蘭科植物花香成分研究進(jìn)展

馬迪，肖文芳，李佐，張俊衛(wèi)，陳和明，呂復(fù)兵

（1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢 430070；2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

0 引言

蘭科(Orchidaceae)植物總稱(chēng)蘭花，是被子植物最大的科之一，約有800個(gè)屬28000多個(gè)種，除兩極和極端干旱的沙漠外，廣泛分布于全球熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)，幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)一直是植物學(xué)家們研究的熱點(diǎn)[1]。蘭科植物在花部特征上呈多樣化，包括漫長(zhǎng)的花期、豐富的花色、奇特的花形等，其作為觀(guān)賞植物在國(guó)際市場(chǎng)上備受歡迎[2]。花香是蘭科植物重要的觀(guān)賞性狀之一，由一系列復(fù)雜的親脂性、高熔點(diǎn)的低分子揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatile organic compounds，VOCs)組成，在吸引昆蟲(chóng)傳粉者對(duì)其授粉、抵御病原體侵害、與周?chē)h(huán)境互作等方面都起著至關(guān)重要的作用；此外，花香成分還廣泛應(yīng)用于香水、化妝品、醫(yī)藥甚至調(diào)味品等領(lǐng)域[3-4]。

近年來(lái)，隨著代謝組學(xué)等生物技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)鑒定出了部分植物的花香成分，同時(shí)分離出了負(fù)責(zé)植物VOCs 生物合成和調(diào)控途徑的候選酶基因。然而，由于蘭花具有較長(zhǎng)的生命周期以及復(fù)雜而龐大的基因組，人們對(duì)蘭花花香合成及調(diào)控途徑所知甚少，與其他植物相比，蘭科植物花香成分相關(guān)研究仍處于起步階段[5-6]。目前，關(guān)于蘭科植物花香成分的研究主要集中在VOCs 的檢測(cè)及鑒定上，花香成分主要分為萜烯類(lèi)化合物、苯丙環(huán)類(lèi)/苯丙類(lèi)化合物、脂肪酸衍生物等3類(lèi)，其中萜烯類(lèi)化合物是大部分蘭科植物的最主要花香成分。蘭科植物的VOCs 復(fù)雜多變，導(dǎo)致在對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)時(shí)極易受到各種因素影響。至于花香成分的生物合成及相關(guān)代謝調(diào)控途徑等，僅有少部分萜烯類(lèi)途徑被明確報(bào)道。筆者綜述不同蘭科植物花朵香氣成分的異同、影響花香成分檢測(cè)的因素及相關(guān)合成調(diào)控因子，旨在為蘭科植物花香物質(zhì)的利用、香花品種選育提供參考。

1 蘭花花香成分

1.1 蘭花花香成分生物合成途徑

基于揮發(fā)性有機(jī)物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和合成方式，通常將蘭花花香成分歸為萜類(lèi)化合物、苯丙烷類(lèi)/苯環(huán)類(lèi)化合物以及脂肪酸衍生物3類(lèi)[7-8]。

萜類(lèi)化合物廣泛存在于各種植物中，是植物花香成分中最大的一類(lèi)，包括單萜、倍半萜、雙萜、三萜等各類(lèi)物質(zhì)[9-10]。萜類(lèi)化合物的基本骨架為異戊二烯(C5)，主要通過(guò)2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-methy-Derythrito- 4- phosphate，MEP) 途徑和甲羥戊酸(mevalonic acid，MVA)途徑2 條途徑生成萜戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)，IPP 和DMAPP在一系列酶的作用下完成各種萜類(lèi)物質(zhì)的合成及修飾[11-13]（圖1）。

圖1 蘭科植物花香成分的生物合成途徑

丙烷類(lèi)/苯環(huán)類(lèi)化合物為第二大類(lèi)的植物花香成分，由莽草酸(shikimate，SA)途徑中合成的芳香族氨基酸苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)通過(guò)各種酶的催化生成苯甲醛/醇、苯乙醛等化合物[14-16]。

脂肪酸衍生物是含量最少的一類(lèi)，亞油酸和亞麻酸在脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)作用下生成氫過(guò)氧化合物中間體，經(jīng)一系列催化反應(yīng)生成茉莉酸甲酯和其他脂肪酸衍生物[17-18]。

