醫(yī)用小型豬選育方法和應(yīng)用進(jìn)展

連玉舉,張致遠(yuǎn),廖曉波,魏紅江,印遇龍*,劉 梅*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長沙 410128;2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院胸心外科,長沙 410011;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 云南省小型豬基因編輯與異種器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650201)

模式動(dòng)物是指科學(xué)家用特定的動(dòng)物物種,揭示某種具有普遍規(guī)律的生命現(xiàn)象或藥物作用的一類動(dòng)物[1]。在人類疾病研究中,使用合適的動(dòng)物模型是至關(guān)重要的。嚙齒動(dòng)物,如小鼠、大鼠等都是常用的模式動(dòng)物。但由于遺傳及解剖學(xué)差異,這些模式動(dòng)物并不能完全反映人類病理生理特征,尋找新的更合適的模型是重要的研究思路之一。大量研究表明,小型豬在生理學(xué)、解剖學(xué)、營養(yǎng)代謝、藥物代謝和疾病發(fā)展等方面相較于嚙齒類動(dòng)物與人類更相似[2-3]。且小型豬與人類共同擁有大量與肥胖、糖尿病、閱讀障礙癥、帕金森病和阿爾茨海默病等疾病相關(guān)的遺傳變異[4]。由此可見,小型豬作為醫(yī)用模式動(dòng)物應(yīng)用于人類疾病研究中有著巨大的潛在價(jià)值。但是醫(yī)用小型豬的系統(tǒng)性綜述還較少。因此,本文將系統(tǒng)綜述小型豬的生物學(xué)特性、品種資源及選育方法,分析目前國內(nèi)外小型豬的研究現(xiàn)狀及主要應(yīng)用進(jìn)展,以期相關(guān)領(lǐng)域的同行系統(tǒng)了解醫(yī)用模式動(dòng)物及選育方法進(jìn)展,明晰中國小型豬的種質(zhì)資源保護(hù)及開發(fā)為醫(yī)用模式動(dòng)物的重要性,推動(dòng)小型豬研究在醫(yī)用模式動(dòng)物領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展。

1 小型豬生物學(xué)特性

小型豬(miniature pig)屬于哺乳綱、偶蹄目、野豬科、豬屬、豬種動(dòng)物,染色體數(shù)目2n=38。小型豬品種眾多,由于遺傳背景、地緣環(huán)境等因素的不同造成了生長和繁殖性能的差異。小型豬抗逆性強(qiáng),對(duì)不良的生態(tài)和飼料條件有很強(qiáng)的適應(yīng)能力,對(duì)飼料要求簡單,飼養(yǎng)較粗放,自然環(huán)境下平均壽命超過10年,在15年左右[5]。小型豬和微型豬按照體重進(jìn)行區(qū)分,一般12月齡體重為45～65 kg的豬為小型豬,12月齡體重在25～35 kg的豬稱為微型豬。

1.1 解剖學(xué)差異比較

小型豬與人類在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)有很大的相似之處。圖1展示了小型豬與人類的內(nèi)臟結(jié)構(gòu)對(duì)比,在心血管系統(tǒng)中,小型豬心臟的形狀、解剖結(jié)構(gòu),大動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)和位置關(guān)系,血流動(dòng)力學(xué)特征及調(diào)節(jié)方式都與人類極為相似;此外,小型豬的冠狀動(dòng)脈也由單獨(dú)發(fā)出的左冠脈系統(tǒng)及右冠脈系統(tǒng)構(gòu)成,且大多數(shù)為右冠優(yōu)勢(shì)型,冠脈的走形、分布及營養(yǎng)心肌的范圍與人類基本一致[6-7]。在消化系統(tǒng)上,有研究表明4月齡的五指山小型豬胃的形態(tài)以及十二指腸長度與人基本相似[7],其肝的大小雖有差異,但是肝的橫徑、縱徑和厚度與人類基本一致[7]。在泌尿系統(tǒng)中,小型豬腎的大小與人類近似一致。廣西巴馬小型豬的輸尿管略呈紆曲狀,起始部位較粗,而后逐漸變細(xì),連接膀胱處最細(xì);人類的輸尿管有3個(gè)狹窄處,與廣西巴馬小型豬略有差異[6]。在皮膚類疾病的研究中,小型豬與非人靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有等同作用,鄭必祥等[8]通過對(duì)比巴馬小型豬與人的背部全層皮膚,發(fā)現(xiàn)二者的真皮厚度、表皮厚度近乎一致。此外,小型豬脖子和腿的活動(dòng)范圍有限,不能舔或撓它們自身的背,這相較于嚙齒類、非人靈長類等模式動(dòng)物具有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖1 豬與人的解剖平面圖Fig.1 Comparison for anatomical plane of pig and human

