低產(chǎn)高級醇桑葚酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

廉葦佳，雷 靜，韓 琛，劉志剛，蘇含明，阿依加馬麗·加帕爾，陳 雅

（新疆農(nóng)業(yè)科學院 吐魯番農(nóng)業(yè)科學研究所，新疆 吐魯番 838000）

0 引言

桑葚為?？坡淙~喬木植物桑(MorusalbaL.)的果穗［1］，含有豐富的多糖、酸、氨基酸、維生素、微量元素和礦物質(zhì)，被醫(yī)學界譽為“21世紀的最佳保健果品”［2］，具有清除自由基、調(diào)節(jié)機體免疫功能、降血脂、抗誘變等作用［3］。桑葚酒是以桑葚為原料經(jīng)酵母菌發(fā)酵而成的果酒，市場上銷售的桑葚酒多為配制酒，發(fā)酵酒極少，存在飲后打頭、頭暈、頭痛等問題，桑葚酒中高級醇含量過高是導致容易“上頭”的主要原因之一［4］。

高級醇指3個碳以上的一元醇類物質(zhì)的總稱，其主要成分為戊醇、異戊醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、苯乙醇等［5-7］。高級醇是桑葚酒發(fā)酵過程中酵母代謝的副產(chǎn)物，是果酒重要的質(zhì)量指標［8-9］，也是酒的主要香氣成分、風味物質(zhì)之一。如果高級醇含量很低則酒的風味單薄，當含量適中時能使酒體豐滿、口感協(xié)調(diào)［10］。在陳釀、貯藏過程中，高級醇能夠轉(zhuǎn)化變成酯類，從而使酒體呈現(xiàn)特殊的陳香，給人以醇厚的感覺［11］。然而，當高級醇含量過高時，不僅會對人體產(chǎn)生不良的副作用，還會將異味帶入酒體而影響風味［12-13］。高級醇的毒性隨分子量的增大而增加，且高級醇的中毒和麻醉作用比酒精強［14-15］。據(jù)Rappa等［16］報道，當葡萄酒中高級醇總量達到300 mg/L 時，可產(chǎn)生愉快的風味，但當高級醇總量達到400 mg/L 時，則會產(chǎn)生刺激性的口感。含量過高會使酒的風味不協(xié)調(diào)，苦、澀味增加，飲后易出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)充血，進而引起劇烈的頭暈、頭痛等癥狀［12，17-18］，就是所謂的“上頭”，嚴重時對人體有毒害作用，因此，控制酒中高級醇的含量在適宜的濃度具有重要意義。

發(fā)酵因素對酵母菌細胞的生長代謝和發(fā)酵產(chǎn)物的積累具有重要影響，發(fā)酵條件直接影響著發(fā)酵產(chǎn)物的生成量［19-20］，因此可以通過調(diào)節(jié)桑葚酒發(fā)酵條件調(diào)控高級醇生成量。酵母菌種［21］、酵母接種量［22-23］、發(fā)酵溫度［24-25］、發(fā)酵醪液初始pH值［26］、發(fā)酵醪液糖度［25］等因素的改變都會導致酵母的代謝途徑和次級代謝產(chǎn)物的生成量發(fā)生變化［27-28］。發(fā)酵因素對高級醇形成的影響在啤酒、白酒、葡萄酒、白蘭地中已經(jīng)開展相關(guān)研究，但是其具體代謝途徑調(diào)控機理尚不明確。釀造過程中發(fā)酵因素對高級醇生成量的影響逐漸受到學者們的高度重視，然而不同發(fā)酵因素對高級醇生成量的影響效果不一。本研究通過優(yōu)化發(fā)酵條件來控制桑葚酒中高級醇的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑 試驗材料鮮黑桑葚于2022年5月購自新疆吐魯番市高昌區(qū)；釀酒高活性干酵母(LALVIN DV10)購自上海杰兔工貿(mào)有限公司；焦亞硫酸鉀（食品級）購自新疆頂峰進出口有限公司；白砂糖購自新疆中唐糖業(yè)有限責任公司；果膠酶購自上?？奠称凤嫎I(yè)有限公司；正丁醇、正丙醇、仲丁醇、異丁醇、異戊醇、正戊醇、異戊醇、苯乙醇等色譜純均購自上海安譜實驗科技股份有限公司，異戊醇購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 7890B型氣相色譜儀購自安捷倫科技有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZT/H 打漿機購自烏魯木齊市米東區(qū)東霸不銹鋼食品機械配件經(jīng)銷部；TP-A500型電子分析天平購自美國康州HZ電子有限公司；TD型糖度計購自上海融測電子科技有限公司；PHB-3型pH計購自上海三信儀表廠。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 桑葚酒發(fā)酵工藝流程為桑葚→選?！ブ鶶O2處理→添加果膠酶→調(diào)整糖度、酸度→接種→發(fā)酵→分離→陳釀→過濾→殺菌→灌裝。