1.2 常見(jiàn)蘭花花香成分

目前，多種蘭花的花香成分已被檢出（表1）。綜合檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，不同種屬間的蘭花花香成分存在異同，且揮發(fā)物的相對(duì)含量也存在差異。袁媛等[21]分析了9 個(gè)不同品種的蕙蘭花朵揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)所有品種均含有金合歡醇及茉莉酸甲酯，除‘鄭孝荷’外，在另外8 個(gè)品種中的相對(duì)含量均較高，但不同品種中的其他主要成分則不盡相同，‘適圓’、‘大一品’和‘金奧素’中均含有α-愈創(chuàng)木烯，香葉醇則僅在‘適圓’和‘仙綠’中檢測(cè)到。夏科等[42]對(duì)7 種不同的石斛蘭鮮花進(jìn)行了GC-MS 分析，發(fā)現(xiàn)各品種中均存在(1R)-(+)-α-蒎烯和順式-β-羅勒烯，其中順式-β-羅勒烯在翅梗石斛中含量最高，(1R)-(+)-α-蒎烯在鼓槌石斛中含量最高，而檜烯僅存在于春石斛‘818’中。在鳥(niǎo)喙文心蘭、蜜糖文心蘭和卡特蘭‘大新1 號(hào)’中，含量最高的揮發(fā)性有機(jī)物均為(順)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯[33,53]，但其他香氣成分各不相同，鳥(niǎo)喙文心蘭主要為丁羥甲苯和十四烷，蜜糖文心蘭主要為α-蓽澄茄油烯和(反)-3-己烯-1-醇，卡特蘭‘大新1 號(hào)’則主要為苯甲醛和甲苯；大花惠蘭‘Sunny bell’和熒光蝴蝶蘭的花香主要組成成分均為芳樟醇，但在2 個(gè)不同種中芳樟醇的相對(duì)含量并不相同[25,47]。

表1 部分蘭花花朵主要揮發(fā)性成分

從花香成分的類(lèi)型看，萜烯類(lèi)化合物在蘭花花香成分中占有主導(dǎo)地位。倍半萜金合歡醇是蕙蘭、春蘭中相對(duì)含量最高的花香組成成分[21,27]；而文心蘭多數(shù)品種中花香組成成分含量最高的羅勒烯及其異構(gòu)體(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯也是萜烯類(lèi)物質(zhì)[29-33]；蝴蝶蘭的主要組成成分為單萜類(lèi)的芳樟醇和沉香醇[44-49]。但也有部分蘭科花卉的花香物質(zhì)主要成分為苯丙烷類(lèi)/苯環(huán)類(lèi)化合物或者脂肪酸衍生物。如文心蘭‘白仙女’和‘紅夢(mèng)香’的花香主要成分為苯乙醛和苯甲醛[34]，大花惠蘭‘大鳳’的則為脂肪酸衍生物亞麻酸乙酯和亞油酸甲酯[24]，這2 種物質(zhì)同時(shí)也是鼓槌石斛和大包鞘石斛中含量較大的揮發(fā)性化合物[43]，而大花奇唇蘭的花朵主要揮發(fā)物為己醛和脂肪酸衍生物乙酸十六酯[59]。石斛蘭略有不同，主要揮發(fā)性有機(jī)物組成成分更為豐富，萜烯類(lèi)、苯丙烷類(lèi)、脂肪酸衍生物的含量不相上下，不同種中的組成和占比均不相同[36-43]。

花朵中某一種揮發(fā)性有機(jī)物含量并不能準(zhǔn)確反映出它對(duì)花朵整體香氣的貢獻(xiàn)程度，香氣強(qiáng)度值為某一組分揮發(fā)物的含量與其香氣閾值的比，是衡量揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)香氣貢獻(xiàn)度的重要指標(biāo)，揮發(fā)物的香氣強(qiáng)度值越大，對(duì)香氣的貢獻(xiàn)也就越大，而不同揮發(fā)物的香氣特征則決定了其嗅感類(lèi)型[62]。不同蘭花的花香由其花朵揮發(fā)物中香氣強(qiáng)度值高的幾種主要致香成分決定，具有香甜氣味的茉莉酸甲酯和金合歡醇是蕙蘭、建蘭‘小桃紅’產(chǎn)生濃郁香味的主要物質(zhì)[21-22]，而蜜糖文心蘭和香水文心蘭的主要賦香成分是橙花油氣味的3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯[31,33]，香氣閾值較低的水果香味的乙酸辛酯、木香味的α-蒎烯、香甜味的3-蒈烯和花香味的羅勒烯等是多數(shù)石斛的主體香氣成分[37-40]；花香型的芳樟醇是蝴蝶蘭的關(guān)鍵致香成分，也是大多數(shù)蘭科植物的香氣特征物質(zhì)之一[45-47]。嗅感無(wú)香的蘭花花朵也存在揮發(fā)性成分，嗅感不具花香的蝴蝶蘭花朵中揮發(fā)性成分主要是反式-壬烯醛和黃瓜醛，但也能檢測(cè)到微量的致香成分芳樟醇和香葉醇，但其微量揮發(fā)未達(dá)嗅覺(jué)閾值[51]。

