fā),mRNA疫苗再次被推上歷史舞臺(tái)。2020年底,BioNTech/輝瑞和Moderna的兩款mRNA疫苗BNT162b2、mRNA-1273相繼獲批上市,在全球廣泛應(yīng)用,并取得了良好的免疫保護(hù)效果[2]。本文將從mRNA疫苗的類型和結(jié)構(gòu)、遞送系統(tǒng)、作用機(jī)制以及臨床應(yīng)用等方面對(duì)mRNA疫苗進(jìn)行全面綜述,并對(duì)這個(gè)新興疫苗平臺(tái)在獸醫(yī)領(lǐng)域的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

1 mRNA疫苗的類型和結(jié)構(gòu)

mRNA疫苗可以分為兩種類型:非復(fù)制mRNA疫苗和自擴(kuò)增RNA疫苗。雖然兩者具有共同的結(jié)構(gòu),但自擴(kuò)增RNA疫苗在編碼區(qū)域包含用于mRNA復(fù)制的額外序列,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)mRNA擴(kuò)增,可以在同等mRNA用量的情況下表達(dá)更多抗原[5]。mRNA疫苗由mRNA和遞送系統(tǒng)兩個(gè)部分組成,其中,mRNA的功能是為抗原合成提供遺傳信息,遞送系統(tǒng)是將mRNA轉(zhuǎn)入胞內(nèi),使mRNA免受核酸酶及機(jī)體免疫系統(tǒng)的干擾。一個(gè)合格的mRNA疫苗在mRNA和遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)上均格外考究。

1.1 非復(fù)制mRNA疫苗結(jié)構(gòu)組成

信使RNA(message RNA),又稱為mRNA,是以線性DNA為模板通過(guò)轉(zhuǎn)錄方式獲得的核糖核苷酸,作為模板參與蛋白質(zhì)的合成過(guò)程。用于翻譯的mRNA由5′帽子結(jié)構(gòu)(5′ cap)、5′非翻譯區(qū)(5′untranslated region,5′UTR)、翻譯區(qū)(coding sequence, CDS)、3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region,3′UTR)以及poly(A)尾組成。體外轉(zhuǎn)錄的RNA需要通過(guò)加帽、加尾,以模擬天然mRNA結(jié)構(gòu)和功能。有些研究人員會(huì)對(duì)序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,同時(shí)引入Kozak序列,以增強(qiáng)mRNA翻譯水平。

圖1 mRNA疫苗結(jié)構(gòu)[6]Fig.1 The structure of mRNA vaccine[6]

1.1.1 5′帽子結(jié)構(gòu) 在真核生物中,成熟mRNA分子的5′端,有一種特殊結(jié)構(gòu):m7G5′ppp5′Np,通常被稱為甲基鳥(niǎo)苷帽子或5′帽子,用于調(diào)節(jié)前體mRNA的剪接,提升mRNA核輸出,對(duì)于mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)翻譯具有重要作用[7]。此外,先天免疫系統(tǒng)也會(huì)通過(guò)5′帽子識(shí)別自身與非自身mRNA,因此,5′帽子可以幫助IVT mRNA逃脫免疫系統(tǒng)識(shí)別,使其免受外切核酸酶切割[8]。

5′帽子有3種類型,分別是cap0、cap1和cap2。鳥(niǎo)苷G以5′-5′焦磷酸鍵與初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的5′端核苷酸相連,當(dāng)其第7位碳原子被甲基化后,形成m7G5′ppp5′Np,即cap0。當(dāng)轉(zhuǎn)錄本第一個(gè)核苷酸的2′-O位也發(fā)生甲基化時(shí),形成m7GPPPN1m,此時(shí)形成的為cap1,這是多數(shù)5′帽子的存在形式。當(dāng)轉(zhuǎn)錄本第一和第二個(gè)核苷酸的2′-O位均發(fā)生甲基化時(shí),會(huì)形成m7GPPPN1mN2m結(jié)構(gòu),即cap2。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)5′帽子的主要形式是cap1和cap2,兩者在cap0的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了體外轉(zhuǎn)錄mRNA的翻譯效率。

