大鼠90 天重復灌胃三烏膠丸毒性研究

張海江 周利琴

三烏膠丸是云南黑藥代表，由生草烏、生川烏、何首烏、生白附子、附子（附片）、冰糖、乳香、鮮豬蹄共八味中藥組成，具有祛寒除濕、祛風通絡、活血止痛、強筋健骨之功效，被用于治療風寒濕邪、風痰、淤血引起的風濕麻木、骨關節(jié)疼痛、陳傷勞損、中風偏癱、口眼歪斜等疾病[1，2]?，F代藥理學研究也顯示，三烏膠丸具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗免疫等作用[3]。然而，三烏膠丸因其成分復雜且含有包括烏頭堿、次烏頭堿、滇烏堿等多種烏頭類毒性物質，使毒性難于控制[4～6]。三烏膠丸現行質量標準中也僅收載了何首烏和乳香薄層鑒別數據及何首烏烏頭堿和揮發(fā)性堿性物質的含量測定，使現行質量標準不能保障三烏膠丸使用的安全性[7～9]。因此，為進一步探討三烏膠丸重復給藥有無毒性、臟器受累等情況，本試驗以《藥物非臨床研究質量管理規(guī)范》[10]為依據，參照實驗室前期急性毒性期實驗結果，對SD 大鼠進行為期90d 的持續(xù)灌胃給藥，判斷三烏膠丸重復給藥的毒性靶器官或靶組織；確定其無毒副反應水平（NOAEL），為制訂該產品臨床用藥方案提供一般毒性評價的臨床前實驗資料。

1 材料與方法

1.1 供試品、對照品、主要試劑及儀器①三烏膠丸生產單位：云南金烏黑藥制藥有限公司，批號：200205，規(guī)格：5g/袋，含量：每粒含干浸膏0.05g（相當于生藥0.151g）。②對照品純水使用TCHRO/20C 型純水儀自制。③毒麻精放類藥品異氟烷生產單位：江蘇恒豐強生物技術有限公司，批號：20190801，規(guī)格：100mL/瓶。④主要試劑：質控品包括全血質控品中值、質控血漿、質控血清3、尿分析陰陽性試紙；血液學檢驗試劑均來源于邁瑞南京生物技術有限公司；尿液檢驗試劑均來源于艾康生物技術有限公司；凝血檢驗試劑購自上海太陽生物技術有限公司；生化檢驗試劑盒主要購自邁克生物股份有限公司、日本和光純藥工業(yè)株式會社、南京普朗醫(yī)用設備有限公司。⑤儀器：全自動血凝儀（日本希森美康株式會社，型號：CA-620）；血液分析儀（日本希森美康株式會社，型號：XN-1000V[B1]）；全自動生化分析儀（邁瑞南京生物技術有限公司，型號：BS800）；尿液分析儀（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司，型號：URIT180）；稱重儀器（PL1501-S 型電子天平）。

1.2 實驗動物按云南金烏黑藥制藥有限公司研發(fā)中心（后文簡稱研發(fā)中心）標準操作程序（SOP）規(guī)定向湖南斯萊克景達實驗動物有限公司進行實驗動物SPF 級SD 大鼠訂購，80 只SD 大鼠雌雄各半，體重176.8～223.5g，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004，實驗動物質量合格證號：NO.1107272011001387。

1.3 劑量設置供試品的配制：稱取三烏膠丸干浸膏粉所需量，加適量純水配制成0.550g 干浸膏/mL（24.915g 生藥/kg）設置為高劑量組、0.275g 干浸膏/mL（12.458g 生藥/kg）設置為中劑量組、0.138g 干浸膏/mL（6.251g 生藥/kg）設置為低劑量組，現用現配。配制體積根據每周大鼠體重變化進行調整。三烏膠丸臨床劑量為每日服用生藥量30.2g，按成人平均體重60kg 計算，為30.2÷60 ≈0.503g 生藥/kg，按體表面積換算成大鼠等效劑量為30.2g 生藥/日×0.018/0.2kg=2.718g 生藥/kg。本試驗參考《藥物重復給藥毒性試驗技術指導原則》[11]和研發(fā)中心相關SOP 規(guī)定，綜合藥物臨床使用劑量及前期試驗結果進行劑量設置，三烏膠丸低、中、高劑量組分別為6.251g 生藥/kg、12.458g 生藥/kg、24.915g 生藥/kg，分別約相當于成人臨床使用劑量（按成人公斤體重計算）的12、25、50 倍，約相當于臨床使用劑量（按體表面積計算）的2.3、4.6、9.2 倍。同時設空白對照組（純水），4 組給藥體積均為15mL/kg。