2 蘭花花香成分檢測(cè)的影響因素

2.1 采樣時(shí)期

同一朵花在不同開(kāi)花時(shí)期、同一開(kāi)花時(shí)期一天中的不同時(shí)段所釋放出來(lái)的揮發(fā)性有機(jī)物的種類(lèi)和含量均不相同。黃昕蕾等[36]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鼓槌石斛在花蕾期、始花期、盛花期、衰敗期檢測(cè)出的花朵揮發(fā)性成分種類(lèi)分別是3、6、31、5種，不同花期揮發(fā)性成分的種類(lèi)和釋放量皆呈先上升后下降的趨勢(shì),在盛花期達(dá)到最高，而盛花期花朵隨一天中開(kāi)放時(shí)段的不同，香氣成分種類(lèi)和釋放量也呈先上升后下降的趨勢(shì)，在14:00 時(shí)達(dá)到最高。軛瓣蘭不同花期香氣成分的變化和雜種卡特蘭‘3G’不同開(kāi)花階段的揮發(fā)性有機(jī)物變化與鼓槌石斛的一致，都是在盛花期揮發(fā)性有機(jī)物的相對(duì)含量最高，種類(lèi)最多[52,55]。蝴蝶蘭‘Nobby's Pacific Sunset’在完全盛開(kāi)的第8天9:00—13:00香味濃度最高，9:00時(shí)達(dá)到峰值，白天的主要香氣物質(zhì)為芳樟醇，而在夜間（19:00—次日03:00）α-法尼烯的揮發(fā)量增加，芳樟醇則減少[48]。大葉蝴蝶蘭的主要致香物質(zhì)芳樟醇在4:00—10:00 內(nèi)釋放量開(kāi)始逐步增加，10:00—16:00達(dá)到峰值，然后逐漸減少[45]。

2.2 采樣部位

蘭花花器官分為花瓣、萼片、唇瓣和合蕊柱，不同種類(lèi)的蘭花花朵不同部位的揮發(fā)性有機(jī)物釋放量和種類(lèi)并不相同。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雜交蘭‘K18’的花瓣釋放的揮發(fā)性成分種類(lèi)最多，達(dá)21 種，主要成分為β-石竹烯(37.90%)，唇瓣釋放的主要成分為β-羅勒(48.26%)，合蕊柱釋放的揮發(fā)物種類(lèi)最少，僅13種[26]。黃綠花色的細(xì)莖石斛中，同樣是花瓣釋放的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)最多，達(dá)27種[40]。文心蘭‘Rosy Sunset’的花瓣和萼片是花朵揮發(fā)物釋放的主要部位，且芳樟醇是相對(duì)含量最高的揮發(fā)物，而唇瓣和合蕊柱的主要揮發(fā)性成分組成與花瓣和萼片并不相同，以苯甲醛、β-月桂烯和β-石竹烯為主，且釋放量較低[35]。顏鳳霞等[28]從西藏虎頭蘭的花瓣、唇瓣和合蕊柱中分別鑒定出72、66和62種化合物，發(fā)現(xiàn)花瓣是西藏虎頭蘭的主要香氣釋放部位。但蕙蘭‘守良梅花’花朵揮發(fā)性有機(jī)物卻主要由合蕊柱釋放[63]。

2.3 采樣環(huán)境

進(jìn)行花朵揮發(fā)物檢測(cè)時(shí)樣品所處的環(huán)境會(huì)影響其揮發(fā)物的釋放，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果。多種環(huán)境因素中，溫度和光照是影響蘭花揮發(fā)性有機(jī)物的主要因素。通常種植在陽(yáng)光充裕、溫度稍高處的蘭花香味會(huì)更濃郁，有學(xué)者觀(guān)測(cè)到大葉蝴蝶蘭在光照充足的上午香味最濃，到下午香味明顯減弱[44]。另外，光質(zhì)對(duì)蘭花花朵揮發(fā)性物質(zhì)釋放也有一定影響，藍(lán)光、遠(yuǎn)紅光相較于紅光更能促進(jìn)單萜物質(zhì)的積累[45]。高溫同樣會(huì)促進(jìn)文心蘭花朵揮發(fā)物的釋放，香水文心蘭在30℃時(shí)能檢測(cè)出43種揮發(fā)物，其中羅勒烯、α-蒎烯、芳樟醇相對(duì)含量均大于20%，而在10℃時(shí)僅能檢測(cè)出24 種物質(zhì)，僅有羅勒烯相對(duì)含量大于1.00%[29]。