1.2.2 操作要點 首先去除桑葚原料中的爛果、霉果以及樹枝、樹葉、石子等雜物，然后稱取500 g桑葚，用打漿機榨汁，再分別加入SO2（添加量0.03 g/kg)、果膠酶（添加量0.0225 g/kg)和酵母EC118，于20 ℃溫度下進行發(fā)酵，在發(fā)酵期間2次加入適量白砂糖，并觀察桑葚酒的發(fā)酵特性，發(fā)酵結(jié)束后測定相關(guān)指標。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計 桑葚酒的口感、風味、總高級醇含量等受到發(fā)酵溫度、酵母接種量、初始糖度、初始pH值等多種因素的影響，因此，本試驗選取酵母接種量、初始pH值、初始糖度和發(fā)酵溫度4個因素進行單因素試驗。

通過預(yù)試驗，在酵母接種量為0.25 g/kg、pH值為3.5、發(fā)酵溫度為22 ℃、初始糖度為22%的條件下，保持其他條件不變，只改變其中1個因素，以感官評分、總高級醇含量為指標，以發(fā)酵時間、酒精度、總糖和總酸為輔助指標，研究不同單因素對桑葚酒感官品質(zhì)、總高級醇含量的影響。單因素試驗設(shè)置酵母接種量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg，pH值分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，初始糖度分別為18%、20%、22%、24%、26%，發(fā)酵溫度分別為18、20、22、24、26 ℃，

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 選取酵母接種量、初始pH值、初始糖度、發(fā)酵溫度為主要影響因素，以高級醇含量作為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，各因素水平編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平和編碼表

1.2.5 測定指標與方法

1.2.5.1 指標測定 使用折光糖度計測定初始糖度；依據(jù)《葡萄酒、果酒通用分析方法》(GB/T 15038—2006)［29］測定酒精度；參照《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標準的分析方法》(GB/T 5009.48—2003)［30］中的氣相色譜法測定高級醇含量；參照《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》(GB 12456—2021)［31］中的酸堿滴定法測定總酸含量；參照《食品安全國家標準食品中總糖的測定》(GB 5009.7—2016)［32］中的斐林試劑法測定總糖含量。

1.2.5.2 桑葚酒感官品質(zhì)評定 參照T/CNFIA 104—2018［22］中桑葚（果）酒的品評標準，以外觀、香氣、滋味、典型性4個指標，對桑葚酒的感官品質(zhì)進行綜合評價，滿分為100分。由10名專業(yè)品評人員組成品評小組，進行感官評定，去掉1個最高分和1個最低分后，取其平均分四舍五入取整數(shù)作為感官評分。桑葚酒感官品質(zhì)評定標準如表2所示。