小型豬相較于嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和非人靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,雖然不如嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體型小、生長快、便于實(shí)驗(yàn)操作,但也存在一些作為模式動(dòng)物不可替代的優(yōu)勢(shì)。與嚙齒類動(dòng)物相比,小型豬和人的親緣關(guān)系更近。在器官大小和生理構(gòu)造上,小型豬可以補(bǔ)充許多嚙齒類動(dòng)物不適合開展的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)。例如,大鼠因沒有膽囊而無法開展的部分消化試驗(yàn);大鼠因食管與胃小彎的褶皺能阻止胃內(nèi)容物反流而不能進(jìn)行的嘔吐試驗(yàn)[9]。小鼠因皮膚無汗腺,依賴尾巴的四根血管調(diào)節(jié)溫度。豚鼠的心臟前端有出入心臟的大血管,與人類的心臟結(jié)構(gòu)差異較大。再者,嚙齒類動(dòng)物生命周期較短,無法充分模擬一些病程長的疾病,而小型豬則更適合。世界各國食品和藥物管理局規(guī)定,新藥臨床試驗(yàn)之前,必須在至少一種非嚙齒類大動(dòng)物(通常為猴、犬、豬)上進(jìn)行安全性及毒性評(píng)估[10]。與非人靈長類動(dòng)物相比,雖然非人靈長類動(dòng)物是進(jìn)化史上與人類親緣關(guān)系最近的類群,在認(rèn)知能力、繁殖和生育等方面與人類具有高度同源性。但是非人靈長類動(dòng)物資源相對(duì)匱乏,造成實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高,加上對(duì)其進(jìn)行遺傳修飾的技術(shù)只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室掌握,還需要考慮諸多倫理問題,相比之下小型豬遺傳資源和數(shù)量更豐富,更易于廣泛應(yīng)用。

1.2 生理學(xué)特點(diǎn)及血液生理生化指標(biāo)分析

小型豬為全年多發(fā)情動(dòng)物,母豬性周期為(21±2.5)d,發(fā)情持續(xù)時(shí)間平均2.4 d,妊娠期114 d左右,產(chǎn)仔數(shù)2～10頭,這相較于非人靈長類動(dòng)物可以獲得更多群體數(shù)量。小型豬正常體溫為38～40 ℃,心率55～60次·分-1,血容量占體重的3.5%～5.6%,心排血量3.1 L·min-1,收縮壓144～185 mmHg,舒張壓98～120 mmHg,呼吸頻率12～18次·分-1,通氣率37 L·min-1,耗氣量220 mm·g-1活體重,血液pH為7.36～7.79,尿比重1.102～1.022,尿pH為6.5～7.8[9]。

血液生理生化指標(biāo)用以反映機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、免疫能力、區(qū)分不同動(dòng)物的生物學(xué)特性[11]。為探究小型豬和人體內(nèi)生理學(xué)差異,本文通過“中國知網(wǎng)”、“谷歌學(xué)術(shù)”、“PubMed”數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索、篩選剔除及整合,分別選擇五指山小型豬、巴馬小型豬、版納微型豬、哥廷根小型豬(G?ttingen)4個(gè)品種(公布數(shù)據(jù)有限,選擇年齡均為3～6月齡不等),對(duì)比血液中的蛋白質(zhì)、糖類、無機(jī)離子、酶類、脂類、非蛋白含氮類化合物等共23種血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行初步比較(表1)。不同品種的小型豬血液生理生化指標(biāo)存在差異,這可能與小型豬的品種、年齡、性別、飼養(yǎng)環(huán)境等因素有關(guān)。這也提示,有必要進(jìn)一步細(xì)化區(qū)分不同品種、不同年齡段、不同性別、不同飼養(yǎng)環(huán)境下的小型豬血液生理生化數(shù)據(jù)。同時(shí),對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),不同品種的小型豬均有與人體近似的指標(biāo),這也是小型豬作為人類疾病模型動(dòng)物的理論基礎(chǔ)。有趣的是,五指山小型豬、巴馬小型豬、版納微型豬的白細(xì)胞總數(shù)比人體正常范圍高很多,而哥廷根小型豬的數(shù)值則接近,這可能與測(cè)定豬群的微生物凈化等級(jí)、采樣過程對(duì)豬的應(yīng)激程度有關(guān)系,通常豬群發(fā)生疾病、應(yīng)激等情況下均會(huì)造成白細(xì)胞數(shù)量的增加。4種小型豬的紅細(xì)胞總數(shù)、血小板總數(shù)均遠(yuǎn)高于人,這可能是因?yàn)榉N屬差異,而較高的血小板總數(shù)也有利于通過豬種構(gòu)建血栓疾病模型。肌酸激酶與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系,4種小型豬血液中肌酸激酶與人體存在顯著差異,可能是因?yàn)榉N屬間能量代謝不同而產(chǎn)生。

表1 不同品種小型豬血液生理生化指標(biāo)與人體對(duì)比Table 1 Comparison of physiological and biochemical blood indexes of different breeds of miniature pigs with human body

