基于高通量測(cè)序的木薯根域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究

韋云東 羅燕春 鄭華 李軍 盤(pán)歡 雷開(kāi)文 周時(shí)藝

摘 要：為研究木薯根域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，開(kāi)展了根袋試驗(yàn)，處理包括2個(gè)木薯品種（華南205：SC205和桂熱4號(hào)：GR4）和3個(gè)施肥處理（包括不施肥T1，普通施肥T3，施2倍氮肥T7），并進(jìn)行了Illumina Hiseq高通量測(cè)序。結(jié)果表明，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落為放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria，8.579%～10.697%），變形菌門(mén)（Proteobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）等。根域土壤比非根際土壤相對(duì)富集變形菌門(mén)和10個(gè)細(xì)菌屬;SC205根域的硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、5個(gè)綱（δ變形菌綱等）和6個(gè)屬（Flavisolibacter等）的相對(duì)豐度比GR4要高，但鞘脂桿菌綱則相反。真菌優(yōu)勢(shì)群落為子囊菌門(mén)（43.71%～59.79%）、毛霉門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)等。根域土壤施肥抑制壺菌門(mén)（Chytridiomycota）相對(duì)豐度。相對(duì)于根域土壤，T7提高了非根際土壤中的Agaricomycetes， Geminibasidiomycetes和Microbotryomycetes綱的相對(duì)豐度。T7比T1顯著降低了根域土壤Chytridiomycetes綱的相對(duì)豐度。LEfSe結(jié)果表明：根域土壤施肥降低了哈茨木霉的相對(duì)豐度。α多樣性結(jié)果表明：土壤細(xì)菌物種豐度順序?yàn)門(mén)7 GR4

關(guān)鍵詞：木薯根域 微生物群落 鞘氨醇桿菌屬 硝化螺旋菌門(mén) 哈茨木霉

中圖分類(lèi)號(hào)：S154.3，S533? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金資助（NO. CARS-11）;廣西自然科學(xué)基金資助（No. 2020GXNSFAA259042）;廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目（桂農(nóng)科2021YT150）。

作者簡(jiǎn)介：韋云東（1988-），男，土壤學(xué)碩士，助理研究員，主要從事木薯栽培與施肥管理研究。

*通信作者：鄭華（1983），男，高級(jí)農(nóng)藝師，生態(tài)學(xué)博士，主要從事木薯水肥管理研究，E-mail： zhenghua8305@yeah.net。

收稿日期：2020-06-22

Study on Soil Microbial Community Structure in Cassava Rhizosphere by High-throughput Sequencing Techniques

WEI Yundong，LUO Yanchun，ZHENG Hua*，LI Jun，PAN Huan，

LEI Kaiwen，ZHOU Shiyi

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning，Guangxi 530001， China）

Abstract： The soil microbial community structure in cassava rhizosphere was studied by root-bag experiment with two cassava varieties （SC205 and GR4） and three fertilization treatments （T1-no fertilization， T3-conventional fertilization， T7-two times nitrogen fertlizer）. Bacteria （16S） and fungi （18S） were tested by Illumina Hiseq high-throughput sequencing. Results showed that the dominant bacterial communities were Actinobacteria （8.579%～10.697%）， Proteobacteria， Chloroflexi， et al. Proteobacteria and 10 genus in rhizosphere soil were relatively higher than those in non-rhizosphere soil. The relative abundance（RA） of Nitrospirae， 5 classes （Deltaproteobacteria，et al.），and 6 genus （Flavisolibacter，et al.）in SC205 rhizosphere were higher than those in GR4 rhizosphere， while Sphingobacteriia did the opposite. The dominant fungi communities were Ascomycota （43.71% - 59.79%）， Mucoromycota and Basidiomycota，et al. Fertilization in rhizosphere soil inhibited the RA of Chytridiomycota. In T7， the RA of Agaricomycetes， Geminibasidiomycetes and Microbotryomycetes in non-rhizosphere soil increased， but the RA of Chytridiomycetes in rhizosphere soil decreased. LEfSe analysis demonstrated that fertilization in rhizosphere soil decreased the RA of Trichoderma harzianum. α diversity index indicated that the soil bacterial species abundance in GR4 rhizosphere was lower than that in SC205 rhizosphere and all non-rhizosphere soil in T7. The fungi abundance in T3 was higher than that in T7， and the Chao1 index in T7 was lower than that in T1. Conclusion： bacterial species abundance， and the RA of Nitrospirae and 5 classes and 6 genus in GR4 rhizosphere were relatively lower than those in SC205 rhizosphere. Differences of bacteria infered difference of nitrogen cycle and root exudates. Fertilization decreased the fungal species abundance.Chytridiomycota， 4 Eumycetes and Trichoderma harzianum were affected by fertilization or cassava roots， suggesting the function of the fungi in fertilizers transformation or their interaction with root exudates. The study would provide basis for further study of cassava rhizosphere microbes.