表2 桑葚酒感官品質(zhì)評定標準

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 本研究所有試驗和指標測定均進行3次，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。采用Excel 2007和SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理與回歸分析；采用 Design Expert 8.0.6 軟件進行作圖和響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酵母不同接種量對桑葚酒品質(zhì)的影響 由表3可以看出，隨著酵母接種量的增大，桑葚酒發(fā)酵時間縮短，酒精度增大，總糖含量降低，這是因為酵母接種量越大，酵母繁殖越迅速，進而縮短了發(fā)酵時間，消耗了更多的糖用于產(chǎn)生酒精，導致發(fā)酵后桑葚酒中總糖含量降低。酵母接種量的增大對桑葚酒總酸含量的影響不顯著。酵母接種量的增大對桑葚酒高級醇含量表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢。高級醇是酵母在發(fā)酵過程中合成細胞蛋白質(zhì)的副產(chǎn)物，當接種量增大時，起初酵母增殖倍數(shù)小，合成的高級醇較少，隨著酵母接種量的繼續(xù)增大，酵母增殖倍數(shù)不再變化或者變化很小，合成的高級醇增加［33］。當酵母接種量為0.2和0.3 g/kg時，桑葚酒的風味口感最好，感官評分較高，分別為79.00、80.00分。

表3 酵母接種量對桑葚酒品質(zhì)的影響

2.1.2 不同初始pH值對桑葚酒品質(zhì)的影響 由表4可知，隨著初始pH值的增大，酒精度呈現(xiàn)出明顯的先升高后降低的趨勢，因為酵母在適宜的pH值下才能充分活化，過高的初始pH值會抑制酵母活化，導致酒精度下降，較適宜的初始pH值為3.5時，此時產(chǎn)生的酒精度最高,為11.40，總糖含量最低，為12.40%；當初始pH值為3.0和3.5時，總酸含量較大，分別為8.90、8.40 g/L；初始pH值的增大對高級醇含量的影響不顯著，但其值總體偏高；初始pH值的增大對感官評分的影響也不顯著，當初始pH值為3.0和3.5時，感官評分較高，分別為85.00、86.00分。

表4 初始pH值對桑葚酒品質(zhì)的影響

2.1.3 不同初始糖度對桑葚酒品質(zhì)的影響 由表5可知，初始糖度的增加對桑葚酒發(fā)酵時間的影響明顯，隨著初始糖度的增大，發(fā)酵時間整體呈縮短的趨勢。當初始糖度介于18%～24%時，對酒精度的影響顯著，且其值逐漸增大；當初始糖度介于22%～26%時，酒精度增高的趨勢變緩，同時在該范圍內(nèi)總糖含量增大趨勢明顯，說明初始糖度超過22%時，可能導致發(fā)酵液的糖度過高，究其原因一方面是酵母所需底物過剩，另一方面是糖度過大導致發(fā)酵液滲透壓升高，進而抑制了酵母的活性，使發(fā)酵變緩，同時還會引起其他一些副反應(yīng)，最終導致桑葚酒口感下降。不同初始糖度對總酸含量的影響不顯著。當初始糖度介于18%～22%時，高級醇含量呈先升高后降低的趨勢；當初始糖度介于22%～26%時，高級醇含量顯著升高。隨著初始糖度的增大，桑葚酒的醇厚味及口感逐漸變好然后下降，當初始糖度介于20%～24%時，桑葚酒的口感較醇厚綿長，感官評分較高。

表5 初始糖度對桑葚酒品質(zhì)的影響

2.1.4 不同發(fā)酵溫度對桑葚酒品質(zhì)的影響 由表6可知，發(fā)酵溫度越高，桑葚酒發(fā)酵時間越短，酒精度越高。當發(fā)酵溫度在20～26 ℃時，酒精度均在10% vol以上，符合桑葚果酒酒精度的要求；當發(fā)酵溫度在22、24 ℃時，桑葚酒中總糖含量較高，分別為23.50%、22.30%；隨著發(fā)酵溫度的升高，總酸含量變化不顯著；隨著發(fā)酵溫度的升高，高級醇含量呈先降低后升高的趨勢，當發(fā)酵溫度在18～22℃時，高級醇含量較低；隨著發(fā)酵溫度的升高，桑葚酒的感官評分呈先升高后降低的趨勢，當發(fā)酵溫度在20～24 ℃時，桑葚酒口感、滋味、香氣等指標均較好。