2 小型豬品種介紹

2.1 國外品種

國外開展小型豬應(yīng)用研究的國家主要有美國、日本、德國和法國等。美國小型豬品系較為豐富,主要有明尼蘇達(dá)-霍麥爾品系(Minnesota Hormel)、皮特-曼摩爾品系(Pitman Moore)、海福特品系(Hanford)、尤卡坦品系(Yucatan)、奧薩博品系(Ossabaw)、辛克萊品系 (Sinclair )等;日本小型豬品系主要有阿咪尼品系(Oh mini)、克勞恩咪尼品系(Clawn mini)以及會(huì)津品系(Huei Jin);德國小型豬有哥廷根品系(G?ttingen);法國小型豬有科西嘉品系(Corsica)。表2總結(jié)了上述10種國外小型豬品系的產(chǎn)地、主要特征及應(yīng)用。不難發(fā)現(xiàn),國外小型豬的培育、開發(fā)及研究較早,已形成了多個(gè)廣泛應(yīng)用于特定疾病研究領(lǐng)域的模式豬。例如尤卡坦品系(Yucatan),具有皮膚灰暗、被毛稀少或無、性情溫和、容易肥胖等特點(diǎn),是開展皮膚實(shí)驗(yàn)[18]、構(gòu)建肥胖和糖尿病模型[19-21]的理想動(dòng)物模型。哥廷根品系(G?ttingen)具有體型小的特點(diǎn),在器官移植[22]、皮膚疾病[23]等方面應(yīng)用較多,在國際上聲名顯赫。明尼蘇達(dá)-霍麥爾品系(Minnesota Hormel)是最早的小型豬培育品系,應(yīng)用領(lǐng)域包括皮膚病[24]、腫瘤[24]、牙科[25]等。海福特品系(Hanford)的體型相比其他品系偏大,皮膚為白色,主要應(yīng)用于皮膚疾病[26]領(lǐng)域?？莆骷纹废?Corsica)主要應(yīng)用于放射性研究[27]。日本的阿咪尼品系(Oh mini)、克勞恩咪尼品系(Clawn mini)以及會(huì)津品系(Huei Jin)的生物學(xué)特性、應(yīng)用方面均較為相似,主要包括藥物代謝、皮膚疾病、心血管疾病等[28]方面,克勞恩咪尼品系(Clawn mini)的應(yīng)用相比其他兩個(gè)品系更加廣泛,推測(cè)這可能跟遺傳背景、飼養(yǎng)數(shù)量有關(guān)。

表2 國外小型豬品種情況Table 2 Foreign breeds of miniature pigs

2.2 國內(nèi)品種

目前國內(nèi)的小型豬品種主要有五指山豬、貴州的香豬(包括從江香豬、劍白香豬、環(huán)江香豬)、廣西巴馬香豬、迪慶藏豬、蕨麻豬等地方品種,以及五指山小型豬近交系、巴馬小型豬、中國實(shí)驗(yàn)用小型豬、版納微型豬近交系(來源于滇南小耳豬)、合作小型豬等培育的小型豬新品系。表3總結(jié)了我國主要的8種小型豬的產(chǎn)地、主要特征及應(yīng)用。通過與國外小型豬對(duì)比發(fā)現(xiàn),我國成年小型豬具有體型小、性成熟早、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用范圍主要在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、異種移植、藥理學(xué)、毒代動(dòng)力學(xué)、皮膚疾病等方面。其中,版納微型豬近交系在2005年便通過國家鑒定委員會(huì)鑒定,報(bào)道稱該版納微型豬是世界上第一個(gè)大型哺乳動(dòng)物近交系,其系譜完整,數(shù)據(jù)可靠,遺傳背景清晰,基因高度純合,個(gè)體之間近乎零差異,是異種器官移植的優(yōu)質(zhì)材料[29-30],巴馬小型豬在構(gòu)建糖尿病、肥胖等方面表現(xiàn)出較短的高糖高脂誘導(dǎo)時(shí)間[31]。

表3 國內(nèi)小型豬品種情況Table 3 Domestic breeds of miniature pigs

3 小型豬的選育方法

選育遺傳背景清楚、個(gè)體差異小、微生物得到嚴(yán)格控制的品種是小型豬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的重要?dú)v程。表4總結(jié)了10種外國小型豬的遺傳背景,結(jié)合表2不難發(fā)現(xiàn),國外的地方品種缺乏體型小的特征,培育的小型豬品系多為體型大的地方品種與中國或越南的小型豬品種雜交而來。這種多品種雜交的繁育方式,使其遺傳背景非常復(fù)雜,遺傳及表型不穩(wěn)定。相比較下,我國地方小型豬品種長期在封閉環(huán)境中進(jìn)行繁育,形成了體型小、性成熟早、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)良特性。

表4 國外小型豬遺傳背景Table 4 Genetic background of foreign miniature pigs

3.1 近交系的選育

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通常要求遺傳背景清楚、個(gè)體差異小,而培育近交系和封閉群是保證遺傳質(zhì)量的重要手段。近交系的培育通常要求連續(xù)20代及以上的全同胞或親子近交,品系內(nèi)所有個(gè)體都可追溯到起源于第20代或以后代數(shù)的一對(duì)共同祖先。近交系的近交系數(shù)應(yīng)大于98.6%。近交系個(gè)體具有同源性(可追溯一對(duì)共同祖先),個(gè)體之間表型一致,是理想的實(shí)驗(yàn)材料。