Key words： Cassava rhizosphere;microbial community;Sphingobacterium;Nitrospirae;Trichoderma harzianum

根際是受植物根系生長(zhǎng)影響，性質(zhì)有別于其他土體的微域土區(qū)，是植物與土壤進(jìn)行物質(zhì)、能量交換的重要場(chǎng)所。根際土壤微生物群落是土壤生態(tài)系統(tǒng)持續(xù)發(fā)揮作用的重要媒介，是反應(yīng)土壤健康狀態(tài)的重要指標(biāo)[1]。根際微生物主要來(lái)源于土壤[2]，而植物對(duì)根際微生物有一定的篩選作用[3，4]，主要是通過(guò)根際分泌物吸引特異微生物種群[5]。

根際微生物群落結(jié)構(gòu)受植物年齡[6]、生長(zhǎng)時(shí)期[7，8]、耕作制度[9]、連作[10]、施肥[11，12]等多種因素的影響。不同的土壤質(zhì)地也導(dǎo)致根際微生物的差異[13]。作物不同品種間的根際微生物也有差異，如水稻的秈稻根際比粳稻根際富集更多參與氮代謝的微生物群落[14];蘇小惠等[15]研究表明不同苧麻品種根際微生物也有一定的差異。李強(qiáng)等[16]的研究認(rèn)為不同品種的烤煙，其根際微生物種類(lèi)和優(yōu)勢(shì)種群數(shù)量并無(wú)差異，但微生物種群的分布情況存在顯著差異。

木薯是我國(guó)南方重要的經(jīng)濟(jì)作物，其用途廣泛，是食品、化工、生物燃料等多種行業(yè)的重要原料。對(duì)木薯根際微生物的研究十分有限，如唐秀梅等[17]的研究表明木薯/花生間作可增加根際土壤細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌及總微生物數(shù)量和微生物多樣性。徐海強(qiáng)等[18]的研究表明木薯與花生間作有利于木薯和花生根際土壤向細(xì)菌型轉(zhuǎn)化，且間作同時(shí)可改變木薯和花生根際土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)。

“抖落法”[19，20]和“根袋法”[21，22]是研究根際土壤較常用的方法。木薯根毛少，使用“抖落法”采集根際土壤十分困難。本研究采用“根袋法”結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，研究木薯根域（根袋內(nèi)）和非根際（根袋外）土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)差異以及木薯品種間差異，以期為了解木薯根際過(guò)程包括根系分泌物、養(yǎng)分吸收與微生物交互作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試土壤從南寧市武鳴區(qū)采樣，采樣地種植木薯有10年以上歷史。質(zhì)地為粘土，其粘粒（<0.002 mm）、砂粒（2～0.05 mm）、粉（砂）粒（0.05～0.002 mm）含量分別為58.49%，33.00%，8.51%;粘土pH值、全氮、全磷、全鉀、速效氮、速效磷、緩效鉀分別為5.7，1.410 g/kg，2.65 g/kg， 4.39 g/kg， 122.0 mg/kg，154 mg/kg， 65.7 mg/kg。試驗(yàn)前風(fēng)干過(guò)2 mm篩。

所試木薯品種為桂熱4號(hào)（GR4）和華南205（SC205）。其中SC205為我國(guó)木薯種植區(qū)域廣泛分布的主栽品種;桂熱4號(hào)為廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所（以下簡(jiǎn)稱(chēng)熱作所）育種，于2011年通過(guò)品種審定。其品種親本單株編號(hào)為SM1600，來(lái)源于國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)中心木薯種質(zhì)PAR164自然雜交后代。

