基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用機(jī)制Δ

王勝杰,郭 軍,洪志明,王 全,曾楊玲,陳子龍,邱俊峰,翁浩偉

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州 510006; 2.深圳市中醫(yī)院男科,廣東 深圳 518033; 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 深圳 518033; 4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院男科,北京 100091)

少弱精子癥是當(dāng)前男性不育癥的重要病因之一。目前的研究結(jié)果表明,少、弱精子癥在男性不育癥中占33%,因其發(fā)病機(jī)制尚不明確,臨床上亦缺乏確切有效的治療手段[1]。在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中,少弱精子癥多屬于“精少”“精薄”等疾病范疇,其核心病機(jī)在于腎精虧損,生殖機(jī)能減退,導(dǎo)致生精無(wú)源。少弱精子癥的中醫(yī)治療以補(bǔ)腎健脾為基本原則,溫養(yǎng)陽(yáng)氣、滋補(bǔ)精血為重要手段[2]。前期研究結(jié)果表明,蓯蓉益腎顆粒溫陽(yáng)益腎、滋陰填精、補(bǔ)固腎氣,可以提高精子密度、精子活力及成活率,顯著改善少弱精子癥患者的精子質(zhì)量,具有一定的臨床療效[3]。本研究將基于中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具——BATMAN-TCM在線分析平臺(tái),采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,從生物分子水平探討蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 活性成分獲取及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以“肉蓯蓉”“巴戟天”“菟絲子”“五味子”“茯苓”和“車(chē)前子”為關(guān)鍵詞,從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索蓯蓉益腎顆粒的藥物成分,并以預(yù)測(cè)評(píng)分≥25% 、P>0.05為限制條件,篩選出藥物中的活性成分并預(yù)測(cè)與活性成分相關(guān)的作用靶點(diǎn)。

1.2 藥物-疾病作用靶點(diǎn)的篩選

以“oligospermia”“asthenospermia”為關(guān)鍵詞,從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM)數(shù)據(jù)庫(kù)和PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索少精子癥與弱精子癥的疾病靶點(diǎn),利用MLC在線工具將收集到的疾病靶點(diǎn)與“1.1”中得到的藥物作用靶點(diǎn)相互交集,以獲取蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的潛在靶點(diǎn),并繪制相應(yīng)的韋恩圖。

1.3 靶點(diǎn)間相互作用分析

將獲取到的靶點(diǎn)導(dǎo)入String平臺(tái),物種限定選擇為“人(Homo sapiens)”的選項(xiàng),并對(duì)共有基因構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò),然后將綜合得分>0.9的潛在靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape v3.9.0軟件進(jìn)行圖形化展示,并應(yīng)用CytoNCA、CytoHubba插件,篩選出綜合向心度排序居前10位的靶點(diǎn)基因作為蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心靶點(diǎn)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將“1.2”中收集到的蓯蓉益腎顆粒有效成分及成分相關(guān)靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò),節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接代表各因素間的相互作用。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析

設(shè)定閾值P<0.05,利用Hiplot可視化平臺(tái)對(duì)核心靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并繪制柱狀圖與氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分獲取及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

從BATMAN-TCM分析平臺(tái)中篩選出的預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)共701個(gè),與預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)相關(guān)的有效成分共101種,其中β-谷甾醇(beta-sitosterol)、松果菊苷(echinacoside)和類(lèi)葉升麻苷(acteoside)為蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心活性成分。

2.2 藥物作用靶點(diǎn)的篩選

從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)和PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索少精子癥與弱精子癥的疾病靶點(diǎn),利用MLC在線工具將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)收集到的疾病靶點(diǎn)取并集后,獲得與少弱精子癥相關(guān)的作用靶點(diǎn)共859個(gè)。將上述疾病靶點(diǎn)與“1.1”中獲取到的701個(gè)預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)相互交集并繪制韋恩圖,最后獲取蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的靶點(diǎn)基因共69個(gè),見(jiàn)圖1、表1。

圖1 蓯蓉益腎顆粒和少弱精子癥的靶點(diǎn)基因韋恩圖Fig 1 Venn diagram of target genes of Congrong Yishen granules and oligospermia and asthenospermia