5′帽子通過(guò)m7G的疏水性陽(yáng)離子的相互作用和翻譯起始期間三磷酸橋的負(fù)電荷結(jié)合真核生物翻譯起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E),eIF4E能夠與支架蛋白(eIF4G)相互作用形成復(fù)合物,eIF4G還能夠與poly(A)結(jié)合蛋白(poly-adenosine binding protein,PABP)以及eIF3相互作用使mRNA環(huán)化,進(jìn)而啟動(dòng)mRNA翻譯[9-11]。

目前,加帽主要是使用牛痘病毒加帽酶或通過(guò)化學(xué)共轉(zhuǎn)錄法進(jìn)行[12]。酶法加帽的過(guò)程相對(duì)復(fù)雜,但產(chǎn)量較高,加帽率近100%,多用于大規(guī)模生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室研究;與酶法加帽相比,化學(xué)共轉(zhuǎn)錄方法最大程度上減少了反應(yīng)步驟和酶的用量,過(guò)程簡(jiǎn)單,但產(chǎn)量和加帽率較低,不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)使用。在使用標(biāo)準(zhǔn)帽類似物進(jìn)行化學(xué)共轉(zhuǎn)錄加帽時(shí),會(huì)同時(shí)產(chǎn)生m7GpppGN和Gpppm7GN兩種結(jié)構(gòu)。為此,設(shè)計(jì)了抗反向帽類似物(ARCA,3′-O-Me-m7G5′ppp5′G),其內(nèi)包含一個(gè) 5′-5′三磷酸橋,可以有效解決方向錯(cuò)誤的問(wèn)題[13]。下一代共轉(zhuǎn)錄加帽技術(shù)CleanCap在ARCA的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升了產(chǎn)量,加帽率升至94%[14]。但目前沒(méi)有研究證明何種加帽方式更具優(yōu)勢(shì)。

圖2 5′帽子結(jié)構(gòu)[15]Fig.2 The structure of 5′ cap[15]

1.1.2 非翻譯區(qū) 在天然mRNA分子編碼區(qū)的5′端和3′端,有兩個(gè)不被翻譯成多肽的區(qū)域,稱為非翻譯區(qū)(untranslated regions, UTRs)。UTRs上存在多個(gè)調(diào)控元件來(lái)控制mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率,除此之外,UTRs還與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)以及核糖體對(duì)mRNA的識(shí)別有關(guān)[16]。許多促進(jìn)mRNA翻譯的UTRs序列已經(jīng)被從天然存在的序列中鑒定出來(lái),如源自α-珠蛋白和β-珠蛋白的UTRs序列,目前已被廣泛用于構(gòu)建IVT mRNA[17]。

5′UTR主要參與啟動(dòng)翻譯過(guò)程,作為蛋白質(zhì)翻譯的預(yù)起始復(fù)合物的起始結(jié)合位點(diǎn),在控制蛋白質(zhì)翻譯效率方面起著重要作用[10]。eIF4A與5′UTR的結(jié)合可以協(xié)助在蛋白質(zhì)翻譯發(fā)生之前解開(kāi)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)[10],這對(duì)于eIF1A與mRNA 的結(jié)合十分重要[18]。目前在進(jìn)行mRNA疫苗設(shè)計(jì)時(shí),通常會(huì)在5′UTR下游引入Kozak(GCCACC)序列,提高核糖體識(shí)別翻譯起始位點(diǎn)的準(zhǔn)確性,提升蛋白的表達(dá)效率。

3′UTR中包含mRNA降解信號(hào),優(yōu)化3′UTR序列,可以有效提高mRNA的穩(wěn)定性,延長(zhǎng)半衰期,進(jìn)而提升蛋白的表達(dá)效率。如mRNA的3′UTR中富含A、U的序列參與了mRNA降解過(guò)程中poly(A)尾的去除,因此,改變3′UTR 中的A、U含量可以延長(zhǎng)mRNA半衰期,提高穩(wěn)定性[19]。