根袋材質(zhì)為300目尼龍網(wǎng)，分為大袋和小袋。大袋為50 cm × 30 cm × 15 cm的長(zhǎng)方體，上部中間有長(zhǎng)13 cm，高7 cm的一條開(kāi)口，方便放入小袋。小袋為長(zhǎng)30 cm，直徑5 cm，正中間有高10 cm，直徑5 cm的T型凸起，凸起上下均開(kāi)口，用于種植木薯種莖。

所用化肥均為市購(gòu)，其中尿素（N 46.4%）由重慶建峰化工股份有限公司生產(chǎn)、復(fù)合肥（N：P2O5：K2O比例為15：15：15）由歐洲化學(xué)安特衛(wèi)譜公司生產(chǎn)、氯化鉀（K2O 60%）由中化化肥有限公司生產(chǎn)，磷酸二氫鉀（P2O5≥51.5 %，K2O≥33.9 %）由安徽省尼古拉斯植物營(yíng)養(yǎng)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017年在熱作所木薯試驗(yàn)基地開(kāi)展（N 22°54′02.58″，E 108°20′05.43″）盆栽試驗(yàn)。該試驗(yàn)完整共17個(gè)，包括兩種土壤（粘土和砂質(zhì)壤土），不同施肥量的氮磷鉀肥和不同的中微量元素肥料組合。該文中參與分析的數(shù)據(jù)包括處理1、3、7，均為粘土。其中處理1（編號(hào)T1）和處理3（編號(hào)T3）的木薯品種為SC205，T1和T3分別為不施肥處理（CK）和常規(guī)施肥（NPK）;T7的木薯品種為GR4和SC205，施肥為2倍氮肥（N2PK）。NPK的施肥量為N：P2O5：K2O為76.9 mg/kg：76.9 mg/kg：76.9 mg/kg，以復(fù)合肥（15：15：15）的形式施入;N2PK的施肥量為153.8 mg/kg：76.9 mg/kg：76.9 mg/kg，以尿素、磷酸二氫鉀、氯化鉀的形式施入。同一處理根袋內(nèi)外的施肥量均一致。T1根袋內(nèi)外樣品名稱(chēng)分別為T(mén)1SC205和T1soil;T3根袋內(nèi)外樣品名稱(chēng)分別為T(mén)3SC205和T1soil;T7根袋內(nèi)外樣品名稱(chēng)分別為T(mén)1SC205（品種SC205）、T7GR4（品種GR4）和T1soil。每個(gè)處理4次重復(fù)。

盆栽用盆的大小為620 mm×395 mm×170 mm。種植時(shí)，將土壤（粘土和砂質(zhì)壤土）按各處理與肥料混勻后按各處理分別裝入到試驗(yàn)用盆中。每個(gè)盆內(nèi)裝入40 kg土壤。然后將各處理的土壤500 g分別裝入到根袋中。每個(gè)根袋分別種植一株長(zhǎng)約30 cm的木薯種莖，之后埋入大盆的土壤中深10 cm左右。每盆中植入GR4和SC205各1株。處理隨機(jī)區(qū)組排列。

2017年4月27日種植后用水澆透，之后進(jìn)入日常管理。于2017年8月8日（植后103 d）取樣。取樣時(shí)分別取大盆內(nèi)的土壤和根袋內(nèi)的土壤，每個(gè)樣品通過(guò)四分法分為三份：一份重量大約10 g，取樣后迅速放入液氮中速凍，之后保存在-40℃冰箱。第二份取樣后迅速放入4℃冷藏箱，之后保存于4℃冰箱中;第三份取樣后風(fēng)干。

T7SC205，T7GR4和T7soil（樣品含義見(jiàn)表1）進(jìn)行高通量細(xì)菌多樣性測(cè)序;并選取T1soil、T3soil、T7soil、T1SC205、T3SC205、T7SC205進(jìn)行高通量真菌多樣性測(cè)序。