表1 蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的靶點(diǎn)基因Tab 1 Target genes of CRYSG in the treatment of oligospermia and asthenospermia

2.3 靶點(diǎn)間相互作用分析

將獲取的69個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隨tring平臺(tái),構(gòu)建共有基因的PPI網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖2;然后將綜合評(píng)分>0.9的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行圖形化展示,見(jiàn)圖3。同時(shí)調(diào)用CytoNCA、CytoHubba插件,篩選出綜合向心度排序居前10位的靶點(diǎn)基因作為蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心靶點(diǎn),具體包括胰島素基因(INS)、腫瘤壞死因子(TNF)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2(PTGS2)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、基質(zhì)金屬肽酶9(MMP9)、過(guò)氧化物酶基因(CAT)、腫瘤蛋白p53(TP53)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、雌激素受體1(ESR1)和干擾素γ基因(IFNG)。

圖2 蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 PPI network of related targets of Congrong Yishen granules in the treatment of oligospermia and asthenospermia

圖3 蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network of core targets of Congrong Yishen granules in the treatment of oligospermia and asthenospermia

2.4 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將“1.2”中收集到的蓯蓉益腎顆粒有效成分及成分相關(guān)靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件,構(gòu)建藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖4。

紫色原點(diǎn)為藥物-蓯蓉益腎顆粒,綠色原點(diǎn)為有效活性成分,藍(lán)色原點(diǎn)為預(yù)測(cè)靶點(diǎn),紅色原點(diǎn)代表疾病-少弱精子癥,黑邊代表靶點(diǎn)間的互相作用關(guān)系the purple point represents the drug-Congrong Yishen granules, and the green points represent the active component. The blue points represent the predicted target, the red points represent the oligospermia and asthenospermia, and the black edges represent the interaction among different targets圖4 蓯蓉益腎顆粒的藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Drug-active component-target-disease network of Congrong Yishen granules

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

利用Hiplot可視化平臺(tái)(https://hiplot.com.cn/)對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG生物通路富集分析,并繪制相應(yīng)的點(diǎn)狀圖和柱狀圖,見(jiàn)圖5。根據(jù)P值(P<0.005)列出前20條GO途徑,蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用機(jī)制具體涉及類(lèi)固醇代謝、類(lèi)固醇激素反應(yīng)、細(xì)胞酮代謝及調(diào)控凋亡信號(hào)通路等生物分子;KEGG通路富集分析結(jié)果提示,蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用機(jī)制主要涉及核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路及白細(xì)胞介素17信號(hào)通路等。

3 討論

《辨證錄·種嗣門(mén)》中記載:“男不能生子者有六病,一精寒,二氣衰,三精少,四痰多,五相火盛,六氣郁?！逼渲忻鞔_指出少精、弱精(精寒)是男性不育癥的重要病因之一。在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中,少弱精子癥多屬于“精少”“精薄”“精清”和“精冷”等疾病范疇,其核心病機(jī)在于腎精虧損,生殖機(jī)能減退,導(dǎo)致生精無(wú)源,男子精少精弱而不育,病因可分虛實(shí),虛則多為先天稟賦不足,或房事不節(jié),或久病及腎;實(shí)則飲食不節(jié),或瘀血阻絡(luò),精道不暢等。少弱精子癥的中醫(yī)治療以補(bǔ)腎健脾為基本原則,溫養(yǎng)陽(yáng)氣、滋補(bǔ)精血為重要手段[4]。蓯蓉益腎顆?；米浴短绞セ莘健肪矶械摹拔逦蹲油琛?由肉蓯蓉、巴戟天、菟絲子、五味子、茯苓和車(chē)前子6味藥物組成,具有補(bǔ)腎填精的功效,常用于治療腎氣不足、腰膝酸軟、記憶減退、頭暈耳鳴和四肢無(wú)力等。方中肉蓯蓉味甘酸咸,性微溫,可滋補(bǔ)元陰、填精益髓,為君藥。巴戟天辛甘,性溫益陽(yáng);菟絲子味甘性平,專(zhuān)主男子腎虛精寒,兩者合用,可壯陽(yáng)強(qiáng)精,共為臣藥。五味子味酸甘,性溫,酸溫以收斂元陽(yáng),固護(hù)心腎之氣;茯苓味淡性平,功能健脾氣、安心神,兩者共為佐藥。車(chē)前子味甘性寒,氣清涼,能泄腎中虛火,并防諸藥滋膩礙脾,為使藥。諸藥合用,共奏滋陰生精、溫陽(yáng)強(qiáng)精之功,以期溫煦精室,強(qiáng)精生子。前期研究結(jié)果表明,蓯蓉益腎顆粒可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及增加機(jī)體代謝,提高精子密度、精子活力及成活率,顯著改善少弱精子癥患者的精子質(zhì)量,具有一定的臨床療效[3]。