1.4 動物分組與識別分組當日選用檢疫合格的SD 大鼠80 只，體重176.8～223.5g，雌雄各半，雌雄分籠飼養(yǎng)，每籠5 只，當某籠大鼠平均體重超過500g 時，如此籠大鼠為雄性，則將每組雄性大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠2～3 只；如為雌性則將所有雌性大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠2～3 只。2020 年5 月12 日稱重后經計算發(fā)現2 只雄性大鼠平均體重分別為510.4g和507.0g，則對所有雄性大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠2～3只。分組后，按研發(fā)中心SOP 規(guī)定采用標記系統(tǒng)進行2 次編號，籠號編通號，即第1 籠、第2 籠、第3籠、第4 籠，......，以此類推，分組時參考隨機分組順序號，先組間排組別順序，再組內按順序排籠號（即若每籠5 只大鼠，則第1 籠大鼠編號為1～5 號，第2籠為6～10 號，第3 籠為11～15 號，第4 籠為16～20號，......，以此類推；若每籠3 只大鼠，則第1 籠大鼠編號為1～3 號，第2 籠為4～6 號，第3 籠為7～9 號，第4 籠為10～12 號，......，以此類推）。分組后，將空白對照組籠卡設為白色、低劑量組設為藍色、中劑量組設為黃色、高劑量組設為紅色，后按15mL/kg體積灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)給藥90d，停藥后觀察4 周。

1.5 指標檢測及時間

1.5.1 一般物理檢查

1.5.1.1 一般臨床觀察 ①對試驗期大鼠進行一般籠旁癥候觀察，并及時記錄，1 次/d。觀察指標：大鼠外觀、行為活動、呼吸、分泌物、排泄物、飲食情況、死亡情況（死亡時間、瀕死前反應）等。如出現臨床癥狀，增加觀察次數，以詳細觀察大鼠中毒反應的癥狀、起始時間、嚴重程度、持續(xù)時間以及是否可逆。如發(fā)現大鼠死亡或瀕死，按照研發(fā)中心相關SOP 規(guī)定及時對大鼠進行解剖觀察并進行詳細病理學檢查。②體重、攝食量測定：每周稱量1 次，如果試驗期間大鼠體重變化明顯，可增加稱量次數，所用儀器為PL1501-S 型電子天平。

1.5.1.2 眼科檢查 于給藥第90 天及恢復期第4 周使用KJ8B 型直接檢眼鏡對大鼠進行眼科檢查，包括外觀、結膜、鞏膜、角膜、前房、瞳孔、虹膜等部位。

1.5.1.3 大鼠行為學觀察 于給藥第90 天及恢復期第4 周使用GAS-2 型大小鼠步態(tài)分析處理系統(tǒng)對大鼠進行步態(tài)分析，包括支撐時長、足跡平均面積、足跡平均強度、推進時長、制動時長。

1.5.2 大鼠處理與生物樣本采集

1.5.2.1 非計劃死亡大鼠 所有非計劃死亡的大鼠（包括瀕死大鼠）均應進行大體解剖。瀕死大鼠盡量采集血液做臨床血液檢查。非工作時間死亡的大鼠可將尸體于2℃～8℃保存，待次日進行大體解剖，本試驗過程中無非計劃死亡大鼠。

1.5.2.2 大體解剖 給藥末期及恢復末期分別解剖大鼠40 只。大鼠解剖前一天下午開始禁食（不禁水）。按照中心相關SOP 規(guī)定進行麻醉，誘導麻醉時異氟烷氣體濃度為1%～4%，維持麻醉時異氟烷氣體濃度為0.25%～2%。大鼠采血后安樂死進行解剖，取各臟器組織和骨髓。①血液樣本的采集：進行腹腔主動脈采血3 份，其中1.0～2.0mL 血液加入EDTA-K2 抗凝管進行血液學指標檢測，1.6～2.0mL血液加入檸檬酸鈉抗凝管進行凝血指標檢測及3.0～5.0mL 血液加入普通管進行生化指標檢測。②臟器組織采集：大鼠采血完畢后處死（腹腔主動脈放血），解剖，剖檢，取材，后固定于10%中性福爾馬林中。③骨髓樣本采集：先解剖大鼠剝離出胸骨，將胸骨剪斷，然后將其斷面的骨髓擠在有稀釋液（同種大鼠的血清）的玻片上，混勻涂片。