以馮書堂團(tuán)隊(duì)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院)培育的五指山小型豬近交系為例,該近交系以五指山小型豬為祖系,參照近交系小鼠的培育方法,F23代近交系數(shù)達(dá)到99.3%,并建立完整系譜。該近交系培育技術(shù)路線包括近交繁育(仔母交配和全同胞交配)、近交驗(yàn)證、發(fā)掘特異等位基因、矮小型分子機(jī)理等[32-33]。該近交系通過了蛋白質(zhì)檢測(cè)、SNP位點(diǎn)分析、微衛(wèi)星標(biāo)記、特異性等位基因、皮膚移植等鑒定手段的驗(yàn)證[33]。王愛德團(tuán)隊(duì)(廣西大學(xué))培育的廣西巴馬小型豬以巴馬香豬作為零世代和原始礎(chǔ)群,育成有封閉群(A系)和近交系(B系),其中A系采用群內(nèi)隨機(jī)交配的方式(少量半同胞等近交方式)選育而成,B系在封閉群F10的基礎(chǔ)上采用全同胞繁育(少量親子交配)的方式選育而成[34]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所培育合作小型豬以合作豬為系祖,采用近親交配和異地實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化培育,培育的近交系合作小型豬是國際上首個(gè)高原型近交系小型豬[35]。合作小型豬封閉群的建立按照《實(shí)驗(yàn)用合作小型豬遺傳質(zhì)量控制》(DB62/T 4074—2019)封閉群的遺傳標(biāo)準(zhǔn)和要求,達(dá)到種群60頭,截至2021年,累計(jì)向社會(huì)生產(chǎn)提供800多頭[35]。

此外,中國農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的中國實(shí)驗(yàn)用小型豬、曾養(yǎng)志團(tuán)隊(duì)(云南農(nóng)業(yè)大學(xué))培育的版納微型豬近交系,以及甘世祥團(tuán)隊(duì)(貴陽中醫(yī)學(xué)院)培育的貴州香豬(自然選育)等新培育品系,同樣應(yīng)用潛能巨大。

3.2 小型豬的微生物凈化

小型豬的生物凈化技術(shù)主要包括剖腹產(chǎn)、仔豬寄養(yǎng)、隔離、體外受精-胚胎移植等[9]。采用的凈化技術(shù)路線是檢測(cè)排除垂直傳播病原—篩選妊娠母豬—剖腹產(chǎn)或子宮切除—胎兒隔離器飼養(yǎng)—SPF級(jí)過渡飼養(yǎng)—清潔級(jí)飼養(yǎng)[36]。傳統(tǒng)生物凈化技術(shù)存在垂直傳播病原難凈化、人工哺乳技術(shù)差異大、代乳母豬拒哺乳等問題。體外受精-胚胎移植技術(shù)具備病原體凈化、拒哺乳風(fēng)險(xiǎn)低、人為控制時(shí)間等優(yōu)點(diǎn),主要包括激素超排、體外受精、胚胎移植等流程。由于豬的子宮頸深,有很多褶皺,胚胎移植一般采用手術(shù)法。但是開創(chuàng)性手術(shù)會(huì)給受體母豬造成不同程度的創(chuàng)傷,往往后代成活率較低。因此,小型豬體外受精-胚胎移植技術(shù)仍然需要不斷優(yōu)化,比如改進(jìn)手術(shù)過程中的無菌操作流程以及輸入胚胎的方法等。在實(shí)際生產(chǎn)中,還要參照GB 14925—2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》和各地方微生物控制標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定,把生物安全防控制度化、常態(tài)化,保持病原體不侵入環(huán)境中。

小型豬的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化,在控制遺傳質(zhì)量的同時(shí),更重要的是進(jìn)行微生物凈化。例如哥廷根小型豬經(jīng)過30余年的微生物凈化,其高潔凈度為實(shí)驗(yàn)工作的開展奠定了重要基礎(chǔ),這是我國小型豬所缺乏的。

3.3 基因工程選育

自1985年Hammer等[37]成功培育世界上首例轉(zhuǎn)基因豬開始,基因修飾技術(shù)在豬育種中被廣泛應(yīng)用,但是不同的基因修飾技術(shù)有著不同的優(yōu)缺點(diǎn)。顯微注射法存在外源基因插入位點(diǎn)隨機(jī)性(位置效應(yīng)),基因表達(dá)不穩(wěn)定,但是因其外源基因的轉(zhuǎn)移率和整合效率高等優(yōu)點(diǎn),通常作為轉(zhuǎn)基因技術(shù)的常規(guī)操作[38]。而核移植轉(zhuǎn)基因的方法是在細(xì)胞水平的改造,可以避免位置效應(yīng),但是存在效率低,需要大量的卵母細(xì)胞和受體動(dòng)物等問題[39]。使用鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)等基因編輯工具可以對(duì)基因組定點(diǎn)修飾,但是ZFN存在制備工藝復(fù)雜、毒性大、脫靶嚴(yán)重、成本高等問題[40-41]。TALEN識(shí)別域序列至少2 kb,設(shè)計(jì)構(gòu)建難度大[38-39]。CRISPR/Cas9技術(shù)具有成本低、適用編輯范圍廣、打靶效率高、操作簡單、可支持多位點(diǎn)操作等諸多優(yōu)點(diǎn)[42-44],近年來CRISPR/Cas9 技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。Whitworth等[45]利用CRISPR/Cas9技術(shù)培育的CD163基因編輯豬在攻毒實(shí)驗(yàn)中可完全抵抗 PRRSV感染,在疾病凈化中具有重要的價(jià)值。Shi等[46]應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得的BMP15 基因編輯大白豬,表現(xiàn)出高產(chǎn)潛能。