A.點(diǎn)狀圖;B.柱狀圖A.scatter diagram; B.bar chart圖5 蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的GO分子功能和KEGG通路富集分析圖Fig 5 GO molecular function and KEGG pathway enrichment analysis of Congrong Yishen granules in the treatment of oligospermia and asthenospermia

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法及參考相關(guān)文獻(xiàn),本研究從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到蓯蓉益腎顆粒的藥物活性成分共101種,總結(jié)其治療少弱精子癥的作用靶點(diǎn)共69個(gè)。在蓯蓉益腎顆粒的活性成分中,β-谷甾醇、松果菊苷和類(lèi)葉升麻苷為蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心活性成分。β-谷甾醇是植物甾醇類(lèi)成分,屬于四環(huán)三帖類(lèi)化合物,其廣泛存在于自然界中的各種植物油、堅(jiān)果等植物種子中,可通過(guò)與雌激素受體相結(jié)合,抑制NF-κB的激活,改善促性腺激素釋放激素分泌量減少,繼而促進(jìn)雄激素的分泌與精子的生成,并提高哺乳動(dòng)物的精子體外獲能效果[5-6]。松果菊苷是良好的抗氧化成分,能夠清除自由基并且消除氧化應(yīng)激損傷。王鶯等[7]發(fā)現(xiàn),松果菊苷通過(guò)提高醋酸鉛中毒模型大鼠睪丸組織內(nèi)乳酸脫氫酶含量,提高超氧化物歧化酶、還原性谷胱甘肽水平,進(jìn)而修復(fù)睪丸組織氧化應(yīng)激損傷情況,提高睪丸組織的抗氧化能力,恢復(fù)睪丸正常的生精功能;Jiang等[8]發(fā)現(xiàn),松果菊苷通過(guò)進(jìn)入下丘腦與雄激素受體靶向結(jié)合,并抑制雄激素受體活性中心,阻斷負(fù)反饋調(diào)節(jié),促進(jìn)正反饋調(diào)節(jié),提高睪酮和促黃體生成素的水平,進(jìn)而增加哺乳動(dòng)物的精子數(shù)量。類(lèi)葉升麻苷是管花肉蓯蓉的提取物之一,馬晶晶等[9]發(fā)現(xiàn),類(lèi)葉升麻苷可以縮短腎陽(yáng)虛小鼠模型陰莖勃起潛伏期,增加腎陽(yáng)虛小鼠模型的精子數(shù)量,顯著提高性器官臟器系數(shù),改善睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu);推測(cè)其作用機(jī)制可能與調(diào)控生殖激素水平相關(guān),從而改善機(jī)體的生精功能[10]。蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用靶點(diǎn)共69個(gè),篩選出綜合向心度排序居前10位的核心靶點(diǎn)有INS、TNF、PTGS2、IL-1β、MMP9、CAT、TP53、ACE、ESR1和IFNG。其中,ESR1的正常表達(dá)對(duì)男性生殖功能起著重要的調(diào)控作用。研究結(jié)果表明,ESR1基因mRNA低表達(dá)是精液質(zhì)量的危險(xiǎn)因素之一[11]。ESR1基因所表達(dá)的雌激素受體α可通過(guò)配體依賴(lài)和非依賴(lài)途徑,調(diào)節(jié)精子發(fā)生和精子成熟過(guò)程,尤其在調(diào)節(jié)睪丸輸出小管對(duì)液體的重吸收中起到重要作用[12-13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在ESR1基因敲除小鼠模型中,睪丸輸出小管和附睪的微環(huán)境改變,可導(dǎo)致附睪精子濃度和活力降低[12]。丁濤[14]發(fā)現(xiàn),在精子發(fā)生阻滯的不育患者中,ESR1基因在支持細(xì)胞表達(dá)中下調(diào)。由此可見(jiàn),改善ESR1基因mRNA低表達(dá),有可能是蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用靶點(diǎn)之一。