1.1.3 編碼區(qū) 編碼區(qū)序列(coding sequence, CDS)是用以編碼目的蛋白的基因序列,在進(jìn)行mRNA疫苗設(shè)計(jì)時(shí),CDS序列的設(shè)計(jì)對(duì)mRNA的翻譯效率和免疫原性具有重要影響[20]。CDS的設(shè)計(jì)需要考慮以下幾個(gè)因素:首先,不同宿主細(xì)胞的密碼子偏好性不同,針對(duì)mRNA疫苗的目標(biāo)物種進(jìn)行密碼子優(yōu)化,使用常見(jiàn)密碼子替代稀有密碼子,可以顯著增強(qiáng)mRNA在細(xì)胞內(nèi)的翻譯水平[21],但有些蛋白質(zhì)的部分密碼子需要低翻譯效率才能保證蛋白的正確折疊,因此需要對(duì)靶抗原進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);其次,研究表明,適當(dāng)提高序列中鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶(G和C)含量可以增加mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率,提高體外穩(wěn)態(tài)mRNA含量和體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)水平[21-22];再次,在設(shè)計(jì)mRNA序列時(shí),增加其二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量,可以有效減少mRNA的降解。最近,一種專門(mén)為最大堿基堆疊區(qū)域設(shè)計(jì)最佳mRNA序列的算法也被證明可以顯著提高mRNA穩(wěn)定性[23]。

1.1.4 poly(A)尾 在真核生物mRNA的3′端,有一個(gè)聚腺苷酸化區(qū)域,被稱為poly(A)尾,其作用是與PABP[poly(A)-binding protein]結(jié)合,后者隨后募集eIF4G并增加對(duì)mRNA 5′帽子的親和力以形成環(huán)狀mRNA[24]。除少數(shù)個(gè)例(例如組蛋白)外,所有編碼mRNA的細(xì)胞蛋白都具有poly(A)尾,其對(duì)于增強(qiáng) mRNA穩(wěn)定性、提高翻譯效率至關(guān)重要。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,天然mRNA分子的poly(A)尾部長(zhǎng)度約為250 nt[25]。通常,翻譯效率與poly(A) 尾中的腺苷數(shù)量成正比[26]。對(duì)于mRNA藥物而言,需要至少含有20 nt poly(A)才能有效翻譯[27]。曾有研究表明,120 nt的poly(A)尾能夠提高mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率[28],但進(jìn)行mRNA疫苗設(shè)計(jì)時(shí)添加poly(A)尾的具體長(zhǎng)度目前尚無(wú)定論。

1.1.5 修飾核苷酸 研究表明,IVT RNA通過(guò)刺激Toll樣受體(TLR),特別是TLR3、TLR7和TLR8來(lái)激活先天免疫系統(tǒng)的免疫細(xì)胞。然而,將修飾核苷如假尿苷(Ψ)、5-甲基胞苷(m5C)、N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基尿嘧啶(m5U)或2-硫代胺(S2U)用于體外轉(zhuǎn)錄時(shí),大多數(shù)TLR不再被激活[4,29]。Karik等[4]率先開(kāi)發(fā)了用于產(chǎn)生IVT mRNA的修飾核苷酸,并聲稱將IVT mRNA中的尿苷替換為假尿苷不僅會(huì)降低針對(duì)mRNA的先天免疫反應(yīng),也能增強(qiáng)蛋白質(zhì)翻譯水平。然而,修飾核苷對(duì)TLR非依賴性免疫反應(yīng)的影響尚不清楚。

1.2 自擴(kuò)增RNA疫苗

自擴(kuò)增RNA(self-assembled RNA, saRNA)疫苗除包含上述結(jié)構(gòu)外,還引入了來(lái)自RNA病毒的促進(jìn)RNA復(fù)制的其他結(jié)構(gòu):非結(jié)構(gòu)蛋白基因nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。nsP1～4分別編碼負(fù)責(zé)mRNA加帽的蛋白、NTP酶/解旋酶/蛋白酶、macrodomain蛋白和RNA聚合酶[30]。自擴(kuò)增RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)后,會(huì)通過(guò)核糖體中的內(nèi)源性翻譯機(jī)制,表達(dá)nsP1～4前體多聚蛋白,這些非結(jié)構(gòu)蛋白重新組裝成RNA依賴性RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物,以IVT RNA為底物分子供翻譯為抗原的mRNA[31]。因此,一個(gè)saRNA可以產(chǎn)生多個(gè)mRNA,進(jìn)而提高抗原表達(dá)量。自擴(kuò)增RNA疫苗單劑所需RNA的量更低,可以進(jìn)一步降低疫苗成本[32]。但自擴(kuò)增RNA疫苗也存在著一定局限性,比如其龐大而復(fù)雜的saRNA序列,通常nsP1～4序列的長(zhǎng)度約為7 000 nt,這使saRNA疫苗的全長(zhǎng)超過(guò)9 000 nt[5],過(guò)大的體積會(huì)限制RNA進(jìn)入細(xì)胞的效率。目前,saRNA疫苗已經(jīng)表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景,Arcturus、CureVac公司設(shè)計(jì)的SARS-CoV-2 saRNA疫苗已進(jìn)入臨床前研究階段,Imperial College London公司設(shè)計(jì)的SARS-CoV-2 saRNA疫苗率先進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)。