表6 發(fā)酵溫度對桑葚酒品質(zhì)的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚酒發(fā)酵工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以桑葚酒中高級醇含量為響應(yīng)值，選用酵母接種量、初始pH值、初始糖度和發(fā)酵溫度4個因素進行4因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.2.1 模型的建立與分析 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，經(jīng)Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件設(shè)計出的29個桑葚酒發(fā)酵工藝試驗方案及結(jié)果如表7所示。

表7 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6 統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到高級醇含量(Y)對自變量酵母接種量(A)、初始pH值(B)、初始糖度(C)、發(fā)酵溫度(D)之間的二次多項回歸模型為：

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 由高級醇響應(yīng)面回歸模型方差分析（表8）可以看出：回歸方程的模型擬合程度好，由這4個因素及其二次項能較好地預(yù)測試驗結(jié)果。對于模型來說，F(xiàn)值為266.36，P＜0.0001，表示擬合獲得的回歸模型極顯著，回歸模型與實測值擬合程度好，可信度高，可用該回歸方程替代試驗真實點值對試驗結(jié)果進行分析。失擬項的F值為1.37，P=0.4090(P＞0.05)，即失擬項不顯著，說明該回歸方程能夠充分反映實際情況。模型的決定系數(shù)R2=0.9963，校正決定系數(shù)R2adj為0.9925，為總變異的1.53%，說明試驗值與模型回歸值一致性良好，該模型能夠解釋0.9925的響應(yīng)值變化，試驗誤差較小，可以用此模型分析并預(yù)測桑葚酒發(fā)酵過程中高級醇的含量。上述回歸方程各項方差分析結(jié)果表明：酵母接種量、初始糖度、發(fā)酵溫度、酵母接種量與初始糖度的交互、初始pH值與發(fā)酵溫度的交互、初始糖度與發(fā)酵溫度的交互對桑葚酒高級醇含量的影響極顯著；初始pH值對桑葚酒高級醇含量的影響不顯著。C2和D2的P值均小于0.01，說明C2和D2對桑葚酒高級醇含量均有極顯著的影響；初始pH值與初始糖度的交互和B2的P值均小于0.05，說明初始pH值與初始糖度的交互和B2對桑葚酒高級醇含量均有顯著影響。

表8 高級醇含量回歸模型方差分析及顯著性檢驗

2.2.3 響應(yīng)面分析 由圖1和圖2可以看出，各因素間交互作用的響應(yīng)曲面圖上均存在最優(yōu)值，其中酵母接種量、初始糖度、發(fā)酵溫度、酵母接種量與初始糖度交互、初始pH值與發(fā)酵溫度交互、初始糖度與發(fā)酵溫度交互的側(cè)剖面圖弧度比初始pH值的側(cè)剖面弧度更大，說明酵母接種量、發(fā)酵溫度和初始糖度對模型的影響比初始pH值大。由圖1可知，初始糖度分別和酵母接種量、發(fā)酵溫度的等高線圖更接近于橢圓，且其響應(yīng)面圖陡峭，說明初始糖度與兩者的交互作用極顯著，桑葚酒高級醇含量隨著初始糖度和酵母接種量的增加而增加，當高級醇含量達到極值后，又隨著初始糖度和酵母接種量的增加而逐漸降低；初始pH值與發(fā)酵溫度的等高線圖也接近于橢圓，且其響應(yīng)面圖陡峭，初始糖度與發(fā)酵溫度的交互作用極顯著，桑葚酒高級醇含量隨著初始pH值與發(fā)酵溫度的增加而增加，當高級醇含量達到極值后，又隨著初始pH值與發(fā)酵溫度的增加而逐漸降低；初始pH值與初始糖度交互的等高線圖接近于橢圓，其響應(yīng)面圖較陡峭，說明初始pH值與初始糖度的交互作用顯著。由圖2可知，6個響應(yīng)面圖中均存在響應(yīng)值的最優(yōu)值，所選擇的試驗范圍屬于極值附近的小范圍，符合響應(yīng)面適用條件，6個響應(yīng)面圖側(cè)剖面的弧度顯示酵母接種量、初始糖度和發(fā)酵溫度的弧度均較大；酵母接種量和初始pH值、酵母接種量和發(fā)酵溫度這2個交互作用的等高線圖趨近圓形，說明其對桑葚酒高級醇含量模型的影響不大。