通過(guò)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),對(duì)蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析:(1)生物進(jìn)程主要體現(xiàn)在促進(jìn)類(lèi)固醇和細(xì)胞酮代謝過(guò)程,增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)類(lèi)固醇激素的反應(yīng),增強(qiáng)類(lèi)固醇生物合成的過(guò)程,并體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控;(2)細(xì)胞組成提示,靶點(diǎn)主要作用于細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物、轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物、離子通道復(fù)合物、鈉通道復(fù)合物、高爾基體、髓鞘和T小管等部位;(3)分子功能主要體現(xiàn)在對(duì)配體門(mén)控鈉離子通道活性、核受體活性、類(lèi)固醇羥基酶活性、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性、3′,5′-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性和3′,5′-環(huán)-AMP磷酸二酯酶活性的調(diào)控。對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,結(jié)果提示:蓯蓉益腎顆粒所調(diào)節(jié)的分子功能主要涉及類(lèi)固醇生物合成途徑、NF-κB信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路和白細(xì)胞介素17信號(hào)通路等。其中類(lèi)固醇生物合成途徑是蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心通路之一。精子的發(fā)生、獲能離不開(kāi)雄激素的調(diào)控。雄激素是類(lèi)固醇化合物,與雄激素結(jié)合蛋白相結(jié)合時(shí),使生精小管中的雄激素集中濃縮于管腔中,以刺激生精小管生成精子,同時(shí)可以促進(jìn)精子的成熟,保持精子的活力[15]。王啟新[10]發(fā)現(xiàn),肉蓯蓉通過(guò)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,維持下丘腦-垂體-腎上腺軸相關(guān)激素水平的穩(wěn)定,促進(jìn)睪酮的分泌和釋放,增加小鼠的睪丸及其副性腺器官的重量,進(jìn)而改善小鼠的生殖能力。相關(guān)研究報(bào)道,肉蓯蓉中所含的苯乙醇苷能夠促進(jìn)雄激素的分泌,從而提高精子質(zhì)量,改善生殖功能[16]。以此推測(cè),蓯蓉益腎顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌軸的功能,促進(jìn)雄性激素和促性腺激素的分泌,改善睪丸生精功能,以此起到治療少弱精子癥的作用。同時(shí),蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥涉及NF-κB信號(hào)通路。NF-κB信號(hào)通路在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用[17]。邱嫻嫻等[18]發(fā)現(xiàn),PM2.5可通過(guò)誘導(dǎo)NF-κB炎癥信號(hào)通路激活,上調(diào)白細(xì)胞介素6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá),放大炎癥級(jí)聯(lián),造成睪丸組織的炎性損傷,從而導(dǎo)致雄性大鼠生殖功能障礙。葉臻等[19]發(fā)現(xiàn),通過(guò)激活NF-κB通路,提高NDRG2炎癥因子水平,可引起純睪丸支持細(xì)胞綜合征患者的睪丸中間質(zhì)細(xì)胞的大量凋亡。由此推測(cè),蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用機(jī)制,有可能是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路激活,下調(diào)相關(guān)炎癥因子的水平,改善睪丸及附睪的炎癥損害,以達(dá)到治療的目的[20]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法,對(duì)蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的分子作用機(jī)制進(jìn)行了探討,同時(shí)也說(shuō)明了中藥復(fù)方治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn),體現(xiàn)了中藥復(fù)方的整體性和獨(dú)特性,為后續(xù)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究、探討蓯蓉益腎顆粒治療疾病的作用機(jī)制提供了理論支持。