2 遞送系統(tǒng)

IVT mRNA相對(duì)分子質(zhì)量為104～106u,表面帶有負(fù)電荷,因此難以通過(guò)胞吞等方式進(jìn)入細(xì)胞[33]。外源性mRNA進(jìn)入機(jī)體時(shí),易被機(jī)體先天免疫系統(tǒng)捕獲,也易被核酸酶降解[34]。合適的遞送系統(tǒng)對(duì)mRNA進(jìn)入細(xì)胞、抗原表達(dá)水平、免疫持續(xù)時(shí)間以及保護(hù)性免疫反應(yīng)效力具有重要作用。目前,常用的遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)納米顆粒(LNP)、脂質(zhì)體、脂質(zhì)復(fù)合物、高分子材料、膠束、多肽、魚(yú)精蛋白、電穿孔等[33,35-37],其中LNP因其表現(xiàn)出的更高的轉(zhuǎn)染效率已成為當(dāng)下最常用的遞送系統(tǒng)之一[38-40]。

LNP具有磷脂單分子層結(jié)構(gòu),帶正電荷的LNP與帶負(fù)電荷的mRNA通過(guò)靜電作用,將mRNA包裹在LNP內(nèi)[33,41]。LNP含有多種成分,以Moderna公司Spikevax疫苗為例,該疫苗中LNP的組成成分包括陽(yáng)離子脂質(zhì)(SM-102)、輔助脂質(zhì)磷脂二甲酰磷脂膽堿(DSPC)、膽固醇(cholesterol)和聚乙二醇化脂質(zhì)(PEG2000-DMG)[42],這四種成分按50∶38.5∶1.5∶10的比例混合,形成LNP復(fù)合物。這四種成分的功能各不相同,陽(yáng)離子脂質(zhì)可以根據(jù)不同內(nèi)環(huán)境的pH,通過(guò)電荷相互作用調(diào)節(jié)LNP的自組裝和mRNA的釋放[43];輔助脂質(zhì)通常是飽和磷脂,可以提高整體相變溫度和穩(wěn)定性[44];膽固醇具有很強(qiáng)的膜融合能力,可以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)mRNA的攝入[45];聚乙二醇化磷脂位于LNP表面,可以提高LNP親水性,避免其被免疫系統(tǒng)快速清除,防止顆粒聚集,調(diào)節(jié)顆粒大小,并提高穩(wěn)定性[46]。

目前脂質(zhì)納米顆粒的制備方法主要有薄膜水化法、擠出法、均質(zhì)法和反相蒸發(fā)等傳統(tǒng)方法[47]。與這些方法相比,采用微流控混合技術(shù)來(lái)制備LNP,相對(duì)簡(jiǎn)便快速,條件溫和,粒徑均勻,轉(zhuǎn)染效率高,容易實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)放大[48]。

在過(guò)去幾年里,大量研究表明,使用LNP技術(shù)可以極大地促進(jìn)mRNA的遞送并增強(qiáng)抗原表達(dá)[49]。這些研究闡述了LNP對(duì)mRNA疫苗誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)起到重要作用,但其機(jī)制尚不明晰[50-51],未來(lái)需要作出更多努力,來(lái)闡明LNP遞送mRNA的作用機(jī)制[52]。