1.2.2 測(cè)試與分析方法

將保存在-40℃的樣品在液氮下使用瑪瑙研缽磨碎，使用干冰運(yùn)輸（約-40℃）送檢測(cè)試高通量微生物多樣性。細(xì)菌（16S）和真菌（18S）多樣性由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司開(kāi)展，遵照Hov等[23]和Ma等[24]中的標(biāo)準(zhǔn)程序，但真菌的擴(kuò)增引物由ITS改為18S：SU0817F（5'-TTAGCATGGAATAATR RAATAGGA-3'）和1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAG TTTCC-3' ）的V5-V7可變區(qū)。且最后利用RDP classifier （http：//rdp.cme.msu.edu/）每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋時(shí)，比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)為nt，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

方差分析采用RStudio version 1.1.463（基于R Version 3.5.2）中的ANOVA進(jìn)行，T7GR4與T7SC205之間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，二者與T7soil的比較采用t檢驗(yàn)，多重比較采用SSR法，其中t檢驗(yàn)（包括配對(duì)t檢驗(yàn)）采用基本函數(shù)t.test（）進(jìn)行，多重比較采用Rstudio中的boxplert.R程序進(jìn)行。熱圖（Heatmap圖）采用Pheatmap包進(jìn)行作圖。

LEfSe（LDA EffectSize）按照Segata等[25]中的方法計(jì)算，LDA值分布柱狀圖中展示了LDA Score大于設(shè)定值（默認(rèn)設(shè)置為4）的物種，即組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker。PCoA（principal co-ordinates analysis）是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法，通過(guò)一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值，PCoA 可以找到距離矩陣中最主要的坐標(biāo)，結(jié)果是數(shù)據(jù)矩陣的一個(gè)旋轉(zhuǎn)，它沒(méi)有改變樣品點(diǎn)之間的相互位置關(guān)系，只是改變了坐標(biāo)系統(tǒng)。通過(guò)PCoA 可以觀(guān)察個(gè)體或群體間的差異。LEfSe和和PCOA均在美吉生物云平臺(tái)中進(jìn)行（https：//cloud.majorbio.com）?？紤]到樣品數(shù)，僅3個(gè)處理參與LEfSe分析：T1SC205，T3SC205和T7SC205。分析后得到有顯著差異的指示物種，之后采用上述boxplert.R程序進(jìn)行方差分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌

高通量測(cè)序結(jié)果表明：各樣品細(xì)菌測(cè)得的序列數(shù)范圍為32413-48484個(gè)，平均長(zhǎng)度在431.3～434.9，最短序列長(zhǎng)度的范圍為267～332 bp，最長(zhǎng)序列長(zhǎng)度為494～510 bp（圖表略）。細(xì)菌測(cè)得的OUT能注釋到種的僅為63.8%（150/235），可識(shí)別的有效tags數(shù)占總有效tags數(shù)的10.5%～20.1%（圖表略），其中T7soil最低，T7GR4最高。

圖1可以看出，T7SC205和T7GR4分別有222和227個(gè)細(xì)菌種，大于T7soil（180個(gè)）。根袋內(nèi)外的土壤共有種有171個(gè)，兩個(gè)品種根袋內(nèi)土壤單獨(dú)共有44個(gè)細(xì)菌種（不包括三者共有），而單獨(dú)與根袋外的土壤共有細(xì)菌種僅各為4個(gè)。三者分別有8，3，1個(gè)特有細(xì)菌種，查看原始OTU表格可知（圖表略）：T7soil僅有1個(gè)獨(dú)有種Helicobacter_pylori，其有效tags數(shù)較小;T7GR4有6個(gè)特有種能注釋到物種名，而且有效tags數(shù)為5～125，超過(guò)10個(gè)的有酸土環(huán)脂芽孢桿菌，葡萄球菌屬未注釋種，Microlunatus terrae（小月菌屬），Devosia sp.，噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga sp.BHS15），這些細(xì)菌種可能對(duì)GR4根際有一定的選擇性。T7SC205根袋內(nèi)僅一個(gè)鞘脂單胞菌屬下的未知種（Novosphingobium sp.），且有效tags數(shù)為76，該屬是鞘脂單胞菌目下的屬，是能夠直接利用根系分泌物的細(xì)菌。