2.4 檢測(cè)技術(shù)

在對(duì)蘭花花朵的揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行提取檢測(cè)時(shí)，最常采用的為固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。固相微萃取的收集時(shí)長(zhǎng)和吸附材料等不同，氣相色譜和質(zhì)譜儀器及操作條件的差異都會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)出來(lái)的揮發(fā)性物質(zhì)成分和含量產(chǎn)生差異。張瑩等[29]和陳藝荃等[30]均采用固相微萃取法對(duì)香水文心蘭的花朵揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)，但檢測(cè)時(shí)所用的吸附柱材料和質(zhì)譜儀均不相同，檢測(cè)出來(lái)的主要揮發(fā)性物質(zhì)也不相同。在蝴蝶蘭‘Nobby’s Pacific Sunse’花香物質(zhì)檢測(cè)中使用了5種不同的固相微萃取吸附柱，包括100 μm PDMS、85 μm 聚丙烯酸酯、65 μm CW/DVB、85 μm CAR/PDMS 和50/30 μm DVB/CAR/PDMS，結(jié)果表明吸附涂層為50/30 μm的DVB/CAR/PDMS吸附柱萃取能力最佳[48]。針對(duì)篦葉蘭不同個(gè)體的花朵進(jìn)行揮發(fā)性成分檢測(cè)時(shí)，采用PDMS涂層的萃取柱萃取15 min，檢測(cè)出的揮發(fā)性成分十分單一，主要為2-甲氧基-4-乙烯基苯酚，在大多數(shù)個(gè)體中的占比均超過(guò)99%[57]。

3 蘭花花香成分合成及調(diào)控相關(guān)基因

萜烯類(lèi)化合物是部分具花香蘭花花朵的主要致香成分。針對(duì)蘭花花香揮發(fā)性物質(zhì)合成與調(diào)控相關(guān)基因的研究多集中在萜烯類(lèi)物質(zhì)代謝途徑中（表2），相對(duì)而言苯環(huán)/苯丙烷類(lèi)和脂肪酸衍生物代謝途徑中相關(guān)基因的研究則較少[64,65]。

表2 部分蘭花揮發(fā)性物質(zhì)調(diào)控因子

萜類(lèi)合成酶基因(TPS)是萜烯類(lèi)物質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵基因之一。陳藝荃等[30]在3種文心蘭轉(zhuǎn)錄組中篩選出了5個(gè)TPS基因，其中OnTPS4在3個(gè)品種中均高表達(dá)，說(shuō)明OnTPS4在3個(gè)品種中對(duì)香氣的形成均起到重要作用，而OnTPS3僅在‘黃夢(mèng)香’中表達(dá)量較高，而OnTPS1、OnTPS2、OnTPS5則在香水文心中表達(dá)量偏高，是調(diào)控香水文心蘭萜類(lèi)化合物合成的重要基因。TPS基因家族成員DoTPS10和DoGES1基因在鐵皮石斛中分別負(fù)責(zé)將GPP轉(zhuǎn)化為芳樟醇和香葉醇，在鐵皮石斛整個(gè)開(kāi)花階段均高表達(dá)，并且通過(guò)外源施加茉莉酸甲酯(methyljasmonate，MeJA)能夠明顯上調(diào)DoTPS10和DoGES1的表達(dá)量，從而促進(jìn)鐵皮石斛花香物質(zhì)成分中芳樟醇和香葉醇的積累，表明DoTPS10和DoGES1是調(diào)控鐵皮石斛花香主要成分芳樟醇和香葉醇的重要基因[66-67]。Chuang 等[7]對(duì)熒光蝴蝶蘭的研究發(fā)現(xiàn)PbGDPS可能在調(diào)控單萜物質(zhì)（香葉醇和芳樟醇）的生物合成中起關(guān)鍵作用，PbTPS5和PbTPS10的表達(dá)量與芳樟醇和香葉醇的產(chǎn)量基本一致。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)是萜類(lèi)物質(zhì)生物合成MVA途徑中的關(guān)鍵酶之一，萼脊蘭中SjHMGR基因在盛花期高表達(dá)，在蕾期則幾乎不表達(dá)，且在營(yíng)養(yǎng)器官低表達(dá)，而在花瓣、萼片中高表達(dá)，說(shuō)明其與萼脊蘭花香物質(zhì)合成可能密切相關(guān)[68]。

MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在花香化合物苯丙素類(lèi)/苯丙環(huán)類(lèi)化合物、脂肪酸類(lèi)衍生物合成中起著重要作用[69]。蘭屬‘Sael Bit’盛花期花朵的主要揮發(fā)性成分為2-甲基丁醛、2-甲基戊醛和Z-2-辛烯醛等苯環(huán)類(lèi)化合物，CsMYB1可以調(diào)節(jié)苯丙素類(lèi)/苯類(lèi)化合物的合成，且CsMYB1在其整個(gè)開(kāi)花階段均有表達(dá)，其中盛花期表達(dá)量最高，且其在花瓣和合蕊柱中的表達(dá)量高于萼片[23]。茉莉酸甲酯是蕙蘭的主要致香成分之一，Xu等[70]對(duì)其4 個(gè)CfMYB基因進(jìn)行了克隆并轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草茉莉酸甲酯合成途徑中的CfAOC（丙二烯氧化物環(huán)化酶基因）和CfJMT（羧甲基轉(zhuǎn)移酶基因）的啟動(dòng)子被激活，茉莉酸甲酯的積累增多，表明CfMYB能夠調(diào)控茉莉酸甲酯的合成。

4 問(wèn)題及展望

隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，花卉定向育種取得了顯著成果，花香作為觀(guān)賞花卉最重要的觀(guān)賞性狀之一，也越來(lái)越受到重視?；ㄏ愠哂形ハx(chóng)授粉、抵御病原體和防止有害生物侵害等作用，還廣泛應(yīng)用于香水、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有極高的價(jià)值。“蘭為王者香”，作為中國(guó)傳統(tǒng)名花，國(guó)蘭泛指蘭屬花卉，具備濃郁的芳香，而顏色艷麗、商品化程度極高的熱帶蘭卻基本不具芳香或香味極淡。但不論是對(duì)濃郁芬芳的蘭屬，還是對(duì)色彩艷麗的蝴蝶蘭屬等蘭科植物的花香相關(guān)研究均處于起步階段，遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于玫瑰、茉莉等物種。因此對(duì)蘭科植物花香成分的研究還有待深入。

目前，關(guān)于蘭科植物花香成分的研究主要還存在一些問(wèn)題：（1）關(guān)于蘭花花香成分的研究主要集中在單個(gè)品種或同屬品種的成分檢測(cè)鑒定上，缺乏快捷高效的技術(shù)分離蘭花花中各種花香成分。（2）對(duì)于蘭科植物花香相關(guān)物質(zhì)的完整合成途徑和轉(zhuǎn)錄調(diào)控均不太清楚，且三大合成途徑中只有萜烯類(lèi)化合物的合成途徑相關(guān)基因有少量研究。（3）調(diào)控花香化合物代謝的關(guān)鍵基因及調(diào)控機(jī)制的研究缺乏，導(dǎo)致分子標(biāo)記輔助育種、轉(zhuǎn)基因研究及定向改良十分困難，嚴(yán)重限制了蘭科植物的進(jìn)一步高效利用。

針對(duì)以上問(wèn)題，筆者認(rèn)為有關(guān)蘭科植物花香性狀的未來(lái)研究方向可以圍繞以下方面進(jìn)行：（1）可同時(shí)對(duì)某種或多種香型和無(wú)香型蘭花的父母本、姊妹株系花香成分等進(jìn)行分析鑒定，探究其遺傳規(guī)律和分離規(guī)律等，為香花蘭花的選育提供一定的依據(jù)。（2）可參考其他植物相關(guān)萜烯類(lèi)、苯丙類(lèi)/苯丙環(huán)類(lèi)、脂肪酸類(lèi)化合物的生物合成途徑、轉(zhuǎn)錄因子及分子調(diào)控機(jī)制，或基于目前已完成測(cè)序的蘭科植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，深入篩選挖掘花香相關(guān)基因，完善蘭科植物相關(guān)花香化合物的合成代謝途徑，為香花育種提供完整的理論支持。（3）可利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染等載體介導(dǎo)技術(shù)將香花基因轉(zhuǎn)入無(wú)香蘭花品種，從而達(dá)到無(wú)香優(yōu)良品種定向改良為香花品種，有香品種定向改良有效或高價(jià)值成分含量進(jìn)一步提高，這將是今后的研究重點(diǎn)和目標(biāo)。