3 mRNA疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的機(jī)制

非復(fù)制mRNA疫苗若要引發(fā)針對(duì)抗原的適應(yīng)性免疫,必須通過(guò)宿主細(xì)胞的翻譯機(jī)制將mRNA翻譯成內(nèi)源性抗原,內(nèi)源性抗原在細(xì)胞內(nèi)被蛋白酶體和溶酶體降解為小分子抗原片段后,分別激活MHC Ⅰ類和Ⅱ類途徑,引起機(jī)體產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫和體液免疫。

mRNA疫苗的免疫效果與接種途徑有關(guān),人們通常選擇用皮內(nèi)、肌肉和皮下注射,注射后mRNA可以轉(zhuǎn)染至注射部位附近的非免疫細(xì)胞和組織駐留免疫細(xì)胞中[53]。在非免疫細(xì)胞中,經(jīng)翻譯得到的抗原最初位于宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中,由于合成的抗原蛋白不用于細(xì)胞,因此它們?cè)诜核鼗笞鳛閮?nèi)源性抗原被蛋白酶體降解[2]。降解后的抗原片段與MHC Ⅰ類分子形成復(fù)合物,隨后抗原片段被呈遞于細(xì)胞表面,供細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞)識(shí)別,進(jìn)而激活 CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)[54]。對(duì)于組織駐留免疫細(xì)胞,主要是針對(duì)抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell, APC),如樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cells, DC)和巨噬細(xì)胞(macrophages)[55]。與非免疫細(xì)胞不同的是,mRNA轉(zhuǎn)染至組織駐留免疫細(xì)胞后,除可以激活MHCⅠ類途徑,還能通過(guò)MHCⅡ類途徑處理抗原,進(jìn)而激活CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答[54]。通常,MHC Ⅱ類途徑由外源性抗原激活,但也存在交叉遞呈途徑,部分內(nèi)源性抗原可以通過(guò)自噬作用激活MHCⅡ類途徑[56],還有一部分內(nèi)源性抗原會(huì)分泌出胞外,重新作為外源性抗原被內(nèi)吞入胞內(nèi),進(jìn)而激活MHC Ⅱ類途徑[5]。該過(guò)程是內(nèi)源性抗原被分泌至胞外后,重新進(jìn)入細(xì)胞,并被溶酶體降解為小分子抗原片段,隨后進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,與MHCⅡ類分子形成復(fù)合物,再經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面,供CD4+T細(xì)胞識(shí)別[57]。CD4+T細(xì)胞受抗原刺激后,通過(guò)分泌細(xì)胞因子等方式使B細(xì)胞成熟并分化為漿細(xì)胞,進(jìn)而激活體液免疫應(yīng)答[58-59]。

由此可見(jiàn),若想使mRNA引起有效的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),需要依靠?jī)?nèi)源性抗原同時(shí)激活MHCⅠ類和MHCⅡ類途徑,其中能夠激活MHC Ⅱ類途徑是成功激活體液免疫的關(guān)鍵。通常,MHCⅡ類途徑由外源性抗原激活,如果引入分泌型信號(hào)肽,通過(guò)基因工程改造將抗原引導(dǎo)至胞外[60],便可以將內(nèi)源性抗原轉(zhuǎn)換為外源性抗原,進(jìn)而更有效激活MHCⅡ類途徑[61]。

圖3 mRNA疫苗作用機(jī)制Fig.3 Mechanism of action of mRNA vaccine

4 mRNA疫苗的應(yīng)用

mRNA疫苗因其相較于傳統(tǒng)疫苗更快的研發(fā)速度和良好的保護(hù)效力在新冠肺炎疫情防控中脫穎而出。2021年8月23日,由BioNTech設(shè)計(jì)的mRNA疫苗(商品名為Comirnaty)正式獲批上市,用于預(yù)防16歲及以上人群的新冠病毒感染,臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示,該疫苗預(yù)防新冠的有效率為91%[62]。當(dāng)前,Moderna、NIAID、Canadian Immunization Research Network、BioNTech和CureVac等多家公司研發(fā)的針對(duì)新冠的mRNA疫苗已進(jìn)入臨床階段。此外,還有多種針對(duì)不同病原的mRNA疫苗(如人副流感病毒、呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒、艾滋病毒等)也已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段,但目前沒(méi)有更多數(shù)據(jù)得到披露[63-64]。