由于第一代轉(zhuǎn)基因豬呈雜合子狀態(tài),整合位點(diǎn)位置和數(shù)量、基因拷貝數(shù)大多不同,外源基因在不同個(gè)體中會(huì)產(chǎn)生不同的表達(dá)水平。每只原代F0陽性豬的基因型可能都不一樣,在不同F(xiàn)0之間自交會(huì)產(chǎn)生多位點(diǎn)整合,目的外源基因出現(xiàn)不同表達(dá)方式。因此,原代F0陽性豬只有通過選種選配,和野生型豬(背景品系的豬)交配,獲得整合位點(diǎn)相同的F1代。根據(jù)孟德爾定律,F1代中大約一半是雜合子,一半是野生型,F1代全同胞交配可以產(chǎn)生純合子基因豬和雜合子基因豬,只有純合子基因豬才不發(fā)生配子分離而能在后代中穩(wěn)定遺傳下去。

4 小型豬的應(yīng)用現(xiàn)狀分析

以“Miniature pig;Minipig;Animal models”為關(guān)鍵詞,根據(jù)PubMed 2000年至2021年發(fā)表文章數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,小型豬作為醫(yī)用模型動(dòng)物的熱度逐年上升。如圖2所示,小型豬作為模型應(yīng)用主要集中在心血管、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化代謝系統(tǒng)、腫瘤、異種器官移植、口腔;其中心血管系統(tǒng)應(yīng)用最多,并呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樾⌒拓i的心臟解剖結(jié)構(gòu)和生理生化指標(biāo)均與人類相似[47],利用小型豬作為模型研究人類心血管系統(tǒng)疾病結(jié)果更有效可靠。張燕華等[48]在構(gòu)建植入式遙測(cè)動(dòng)物模型時(shí)發(fā)現(xiàn),與比格犬和食蟹猴相比,巴馬小型豬更適合用于藥物對(duì)心血管系統(tǒng)影響的評(píng)價(jià)。因此,下文主要對(duì)小型豬在心血管系統(tǒng)方面的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行概述。

表5 國內(nèi)小型豬遺傳背景Table 5 Genetic background of domestic miniature pigs

圖2 小型豬作為模型的研究領(lǐng)域及熱度分析Fig.2 Research field and heat analysis of miniature pigs as models

4.1 心肌梗死模型

早期識(shí)別心肌缺血和建立再灌注是治療心肌梗死的基石,通過建立缺血區(qū)域的再灌注可以顯著降低死亡率和發(fā)病率[49]。心肌梗死模型的構(gòu)建主要分為:急性心肌缺血模型與慢性心肌缺血模型。

4.1.1 急性心肌缺血模型 Goetzman等[49]使用尤卡坦小型豬建立急性心肌梗死模型,根據(jù)血清代謝組學(xué),發(fā)現(xiàn)血清代謝物在缺血期間、再灌流早晚期表現(xiàn)出不同的特征,有助于識(shí)別不同的缺血和再灌注階段,對(duì)于早期識(shí)別缺血和血運(yùn)重建具有重大意義。馬國鈐[50]使用9頭滇南小耳豬建立急性心肌梗死及缺血再灌注模型,檢測(cè)心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin I,cTn-I)和心肌肌球蛋白結(jié)合蛋白C(cardiac myosin binding protei n-C, cMyBP-C)的濃度,發(fā)現(xiàn)cMyBP-C在急性心肌梗死后1 h開始升高。與cTn-I相比,cMyBP-C呈更早升高,可作為早期診斷急性心肌梗死的心肌標(biāo)志物;同時(shí),再灌注后cMyBP-C峰值提前出現(xiàn),提示再灌注可加速其降解釋放速度,可對(duì)缺血再灌注損傷、血管再通提供一定的指導(dǎo)作用。

傳統(tǒng)急性心肌梗死動(dòng)物模型主要采用開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的方法,但是該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的手術(shù)創(chuàng)傷大、病死率高。因此,更多的研究者采用了微創(chuàng)介入和電誘導(dǎo)等方法來構(gòu)建小型豬急性心肌梗死模型。例如,田毅等[51]使用巴馬小型豬,通過經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈球囊聯(lián)合凝膠海綿聯(lián)合栓塞的方法,建立了持久穩(wěn)定的急性心肌梗死小型豬模型。Liu等[52]在研究重組葡糖激酶(r-Sak)對(duì)中國實(shí)驗(yàn)微型豬的冠狀動(dòng)脈血栓形成、心肌缺血和心肌梗死的實(shí)驗(yàn)中,通過電刺激損傷小型豬的動(dòng)脈內(nèi)膜,促進(jìn)冠狀動(dòng)脈血栓形成,構(gòu)建了急性心肌梗死模型,證明了r-Sak可溶解血栓。