表1可以看出，可準(zhǔn)確注釋到細(xì)菌門(mén)共16個(gè)，相對(duì)豐度的占總測(cè)序數(shù)的比例僅25.067%～28.487%。放線(xiàn)菌（Actinobacteria）相對(duì)豐度最高，達(dá)到8.579%～10.697%，其下屬的Thermoleophilia綱表現(xiàn)為T(mén)7SC205>T7soil。其次為變形菌門(mén)（Proteobacteria），相對(duì)豐度為4.662%～9.390%，再次為綠彎菌門(mén)（Chloroflexi），厚壁菌門(mén)（Firmicutes）等。

根據(jù)處理間細(xì)菌門(mén)和綱的差異，將它們大致分為三類(lèi)：第一類(lèi)表現(xiàn)出了兩個(gè)品種的差異，且部分還有根袋內(nèi)外差異，包括δ變形菌綱（Deltaproteobacteria）、全噬菌綱（Holophagae）、索利氏菌綱（Solibacteres）、Chitinophagia綱、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）及其下屬的唯一綱-硝化螺旋菌綱，這5個(gè)綱的相對(duì)豐度大小均為T(mén)7SC205> T7 GR4，另外，還有一個(gè)鞘脂桿菌綱（Sphingobacteriia）的相對(duì)豐度為T(mén)7SC205< T7GR4。第二類(lèi)兩個(gè)品種與根袋均有顯著差異，但品種間無(wú)顯著差異，包括柔膜菌門(mén)（Tenericutes） 及其唯一下屬的柔膜菌綱（Mollicutes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）及其下屬的Ktedonobacteria綱，浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）及其下屬的Planctomycetia綱，Epsilonproteobacteria綱、Cytophagia綱，以上細(xì)菌門(mén)類(lèi)均表現(xiàn)為根袋內(nèi)小于根袋外，而變形菌門(mén)則表現(xiàn)為根袋內(nèi)大于根袋外。第三類(lèi)為1個(gè)品種與根袋外有顯著差異。包括Thermoleophilia綱、α變形菌綱、酸桿菌綱三者都為T(mén)7SC205>T7soil，桿菌綱（Bacilli）相對(duì)豐度為T(mén)7SC205< T7soil，芽單胞菌綱和Opitutae綱順序均為T(mén)7GR4

α多樣性指標(biāo)結(jié)果表明（見(jiàn)表2）：T7土壤細(xì)菌種水平的ACE和Chao1指標(biāo)表現(xiàn)為GR4小于T7soil和T7SC205。說(shuō)明GR4根袋內(nèi)土壤的細(xì)菌物種豐度最低。但處理間細(xì)菌的其它α多樣性指標(biāo)均無(wú)顯著差異。

圖2為細(xì)菌屬水平的相對(duì)豐度，可準(zhǔn)確注釋的屬中，Chujaibacter屬（變形菌門(mén)）相對(duì)豐度最大（1.6461%～5.6787%），其次分別為放線(xiàn)菌門(mén)下的Streptacidiphilus（1.0974%～1.8509%）、Mycobacterium（1.6288%～1.8372%）、Conexibacter（0.4176%～ 0.6762%），和變形菌門(mén)下的Dyella（0.3229% ～0.6238%），以及放線(xiàn)菌門(mén)下的Sinomonas和Streptomyces，變形菌門(mén)下的Burkholderia，Paraburkholderia、綠彎菌門(mén)下的Thermosporothrix和放線(xiàn)菌門(mén)下的Micromonospora等。

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)處理間共有41個(gè)可準(zhǔn)確注釋屬相對(duì)豐度有顯著差異（表3），根據(jù)處理間的差異水平，可以分為3類(lèi)。第1類(lèi)只表現(xiàn)出了品種間的差異，有2個(gè)屬（Kutzneria和Holophaga），其大小順序?yàn)門(mén)7SC205>T7GR4。第2類(lèi)同時(shí)表現(xiàn)出了品種間的差異和根袋內(nèi)外的差異，有4個(gè)屬，其中有2個(gè)屬大小順序?yàn)門(mén)7SC205≈T7soil>T7GR4，包括Flavisolibacter，Candidatus Solibacter;另外2個(gè)屬大小順序?yàn)門(mén)7SC205> T7GR4和T7soil，包括Niastella和Legionella。第3類(lèi)則僅表現(xiàn)出了根袋內(nèi)外的差異，共有35個(gè)屬，其可分為4小類(lèi)：第1小類(lèi)（分類(lèi)號(hào)為3A）有6個(gè)屬，其大小順序?yàn)門(mén)7soil>T7GR4，包括Ralstonia，Pseudonocardia、Sediminibacterium、Nitrolancea、Ornithinibacillus、Chlamydia。除了Ralstonia，其它屬的相對(duì)豐度均較小，范圍在0～0.0014%之間;第2小類(lèi)（3B）有13個(gè)屬，其大小順序均為T(mén)7SC205T7SC205和T7GR4，即根袋外大于根袋內(nèi)，其主要代表有Arthrobacter，Mucilaginibacter，F(xiàn)rateuria等。第4小類(lèi)（3D）有8個(gè)屬，大小順序?yàn)門(mén)7SC205>T7soil，包括Streptacidiphilus，Conexibacter等。