針對(duì)人畜共患病的mRNA疫苗也已有多種進(jìn)入臨床試驗(yàn)。2015年12月—2017年8月,德國(guó)和美國(guó)開(kāi)展了H10N8和H7N9流感病毒mRNA疫苗的Ⅰ期臨床試驗(yàn),評(píng)估了流感病毒mRNA疫苗的安全性和免疫原性。結(jié)果表明,疫苗沒(méi)有導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng),并能引起強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)[65]。2021年11月23日,CureVac公司完成了對(duì)狂犬病病毒mRNA疫苗CV7202的Ⅰ期臨床試驗(yàn),用以評(píng)估在成人中的安全性、反應(yīng)原性和免疫原性,受試者分別接種了1、2和5 μg mRNA,結(jié)果表明1和2 μg劑量的耐受性更好,二者均誘導(dǎo)產(chǎn)生了中和抗體,提高了IgG水平,沒(méi)有引起相關(guān)的安全問(wèn)題,與商品化狂犬病疫苗相當(dāng)[66]。表1中匯總了進(jìn)入臨床試驗(yàn)的人畜共患病mRNA疫苗。

表1 進(jìn)入臨床試驗(yàn)的人畜共患病mRNA疫苗(截至2022年12月)Table 1 List of mRNA vaccines against zoonoses in clinical trials(till December 2022)

5 mRNA疫苗在獸醫(yī)領(lǐng)域的挑戰(zhàn)和展望

與減毒活疫苗和滅活疫苗相比,mRNA疫苗以IVT mRNA為主要成分,排除了在傳統(tǒng)疫苗中常見(jiàn)的內(nèi)毒素和其他等感染風(fēng)險(xiǎn)。此外,mRNA疫苗進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)即可表達(dá),無(wú)需進(jìn)入細(xì)胞核,不會(huì)產(chǎn)生DNA疫苗存在的基因組突變的風(fēng)險(xiǎn),其安全性優(yōu)于DNA疫苗和病毒活載體疫苗。且不同于傳統(tǒng)疫苗動(dòng)輒數(shù)年甚至數(shù)十年的研發(fā)周期,mRNA疫苗的研發(fā)速度也遠(yuǎn)超于其他疫苗,這種極短的研發(fā)周期對(duì)攻克具有高突變率特點(diǎn)的病毒來(lái)說(shuō),具有重要意義。但是,mRNA疫苗的研發(fā)也存在一些問(wèn)題。由于知識(shí)產(chǎn)權(quán)分散,mRNA疫苗通常是由不同部門(mén)的許多參與者共同完成的,這種多頭合作會(huì)增加溝通成本,降低mRNA疫苗研發(fā)效率[67]。此外,雖然使用LNP可以提高mRNA遞送效率,但LNP的不穩(wěn)定性要求mRNA疫苗的儲(chǔ)存和運(yùn)輸需滿足苛刻的條件。有研究顯示,基于LNP的mRNA疫苗凍干化處理后可以在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)存,這為mRNA疫苗的儲(chǔ)存和運(yùn)輸提供了一個(gè)潛在的解決方案[68]。隨著全球合作的進(jìn)一步深化,mRNA疫苗的專利限制和技術(shù)瓶頸等問(wèn)題或許有望得到解決。

目前,雖然沒(méi)有獸用mRNA疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,但新冠 mRNA疫苗的成功上市依舊點(diǎn)燃了人們對(duì)研發(fā)獸用mRNA疫苗的熱情。我國(guó)是畜牧業(yè)大國(guó),動(dòng)物傳染病是制約我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展的重要原因,其中人畜共患病也會(huì)對(duì)人類的健康和生命財(cái)產(chǎn)安全產(chǎn)生重大影響,而接種有效的疫苗是預(yù)防和控制傳染病最有效的公共衛(wèi)生干預(yù)措施之一[69]。當(dāng)前影響畜牧業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展的主要?jiǎng)游飩魅静∪绶侵挢i瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)等,其疫苗保護(hù)效力均不理想,mRNA疫苗已在以上動(dòng)物傳染病疫苗研發(fā)中展現(xiàn)出了巨大的潛力。在此,作者將以動(dòng)物冠狀病毒和非洲豬瘟病毒為例展望mRNA疫苗在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用。