圖1 各因素間的交互作用對桑葚酒高級醇含量影響的等高線圖

圖2 各因素間的交互作用對桑葚酒高級醇含量影響的響應(yīng)曲面圖

2.2.4 桑葚酒發(fā)酵最優(yōu)工藝和驗證試驗 通過Box-Behnken試驗，根據(jù)Design Expert 8.0.6.統(tǒng)計軟件分析優(yōu)化得到基于高級醇含量響應(yīng)面模型的桑葚酒最佳發(fā)酵工藝為：酵母接種量0.21 g/kg，初始pH值3.07，初始糖度22.12%，發(fā)酵溫度22.06 ℃，在該工藝條件下，桑葚酒高級醇含量為306.988 mg/L。結(jié)合實際條件，將發(fā)酵工藝條件調(diào)整為：酵母接種量0.2 g/kg，初始pH值3.1，初始糖度22%，發(fā)酵溫度22 ℃，進行3次平行驗證試驗，得到桑葚酒高級醇含量為308 mg/L，與預(yù)測值的相對偏差在1%以內(nèi)，表明本試驗建立的響應(yīng)面法優(yōu)化模型能夠很好地預(yù)測桑葚酒發(fā)酵的高級醇含量，本研究得到的工藝條件客觀合理。

孫時光［4］采用單因素試驗與L9(34)正交試驗對桑葚果酒的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，在初始糖濃度21°Brix、發(fā)酵溫度25 ℃、酵母接種量7%的最佳發(fā)酵條件下，桑葚果酒高級醇含量較低，為 325.49 mg/L；羅惠波等［34］通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗調(diào)控了桑葚酒中高級醇的生成量，在初始pH值3.8、發(fā)酵溫度24 ℃、酵母接種量8.0×106cell/mL的最佳工藝條件下，高級醇的生成量為357.06 mg/L，與常規(guī)發(fā)酵條件下的生成量相比降低了13.07 %；William等［35］采用Box-Behnken設(shè)計，研究了在發(fā)酵溫度25 ℃、pH值4、接種量10%(v/v)和糖度26%的優(yōu)化發(fā)酵條件下桑葚酒高級醇濃度為249.91 mg/L。本試驗低產(chǎn)高級醇桑葚酒最佳發(fā)酵工藝與上述桑葚酒發(fā)酵工藝均不同，主要為地域、氣候、土壤、環(huán)境、品種、桑葚原料蛋白質(zhì)、糖類含量、代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化途徑、工藝參數(shù)等的差異，且發(fā)酵所用酵母菌的種類和數(shù)量也不一樣，進而導致在桑葚酒發(fā)酵過程中降低高級醇含量的工藝也不同。

3 結(jié)論

本研究采用以高級醇含量為響應(yīng)值的響應(yīng)曲面法優(yōu)化了桑葚酒發(fā)酵的最優(yōu)條件，結(jié)合實際條件并通過驗證試驗得到桑葚酒的最佳發(fā)酵工藝條件為：酵母接種量0.2 g/kg，初始pH值3.1，初始糖度22%，發(fā)酵溫度22 ℃，在該條件下發(fā)酵桑葚酒的高級醇含量為308 mg/L，預(yù)測結(jié)果與驗證結(jié)果相差0.33%，表明優(yōu)化桑葚酒高級醇含量的數(shù)學模型建立成功，與常規(guī)發(fā)酵工藝相比，高級醇含量降低了31.55%。因此，將響應(yīng)曲面法應(yīng)用于優(yōu)化桑葚酒調(diào)控高級醇最優(yōu)發(fā)酵工藝條件，能夠獲得真實可靠的結(jié)果，可用于指導生產(chǎn)實踐。