總結(jié)起來(lái)，表現(xiàn)出品種間差異的細(xì)菌屬有6個(gè)，包括分類(lèi)1和2A，2B，均為SC205大于GR4。表現(xiàn)出根袋內(nèi)外差異的細(xì)菌屬有39個(gè)，其中根袋內(nèi)小于根袋外有30個(gè)，包括T7GR4

對(duì)樣本的土壤細(xì)菌群落的OTU數(shù)據(jù)實(shí)施了主坐標(biāo)分析（PCoA），結(jié)果如圖3所示，主成分PC1和PC2對(duì)細(xì)菌群落變異的解釋度僅分別為29.89%和19.59%。而T7GR4的樣點(diǎn)全部分布在一、三象限，另外兩個(gè)處理則分布在二、四象限，說(shuō)明主成分PC1不能成為區(qū)分處理間差異的標(biāo)準(zhǔn)，而PC2則在一定程度上能表征處理間的差異。

2.2 土壤真菌

可準(zhǔn)確注釋到真菌門(mén)分類(lèi)共有6個(gè)，其相對(duì)豐度總和的范圍為38.18%～73.34%，所有樣品平均值為59.92%±9.40%（圖表略）。各處理相對(duì)豐度最高的門(mén)為子囊菌（Ascomycota），其相對(duì)豐度大小為43.71%±11.59%～59.79%±8.05%，其次為毛霉門(mén)（Mucoromycota），各處理相對(duì)豐度大小為0.590%～4.662%;再次為擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota），0.781%～7.863%;壺菌門(mén)（Chytridiomycota），0.118%～0.946%;捕蟲(chóng)霉門(mén)（Zoopagomycota），0.0606%～0.213%;芽枝霉門(mén)的相對(duì)豐度最小0～0.066%。其中處理間的壺菌門(mén)相對(duì)豐度有顯著差異，T1SC205最高（0.946%±0.254%），顯著高于T3SC205（0.349±0.184%），T7soil（0.141%），T7SC205（0.118%±0.123%）（圖4），可見(jiàn)對(duì)根域土壤施肥后壺菌門(mén)受到一定的抑制。

真菌綱共有21個(gè)，相對(duì)豐度（所有樣品平均值）超過(guò)1%的共有5個(gè)，分別是Eurotiomycetes（36.65%），Sordariomycetes（12.89%），Dothideomycete（2.858%），unclassified_p_Mucoromycota（2.689%），Pucciniomycetes（1.656%）（圖4）。有4個(gè)綱表現(xiàn)出了處理間的顯著差異（圖4），其中蘑菇菌綱（Agaricomycetes）和雙生擔(dān)子菌綱（Geminibasidiomycetes）的T7soil顯著高于其它處理，表明相比其它施肥處理，2倍施氮處理顯著提高了土壤中二者的相對(duì)豐度，但該處理的根袋內(nèi)顯著低于根袋外，說(shuō)明受木薯根系影響，其在根袋內(nèi)相對(duì)減少，保持了與其它施肥處理根袋內(nèi)一致的水平。壺菌綱（Chytridiomycetes）則表現(xiàn)為T(mén)1SC205> T7SC205，表明2倍施氮肥會(huì)比不施氮肥顯著降低根袋內(nèi)該真菌綱的相對(duì)豐度。微球黑粉菌綱（Microbotryomycetes）的相對(duì)豐度順序?yàn)門(mén)7soil顯著大于其它所有處理，T3soil其次，T3soil顯著大于T1SC205和T3SC205，該真菌綱對(duì)施肥和木薯根系表現(xiàn)出了一定的敏感性：根袋外施2倍氮肥比施1倍氮肥和不施肥的相對(duì)豐度高，說(shuō)明施2倍氮肥顯著提高真菌該綱的非根際土壤中的相對(duì)豐度;而施1倍和2倍氮肥時(shí)，根袋內(nèi)均小于根袋外，說(shuō)明該真菌綱在施肥的條件下，根袋內(nèi)相對(duì)豐度低于根袋外，但不施肥時(shí)該真菌綱的根袋內(nèi)外無(wú)顯著差異。