5.1 基于動(dòng)物冠狀病毒RBD區(qū)的mRNA疫苗

冠狀病毒的宿主譜廣泛,除了人類之外,還能夠感染豬、牛等家畜以及寵物犬、貓等多種動(dòng)物[70]。感染不同物種的冠狀病毒具有遺傳結(jié)構(gòu)相似性,刺突蛋白(S蛋白)是冠狀病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白,也是誘發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫的重要組成成分。S蛋白由S1和S2兩個(gè)亞基組成,S1亞基包含一個(gè)受體結(jié)合域,即RBD區(qū),負(fù)責(zé)與特定的受體結(jié)合,而S2亞基則介導(dǎo)病毒和宿主細(xì)胞膜的融合。各種證據(jù)表明,RBD區(qū)是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要靶點(diǎn),因此,這一區(qū)域也成為疫苗研發(fā)的重點(diǎn)目標(biāo)[31]。新冠肺炎大流行期間,多個(gè)公司基于新冠病毒RBD區(qū)域設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了多款mRNA疫苗,數(shù)據(jù)顯示,基于RBD區(qū)的候選疫苗,如BNT162b1、mRNA-1273等均具有良好的免疫原性[71]。

人類mRNA疫苗的成功為mRNA疫苗在獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用展示了希望。豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎及新發(fā)的豬急性腹瀉綜合征均是由冠狀病毒引發(fā)的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要胃腸道傳染病[70],常用的滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程疫苗雖然對(duì)于防控豬冠狀病毒感染起到了一定的效果,但由于冠狀病毒易發(fā)生重組或突變,常規(guī)疫苗在防控方面往往不盡如人意,研發(fā)基于豬冠狀病毒RBD區(qū)的mRNA疫苗或許將為疾病防控提供新思路。在寵物疫病方面,貓傳染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus, FIPV)是目前發(fā)生最普遍的一種由冠狀病毒變異株引起的高度致死性傳染病,目前沒(méi)有商品化的疫苗上市[72]。隨著對(duì)動(dòng)物冠狀病毒RBD和細(xì)胞表面受體認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步深入,基于RBD的mRNA疫苗將成為一種對(duì)抗新發(fā)和再發(fā)動(dòng)物冠狀病毒非常有前途的策略。

5.2 T細(xì)胞靶向的非洲豬瘟mRNA疫苗

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,所有品種和年齡的豬均可感染,發(fā)病率和死亡率最高可達(dá)100%。由于缺乏有效的疫苗,非洲豬瘟已經(jīng)蔓延到許多國(guó)家并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)2019年至今非洲豬瘟已造成近700萬(wàn)頭豬死亡[73]。國(guó)內(nèi)外科研人員雖然已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種刪除了毒力基因的ASFV減毒活疫苗候選疫苗株,但這些減毒疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)嚴(yán)重依賴于原代豬肺泡巨噬細(xì)胞或骨髓細(xì)胞,既耗時(shí)又費(fèi)錢(qián)[74-76];基于結(jié)構(gòu)蛋白設(shè)計(jì)的重組蛋白疫苗,雖會(huì)誘導(dǎo)出相應(yīng)中和抗體,并延遲臨床癥狀,但中和抗體無(wú)法提供充分的保護(hù)。研究證明T細(xì)胞在 ASFV 的抗病毒免疫和保護(hù)中發(fā)揮重要作用。近期,科研人員利用iVAX計(jì)算疫苗設(shè)計(jì)平臺(tái),在ASFV編碼的蛋白質(zhì)中鑒定出高度保守的細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位[77-78],開(kāi)發(fā)了一種含有預(yù)測(cè)的豬MHCⅠ類和Ⅱ類表位的T細(xì)胞靶向ASF DNA疫苗,并正在評(píng)估這種新型疫苗的免疫原性[79-81]?？紤]到DNA疫苗存在整合到宿主基因組的潛在風(fēng)險(xiǎn),基于mRNA的疫苗方法有可能促進(jìn)安全有效ASF疫苗的改進(jìn)。ASFV為大型雙鏈DNA病毒,基因組大小為170～194 kb,含有150～167個(gè)開(kāi)放閱讀框,編碼150～200種蛋白質(zhì),目前仍有一半以上的ASFV編碼蛋白功能尚不清楚。隨著研究的逐漸深入,更多潛在的T細(xì)胞表位將被挖掘,為開(kāi)發(fā)具有更大表位范圍的T細(xì)胞靶向mRNA疫苗提供了廣闊前景。