4.1.2 慢性心肌缺血模型 慢性心肌缺血模型的構(gòu)建方法主要包括:冠狀動(dòng)脈外慢性縮窄法、冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜增殖法、微循環(huán)栓塞法(機(jī)械栓塞法與化學(xué)損傷法)、高脂飲食法、次全結(jié)扎法等[53]。Miyagawa等[54]在G?ttingen小型豬的冠狀動(dòng)脈左前降支外放置一條凝膠縮窄器4周,來構(gòu)建慢性心肌缺血模型,評(píng)價(jià)合成前列環(huán)素激動(dòng)劑(ONO-1301SR)給藥系統(tǒng)的效應(yīng)。Lopez等[55]在研究心肌梗死病變心室壁重構(gòu)的時(shí)間演變和病理生理學(xué)的過程中,使用微型球囊造成10只尤卡坦小型豬的左前降支閉塞,構(gòu)建出慢性心肌梗死模型。傅向華等[56]采用4F導(dǎo)管超選前降支,注入塑料微球,在10只五指山小型豬中構(gòu)建慢性心肌缺血模型,且成功率為66.7%,證明了該方法的穩(wěn)定性及可重復(fù)性。Schuleri等[57]在評(píng)估哥廷根小型豬與約克郡豬作為心肌梗死后慢性心力衰竭的模型中,也是采用微型球囊造成左前降支閉塞,同樣證明哥廷根小型豬構(gòu)建的慢性心肌缺血模型具有可重復(fù)性。過多的脂肪攝入可以引起冠狀動(dòng)脈損傷,造成冠脈狹窄。劉建勛等[58]在制備慢性心肌缺血模型中使用中國實(shí)驗(yàn)小型豬,采用高脂飼料飼喂與冠脈內(nèi)皮損傷的綜合方式,加速構(gòu)建出慢性心肌缺血模型。李欣志[59]在研究痰瘀互結(jié)證的冠心病模型病理機(jī)制中,也使用了高脂飼料飼喂與冠脈內(nèi)皮損傷的綜合方式,揭示出痰瘀互結(jié)證候的演變過程。

4.2 動(dòng)脈粥樣硬化、高血脂、糖尿病模型

動(dòng)脈粥樣硬化( atherosclerosis,AS) 是誘發(fā)心腦血管疾病的主要病理原因之一[60]。頸動(dòng)脈粥樣硬化比冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、大腦動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病時(shí)間早,三者存在共同的病理基礎(chǔ)和誘因[61]。高血壓、高血脂、糖尿病是頸動(dòng)脈粥樣硬化的主要誘因,彼此間關(guān)系密切[62-64]。二型糖尿病發(fā)病期間由于糖脂代謝紊亂、P3K/AKT通路活性降低、MAPK通路被激活、血液處于慢性低度炎癥狀態(tài),造成血管內(nèi)皮被損傷、局部血管收縮、平滑肌細(xì)胞增殖與遷移、促血栓形成等后果,因此二型糖尿病大多合并頸動(dòng)脈粥樣硬化[65-66]。高血脂可引起血漿脂蛋白異常,導(dǎo)致動(dòng)脈管壁病變。高血壓可以增加頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度,導(dǎo)致動(dòng)脈彈性下降,繼而引發(fā)頸動(dòng)脈粥樣硬化。因此,動(dòng)脈粥樣硬化、高血脂、糖尿病、高血壓模型的構(gòu)建具有較多相同之處。

一般通過高脂飲食的手段來構(gòu)建AS動(dòng)物模型。例如,沈利葉等[67]在比較五指山小型豬和西藏小型豬的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病特征時(shí),發(fā)現(xiàn)通過高脂飼喂的五指山小型豬和西藏小型豬AS開始形成于16周,而斑塊成熟要在24周,腹主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈為主要病變部位。郁晨[68]在研究冠心寧片對(duì)西藏小型豬AS的作用及相關(guān)機(jī)制時(shí),采用同樣的方法構(gòu)建出AS動(dòng)物模型,并發(fā)現(xiàn)該藥發(fā)揮抗AS作用與“肝-腸”軸途徑密切相關(guān)。而潘嘉祥等[69]采用高脂飼喂結(jié)合機(jī)械損傷(微型球囊擴(kuò)張)的綜合方式,在巴馬小型豬上構(gòu)建出AS模型,冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)超聲結(jié)果顯示:AS組的狹窄率遠(yuǎn)高于對(duì)照組,血脂指標(biāo)也趨于上升水平,HE染色顯示:AS組冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜損傷嚴(yán)重。這種綜合方式能夠更快速地構(gòu)建AS模型。此外,敲除脂代謝相關(guān)基因,如低密度脂蛋白受體(LDLR),可以導(dǎo)致高脂血癥,能夠在正常飲食的狀態(tài)下形成動(dòng)脈粥樣斑塊[70]。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是脂代謝過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白之一,人PCSK9D374Y功能獲得性基因突變是一種常染色體顯性遺傳疾病,患者突變的PCSK9蛋白與低密度脂蛋白受體結(jié)合能力增強(qiáng),造成低密度脂蛋白清除能力下降,從而出現(xiàn)高膽固醇血癥。2013年,Al-Mashhadi等[71]利用基因重組的方式,將人PCSK9D374Y基因突變導(dǎo)入尤卡坦小型豬的基因組中,構(gòu)建D374Y-PCSK9轉(zhuǎn)基因豬,使尤卡坦豬表達(dá)人D374Y-PCSK9蛋白,誘導(dǎo)出嚴(yán)重的高膽固醇血癥。當(dāng)以高脂/高膽固醇飼料喂養(yǎng)時(shí),轉(zhuǎn)基因豬1年后能形成典型的冠脈粥樣斑塊。