對(duì)T1SC205，T3SC205和T7SC205三個(gè)處理進(jìn)行LEfSe結(jié)果表明，僅有肉座菌科（Hypocreaceae）-木霉屬（Trichoderma）-哈茨木霉種（Trichoderma harzianum）有顯著差異（由于結(jié)果比較簡(jiǎn)單，圖表略）。經(jīng)過(guò)查看原始數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)三者為唯一包含關(guān)系，即1科1屬1種。經(jīng)過(guò)方差分析，發(fā)現(xiàn)哈茨木霉表現(xiàn)為T(mén)7SC205≈T3SC205>T1SC205（圖5）。說(shuō)明施肥導(dǎo)致根袋內(nèi)該真菌種相對(duì)豐度顯著增加，由于該種是真菌的優(yōu)勢(shì)種群，很可能表明該真菌種與木薯根域環(huán)境內(nèi)的肥料轉(zhuǎn)化有關(guān)。

各處理間和根袋內(nèi)外土壤真菌屬和種水平的α多樣性的Shannon，Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異（表2）。代表物種豐度的指標(biāo)在處理間有顯著差異：種水平Sobs指標(biāo)（表示觀(guān)察到的物種數(shù)）的處理間差異表現(xiàn)為T(mén)3soil大于T7soil和T7SC205，T3SC205大于T7SC205，屬水平則表現(xiàn)為T(mén)3soil和T3SC205顯著大于T7soil和T7SC205;真菌種ACE指標(biāo)表現(xiàn)為 T3SC205大于T7SC205;種水平Chao1指標(biāo)為T(mén)1soil大于T1SC205和T7soil，屬水平為T(mén)1soil大于T7soil。根據(jù)sobs指標(biāo)和ACE指標(biāo)的結(jié)果表明，表現(xiàn)出了施一倍氮肥比施兩倍氮肥的物種數(shù)高，無(wú)論是屬或者種水平，還是根袋內(nèi)、外。表明增加氮肥用量降低了真菌物種數(shù)。而物種豐度指標(biāo)ACE也部分支持這一觀(guān)點(diǎn)。但Chao1指標(biāo)僅支持施2倍氮肥的真菌物種豐度比不施肥要低。

對(duì)樣本的土壤真菌群落屬水平數(shù)據(jù)實(shí)施了主坐標(biāo)分析（PCoA），結(jié)果如圖3所示，主成分PC1和PC2對(duì)細(xì)菌群落變異的解釋度分別為32.34%和25.18%。T1SC205與T3SC205的三個(gè)樣品，T1soil基本可以聚在一起第二和第一象限，T3SC205的B09SC205樣品可能受到培養(yǎng)過(guò)程中隨機(jī)因素的影響，表現(xiàn)出了單獨(dú)在第三象限，受到PC1的影響大（負(fù)相關(guān)）。而T3soil和T7SC205則都表現(xiàn)出了一定的聚集性，且二者可以通過(guò)PC2來(lái)大致區(qū)分。整體上各處理可以通過(guò)各樣品受到PC1的影響進(jìn)行大致聚類(lèi)。