1.5.3 樣本檢查指標 血液學指標：①白細胞計數（WBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞壓積（HCT）、紅細胞平均體積（MCV）、紅細胞平均血紅蛋白量（MCH）、紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板計數（PLT）、白細胞分類[包括中性粒細胞（Neu）百分比、淋巴細胞（Lym）百分比、嗜酸性粒細胞（Eos）百分比、嗜堿性粒細胞（Bas）百分比、單核細胞（Mon）百分比]、網紅細胞計數（RET）。②生化指標：天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基轉移酶（GGT）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、葡萄糖（GLU）、總膽紅素（TBIL）、總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、肌酸磷酸激酶（CK）、鈉（Na+）、鉀（K+）、氯（Cl-）、鈣（Ca2+）。③凝血指標：凝血酶原時間（PT）、纖維蛋白原（Fbg）、活化部分凝血活酶時間（APTT）。④尿液指標：顏色、性狀、白細胞（LEU）、亞硝酸鹽（NIT）、尿膽原（URO）、蛋白質（PRO）、pH 值、隱血（BLD）、尿比重（SG）、酮體（KET）、膽紅素（BIL）、葡萄糖（GLU）。⑤骨髓檢查：紅細胞系統(tǒng)、粒細胞系統(tǒng)、淋巴細胞系統(tǒng)、單核細胞系統(tǒng)、其他細胞；粒系細胞系統(tǒng)總數與紅細胞系統(tǒng)總數的比值；巨核細胞全片總數，必要時則應作全片巨核細胞計數，觀察25 個巨核細胞并作分類。⑥臟器系數：腦、心、肝、脾、腎、腎上腺、胸腺。⑦組織病理學檢查：檢查大鼠體質、發(fā)育和營養(yǎng)狀況等，肉眼觀察臟器的位置、大小、色澤、有無粘連等，并檢查臟器的質地、有無積液和腫瘤等；如大鼠某一組織發(fā)生與毒性相關的病理改變，需要對其他劑量組大鼠的相同組織進行組織病理學檢查。試驗期間，未出現影響研究可靠性和造成研究工作偏離試驗方案的異常情況。

1.6 統(tǒng)計學方法采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對數據進行分析，體重、攝食量、血液學指標、凝血指標、生化指標及臟器系數等計量資料采用±s表示，系統(tǒng)解剖及組織病理學采用定性指標判斷結果。兩兩比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較先進行方差齊和正態(tài)性比較，方差齊且符合正態(tài)分布時采用LSD-t或Dunnett-t檢驗，不符合正態(tài)分布時采用Non-parametrict檢驗，符合正態(tài)性但方差不齊時采用Dunnett's T3 或Tamhane's T2 檢驗。尿液檢查為等級資料，采用秩和檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 籠旁觀察大鼠經口灌胃給予三烏膠丸90d，停藥恢復期4 周?；\旁觀察結果顯示，給藥期及停藥恢復期大鼠外觀體征、行為活動、分泌物、糞便及一般狀況未見異常。

2.2 體重三烏膠丸各劑量組大鼠體重分別與同期空白對照組比較，雌雄整體大鼠體重在給藥期間及停藥恢復期差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但雌性動物三烏膠丸中劑量組第6 周、第7 周體重高于空白對照組（P＜0.05）；高劑量組第3、4、6、7 周體重顯著高于空白對照組（P＜0.05）。見圖1。

2.3 攝食量三烏膠丸各劑量組大鼠攝食量分別與同期空白對照組比較發(fā)現，雌雄整體大鼠攝食量在給藥期間及停藥恢復期差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；然而，三烏膠丸高劑量組第3～11 周、第13 周攝食量明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.4 給藥期步態(tài)分析給藥期，雌雄整體大鼠三烏膠丸中劑量組左前足跡最大強度、左后足跡最大面積、右后足跡最大強度明顯低于同期空白對照組（P＜0.05）；三烏膠丸高劑量組右后足跡平均面積、右后足跡最大強度、右后足跡平均強度、左后足跡最大面積、左后足跡最大強度明顯低于同期空白對照組（P＜0.05）；雌性大鼠三烏膠丸中劑量組左前足跡最大強度、左前足跡最大面積、左后足跡最大面積、右后足跡平均強度明顯低于同期空白對照組（P＜0.01）；雄性動物三烏膠丸中劑量組左前足跡最大面積、右后足跡平均強度明顯低于同期空白對照組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 三烏膠丸各劑量組與空白對照組給藥期步態(tài)指標比較