小型豬構(gòu)建糖尿病模型通常采用高糖、高脂飼料飼喂的方法。但通過高脂飲食誘發(fā)豬糖尿病需要很長時(shí)間,而且不會(huì)表現(xiàn)出明顯的高血糖。例如,Li等[72]在使用巴馬小型豬構(gòu)建二型糖尿病時(shí),采用高脂飼料飼喂的方法,用時(shí)23個(gè)月才構(gòu)建成功。嚙齒類動(dòng)物構(gòu)建糖尿病模型通常采用高脂飼料聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)。因此,Zhao等[73]采用喂食高脂飼料并注射低劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)的方法,在24頭巴馬小型豬中成功構(gòu)建出二型糖尿病模型,成功率達(dá)到80%,其中高脂飼料飼喂時(shí)間為9個(gè)月,注射STZ誘導(dǎo)3個(gè)月。Avery等[19]使用化學(xué)物質(zhì)四氧嘧啶(Alloxan,ALX),經(jīng)過4個(gè)月的誘導(dǎo)處理,胰島素維持在255～600 mg·dL-1的血糖水平,成功構(gòu)建了4頭尤卡坦小型豬的糖尿病模型。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn),國內(nèi)外不同的小型豬對(duì)高糖、高脂飼料致糖尿病反應(yīng)的敏感度不同,應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同品種,調(diào)整高糖、高脂飼料的配方,也期待未來小型豬高糖、高脂飼料配方更加精細(xì)化,做到一品種一方案。

高血脂的模型構(gòu)建通常也是采用高脂飼料飼喂的方法,謝忠忱等[74]利用五指山小型豬構(gòu)建出高血脂癥模型,3～4個(gè)月就達(dá)到很高的血脂水平,這說明五指山小型豬對(duì)高脂飼料敏感。Atiq等[75]在研究血管性血友病因子(VWF)和因子VIII(FVIII)水平是否是內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化的生物標(biāo)志物時(shí),使用18頭哥廷根小型豬構(gòu)建出高血脂誘導(dǎo)糖尿病模型,在STZ和高脂飼料處理15個(gè)月后,出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化。

4.3 基因工程小型豬模型

基因工程小型豬動(dòng)物模型在心血管疾病、糖尿病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等研究中被廣泛應(yīng)用。載脂蛋白E(ApoE)和低密度脂蛋白受體(LDLR)基因與脂蛋白代謝、動(dòng)脈粥樣硬化有密切關(guān)系。Huang等[76]使用CRISPR/Cas技術(shù)培育了6頭ApoE和LDLR雙等位基因敲除的巴馬小型豬,顯著升高了轉(zhuǎn)基因豬血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇和載脂蛋白B的水平。隨后,Burke等[77]利用ApoE和LDLR雙等位基因敲除豬為模型,評(píng)價(jià)了苯哌酸降低血漿膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平及減輕動(dòng)脈粥樣硬化的能力。張雪等[78]使用五指山小型豬近交系,成功獲得人PCSK9基因D374Y突變體的克隆豬,可加快動(dòng)脈血管的發(fā)病進(jìn)程,比傳統(tǒng)飲食、藥物誘導(dǎo)小型豬動(dòng)脈粥樣硬化更加方便。諸多研究表明,人類PPARγ基因與很多慢性疾病有關(guān),例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、糖尿病等[79]。2020年,吳彩霞等[80]采用體細(xì)胞核移植的方法成功構(gòu)建8頭PPARγ基因過表達(dá)西藏小型豬,對(duì)人類心血管疾病、糖尿病功能基因組學(xué)研究有重要意義。GIP/GIPR軸功能受損已成為糖尿病的發(fā)病機(jī)制之一,程俊霖[81]采用體細(xì)胞核移植技術(shù)建立過表達(dá)的顯性抑制的GIPR轉(zhuǎn)基因豬,發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出糖耐量受損和胰腺發(fā)育障礙。

4.4 藥物毒理、藥效評(píng)價(jià)

隨著世界各國食品和藥物管理局規(guī)定,新藥臨床試驗(yàn)之前,必須要通過在至少一種非嚙齒類大動(dòng)物(通常為猴、犬、豬)上進(jìn)行安全性及毒性評(píng)估,小型豬在藥物安全性評(píng)價(jià)中應(yīng)用越來越廣泛。Dorandeu等[82]在研究有機(jī)磷中毒的毒代動(dòng)力學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)中,采用豬為模型,發(fā)現(xiàn)模型中出現(xiàn)不同程度的麻醉和不同類型的休克,對(duì)于評(píng)估有機(jī)磷中毒患者的麻醉和合并損傷有重要參考價(jià)值。放射性皮炎是放射治療癌癥中不可避免的副作用,Zhao等[83]通過建立Ⅳ級(jí)放射性皮炎豬模型,證實(shí)了維生素B12具有明顯的抗輻射、抗炎和抗纖維化作用。Karlsson等[84]在評(píng)估創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)藥物療效的試驗(yàn)中,使用受控皮質(zhì)沖擊裝置誘導(dǎo)豬腦損傷,環(huán)孢素連續(xù)靜脈輸液5 d,發(fā)現(xiàn)彌散張量成像和基于生物流體的生物標(biāo)志物可以作為一項(xiàng)評(píng)估環(huán)孢素治療TBI療效的指標(biāo)。在異生素測(cè)試中似乎沒有理想的物種,使用犬和非人靈長類動(dòng)物仍然是常態(tài),而小型豬也是一種可靠的非嚙齒動(dòng)物測(cè)試模型[85]。

4.5 異種器官移植

心血管疾病的死亡率高,但可用于心臟移植的同種供心數(shù)量非常有限,替代療法是研究熱點(diǎn)。隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展,基因編輯豬被廣泛應(yīng)用在性狀改良育種、人類疾病模型、藥物開發(fā)、生產(chǎn)人源蛋白、器官移植供體等方面,有可能為終末期器官衰竭患者提供無限數(shù)量的移植供體。但是,異種器官移植會(huì)存在內(nèi)源病毒跨種傳播、免疫排斥等問題。為解決該問題,2017年,云南農(nóng)業(yè)大學(xué)魏紅江教授團(tuán)隊(duì)與美國eGenesis公司楊璐菡、哈佛醫(yī)學(xué)院教授喬治·丘奇(George Church)、丹麥奧胡斯大學(xué)組建聯(lián)合課題組,用新一代基因技術(shù)打靶方法根除了豬細(xì)胞里面所有的內(nèi)源性病毒活性后,利用其成纖維細(xì)胞制造出豬胚胎,并植入母豬體內(nèi),最終在西南生物多樣性實(shí)驗(yàn)室制備出世界首批內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒被滅活的豬[29]。Ross和Coates[86]在2018年使用CRISPR-cas9技術(shù)獲取的基因編輯豬,其中所有內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒都被滅活。2022年1月7日,在美國馬里蘭州巴爾的摩,Muhammad Mohiuddin醫(yī)生和Bartley Griffith醫(yī)生領(lǐng)導(dǎo)的馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院(UMSOM)的異種心臟團(tuán)隊(duì),將經(jīng)過基因編輯的豬心臟移植到一名終末期心力衰竭患者體內(nèi),這是世界上首例成功的豬到人的異種心臟移植,這名患者接受了高劑量的免疫抑制劑治療,存活了兩個(gè)月(2022年3月8日死亡),是異種心臟移植中存活時(shí)間最長的患者[87-90]。由此可見,通過有效的基因編輯豬,有望降低異種移植的免疫排斥反應(yīng),也為通過異種器官移植解決重大疾病難題提供了良好的基礎(chǔ)。

5 總結(jié)與展望

豬作為一種大型模式動(dòng)物,無論是從解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、器官大小和生理學(xué)及生化特點(diǎn),還是從基因組等方面都與人類高度相似,可彌補(bǔ)嚙齒類模式動(dòng)物不具備的研究部分人類疾病的短板,且小型豬的繁殖能力更高,較非人靈長類模式動(dòng)物更易滿足對(duì)模式動(dòng)物群體數(shù)量的需求。因此,相較于嚙齒類動(dòng)物和非人靈長類模式動(dòng)物,豬在人類生物醫(yī)學(xué)研究中具有更大的優(yōu)勢(shì),醫(yī)用模式小型豬的開發(fā)與利用具有巨大前景。然而,我國小型豬開發(fā)應(yīng)用尚處于初始階段,依然存在著種質(zhì)資源保護(hù)力度小、近交衰退、育成品系少等問題。在近交系和封閉群中,長期近親繁殖、地域隔離、封閉群數(shù)量過小等問題均會(huì)引起遺傳漂變,雖然很多省市出臺(tái)了遺傳質(zhì)量檢測(cè)的地方標(biāo)準(zhǔn),但是還有很多小型豬品種沒有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn),建立不同品種(品系)遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)的位點(diǎn)體系是亟待解決的問題。相較于國外經(jīng)過幾十年微生物凈化選育的高清潔度小型豬,我國小型豬微生物凈化程度普遍不高。在實(shí)際生產(chǎn)中,因?yàn)槲⑸飪艋鷪?chǎng)區(qū)生物安全防控、免疫計(jì)劃、硬件設(shè)施、豬舍設(shè)計(jì)等方面都有關(guān)系,大部分養(yǎng)殖場(chǎng)不具備凈化的條件,很少能達(dá)到國家和地方關(guān)于微生物凈化的標(biāo)準(zhǔn)。而在基因工程培育中,后代成活率低和傳代遺傳不穩(wěn)定依然是突出的問題。由此可見,小型豬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化還有很長的路要走。

全球范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)用小型豬呈現(xiàn)出數(shù)量需求快速增長、質(zhì)量需求亟待提高的趨勢(shì),未來有必要充分發(fā)掘各小型豬品種的生物學(xué)特性和應(yīng)用潛能。我國可以結(jié)合心血管、代謝等重大人類疾病研究需求,通過轉(zhuǎn)基因、基因編輯、分子設(shè)計(jì)等現(xiàn)代精準(zhǔn)分子育種技術(shù)手段,培育自發(fā)性疾病模型的小型豬、定向培育特有表型的小型豬,為全面了解人類相關(guān)疾病的遺傳基礎(chǔ)和發(fā)病機(jī)制提供更好的平臺(tái),也為新的診療藥物與技術(shù)的面市做好臨床前試驗(yàn),進(jìn)而助力人類疾病的研究。