2.5 血液學檢查給藥期，雌雄整體大鼠低劑量組MCHC 明顯高于同期空白對照組（P＜0.01）；中、高劑量組HCT 低于同期空白對照組（P＜0.05）；高劑量組RBC 低于同期空白對照組（P＜0.05），Mon 明顯高于同期空白對照組（P＜0.01）?；謴推?，雌雄整體大鼠中劑量組Bas 明顯高于同期空白對照組（P＜0.01），但無明顯劑量規(guī)律性特點。見表1。

表1 三烏膠丸對大鼠血液學指標的影響（±s）

表1 三烏膠丸對大鼠血液學指標的影響（±s）

續(xù)表1

表1 三烏膠丸對大鼠血液學指標的影響（±s）

注：與空白對照組比較，+P＜0.05，++P＜0.01

2.6 血液生化指標檢查給藥期，雌雄整體大鼠高劑量組AST 低于同期空白對照組（P＜0.05）；恢復期，高劑量組BUN 高于同期空白對照組（P＜0.05），中劑量組CK 高于同期空白對照組（P＜0.05），但其變化范圍在正常值范圍內。見表2。

表2 三烏膠丸對大鼠血液生化指標的影響（±s）

表2 三烏膠丸對大鼠血液生化指標的影響（±s）

續(xù)表2

表2 三烏膠丸對大鼠血液生化指標的影響（±s）

注：與空白對照組比較，+P＜0.05

2.7 血電解質檢查給藥期，雌雄整體大鼠高劑量組Ca2+高于同期空白對照組（P＜0.05），但均在正常值范圍內；恢復期，雌雄整體大鼠血電解質指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 三烏膠丸對大鼠血電解質指標的影響（mmol/L，±s）

表3 三烏膠丸對大鼠血電解質指標的影響（mmol/L，±s）

注：與空白對照組比較，+P＜0.05

2.8 凝血指標檢查給藥期，雌雄整體大鼠凝血指標與同期空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?；謴推?，雌雄整體大鼠凝血指標與同期空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 三烏膠丸對大鼠凝血指標的影響（±s）

表4 三烏膠丸對大鼠凝血指標的影響（±s）

2.9 骨髓及眼科檢查外周血象檢查未見與藥物毒性有關的異常，故骨髓涂片未進行顯微鏡下觀察；三烏膠丸各劑量組及空白對照組眼科檢查均未見明顯異常。

2.10 尿液指標檢測給藥期，雌雄整體大鼠中、高劑量組pH 值低于同期空白對照組（P＜0.05），高劑量組SG 明顯高于同期空白對照組（P＜0.01）；高劑量組NIT、PRO、BLD、BIL 陰性只數少于同期空白對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?；謴推?，雌雄整體大鼠高劑量組pH 值明顯低于同期空白對照組（P＜0.01），SG 明顯高于同期空白對照組（P＜0.01）；高劑量組PRO、KET 陰性只數少于同期空白對照組，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥期與恢復期4 組大鼠尿液均呈淡黃色，清亮。見表5、6。

表5 三烏膠丸對大鼠尿液pH 值與SG 的影響（±s）

表5 三烏膠丸對大鼠尿液pH 值與SG 的影響（±s）

注：與空白對照組比較，+P＜0.05，++P＜0.01

表6 三烏膠丸對大鼠尿常規(guī)指標的影響（n）

2.11 臟器系數給藥期，各組大鼠臟器系數與同期空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表7。

表7 三烏膠丸對大鼠臟器系數的影響（g/100g，±s）

表7 三烏膠丸對大鼠臟器系數的影響（g/100g，±s）

續(xù)表7

表7 三烏膠丸對大鼠臟器系數的影響（g/100g，±s）

2.12 組織病理學檢查本次試驗未見動物中途死亡，也未見其他異常。試驗各階段主要背景性病理改變發(fā)生情況，見表8。

表8 試驗各階段主要背景性病理改變發(fā)生情況[n（%）]

3 討論

三烏膠丸組方遵循“君、臣、佐、使”配伍原則，由生草烏、生川烏、何首烏、生白附子、附子（附片）、冰糖、乳香、鮮豬蹄組成，有活血祛瘀、通經活絡、健骨止痛之效[12]。三烏膠丸能有效醫(yī)治風濕性關節(jié)炎及中風偏癱各癥[13，14]。然而，現行質量標準未全面反映三烏膠丸的物質基礎，難以保證其使用安全性。為此，本研究在《藥物非臨床研究質量管理規(guī)范》條件下，以SD 大鼠為實驗對象，持續(xù)90d 重復灌胃三烏膠丸，觀察SD 大鼠可能出現的毒性反應及靶器官或靶組織，為三烏膠丸的毒性評價提供參考。

本實驗選用SPF 級SD 大鼠作為實驗對象，將三烏膠丸按照6.251g 生 藥/kg、12.458g 生 藥/kg、24.915g 生藥/kg 的劑量對大鼠進行重復灌胃給藥90d，并設停藥恢復期4 周。實驗期間，三烏膠丸對大鼠體重、血液學指標、血液生化指標、血電解質指標有輕微影響，但無明顯時間、劑量等規(guī)律特點，也無毒理學意義；高劑量三烏膠丸對大鼠攝食有一定影響，可能與長期給予大劑量和高濃度的藥物有關，但上述變化未引起進一步的機體異常（如體重、精神及營養(yǎng)狀態(tài)等），故認為上述變化無明顯毒理學意義。此外，眼科檢查和組織病理學檢查均未見與三烏膠丸相關的異常改變。

三烏膠丸能引起大鼠步態(tài)變化，本研究觀察到三烏膠丸中、高劑量能引起步態(tài)足趾支撐強度、面積等的變化。大鼠步態(tài)是通過四肢的交互動作移動機體的行為特征，有賴于中樞神經系統(tǒng)、周圍神經系統(tǒng)以及肌肉骨骼系統(tǒng)的協(xié)調工作[15]。神經傳導及神經-肌肉接頭傳導等的異常、四肢關節(jié)改變以及肢體協(xié)調性改變等均可能引起步態(tài)異常，可表現為足趾壓強、足跡面積、足趾支撐時長等改變[16]。三烏膠丸處方中含有生川烏、生草烏、附子等中藥，所含的烏頭堿等可引起神經-肌肉接頭的傳導發(fā)生異常，引起大鼠肢體及面部神經麻木等不良反應，進而間接引起大鼠的步態(tài)改變[17，18]。

本實驗還觀察到三烏膠丸各劑量組在給藥期間尿常規(guī)指標可見劑量相關性的異常變化，主要表現為尿SG 隨藥物劑量升高而略有升高，pH 則不同程度下降，表明三烏膠丸對尿常規(guī)指標的影響與給藥劑量有關，但在恢復期，影響程度降低，尿常規(guī)異常的頻率降低，提示上述尿液指標異?？赡転榇笫蟮倪m應性變化有關[19]，其異常變化的毒理學意義需結合腎臟功能和腎臟病理進行綜合性分析。然而，本研究未見與三烏膠丸相關的腎功能和腎臟組織病理異常改變，提示三烏膠丸暫未發(fā)現可引起腎臟的功能和組織的異常變化。故尿常規(guī)異常不考慮有毒理學意義，但臨床研究時仍需監(jiān)測受試者腎功能和尿常規(guī)，以保護其用藥安全。

本研究未見與三烏膠丸相關的肝和肝臟組織病理異常改變，提示三烏膠丸暫未發(fā)現可引起肝臟的功能和組織的異常變化，因此不考慮有肝臟毒理學意義，但臨床研究時仍需監(jiān)測肝臟功能以提高受試者的用藥安全性。

綜上所述，在本試驗條件下，SD 大鼠經口灌胃給予三烏膠丸90d，對大鼠一般狀況、體重、血液學和凝血、血液生化和電解質、臟器等均無明顯影響，但高劑量能引起大鼠的步態(tài)改變，提示臨床長期應用時需重點關注感覺神經反應的變化。據此，推斷三烏膠丸的NOAEL 應為12.458g 生藥/kg，分別約相當于成人臨床使用劑量的25 倍（按成人公斤體重計算）和4.6 倍（按體表面積計算）。