3 結(jié)論與討論

3.1 根域土壤細(xì)菌群落

在T7（N2PK）處理的可注釋細(xì)菌門(mén)中，放線(xiàn)菌的相對(duì)豐度最大（8.579%～10.697%），其次為變形菌（4.662%～9.390%）、綠彎菌門(mén)，厚壁菌門(mén)、酸桿菌門(mén)等。放線(xiàn)菌是植物根際土中一類(lèi)重要的微生物，在促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面，防治病害方面起到重要作用[26，27]。本研究中，根袋內(nèi)相對(duì)富集的細(xì)菌僅有變形菌門(mén)，其根袋內(nèi)相對(duì)豐度顯著大于根袋外，可能說(shuō)明變形菌門(mén)比較適應(yīng)木薯根域內(nèi)根際分泌物豐富的區(qū)域。而根域內(nèi)相對(duì)減少的細(xì)菌有5個(gè)門(mén)6個(gè)綱，包括浮霉菌門(mén)及其下屬的Planctomycetia等3個(gè)綱，綠彎菌門(mén)及其下屬的Ktedonobacteria綱，柔膜菌門(mén)（Tenericutes） 及其唯一下屬的柔膜菌綱（Mollicutes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes），還有硝化螺旋菌門(mén)及其下屬唯一的綱。不同的物種根際微生物特征不一致，如楊美玲等[28]的研究表明裕民紅花根際土壤的放線(xiàn)菌門(mén)、變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)等;葉文雨等[29]的研究結(jié)果表明，菌草根際土檢測(cè)到細(xì)菌類(lèi)群主要的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為酸桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、厚壁菌門(mén)等。趙悅[30]的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)BT基因棉花根分泌物進(jìn)入土壤后提高了綠彎菌和酸桿菌相對(duì)豐度，降低了變形菌和放線(xiàn)菌的相對(duì)豐度。艾超[31]發(fā)現(xiàn)小麥根際碳沉積分解轉(zhuǎn)化過(guò)程中變形菌和放線(xiàn)菌發(fā)揮了關(guān)鍵作用，而根際酸桿菌、綠彎菌、厚壁菌、擬桿菌主要參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解。而根系分泌物的數(shù)量與質(zhì)量是影響根際細(xì)菌群落的重要因素[29]，木薯根域土壤微生物的特征還需要更深入的研究。

表現(xiàn)出品種間差異的細(xì)菌共有1個(gè)、6個(gè)綱，包括硝化螺旋菌門(mén)、硝化螺旋菌綱、δ變形菌綱、全噬菌綱、索利氏菌綱、Chitinophagia綱，鞘脂桿菌綱，前面5個(gè)綱相對(duì)豐度大小均為SC205> GR4，最后一個(gè)相反。其中硝化螺旋菌門(mén)下僅有一個(gè)屬即硝化螺旋菌屬，作為硝化細(xì)菌（Nitrifier），可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽[32]，這是反硝化作用的一個(gè)步驟。該屬同時(shí)表現(xiàn)出了品種差異和根袋內(nèi)外差異。根袋內(nèi)外差異的差異可能是由于氧化還原電位的差異，或者受到根際的影響。有研究認(rèn)為：根分泌物刺激細(xì)菌的呼吸作用和根呼吸作用增強(qiáng)所導(dǎo)致O2分壓的下降，是所觀(guān)察到活根刺激反硝化作用加強(qiáng)的原因[33]。而根袋內(nèi)品種間的差異則很可能暗示了品種對(duì)根際氮利用的差異。不同木薯品種對(duì)氮的吸收的差異可能反應(yīng)在根際微生物上，可繼續(xù)深入研究證實(shí)。而全噬菌綱、索利氏菌綱屬于酸桿菌門(mén)，而酸桿菌門(mén)是一種寡營(yíng)養(yǎng)的細(xì)菌[34]，寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌的相對(duì)豐度很可能與根系分泌物的量和成分有關(guān)系，需要進(jìn)一步研究。

另外，細(xì)菌中出現(xiàn)的浮霉菌門(mén)是一小門(mén)水生細(xì)菌，在海水、半咸水、淡水中都可被發(fā)現(xiàn);綠彎菌門(mén)是兼性厭氧生物，在光合作用中不產(chǎn)生氧氣，不能固氮，在本研究中較大量出現(xiàn)（相對(duì)豐度2.750%±0.576%～5.342%）;還有適宜水生和土壤環(huán)境的疣微菌門(mén)，以及極低豐度的能進(jìn)行產(chǎn)氧氣光合作用的藍(lán)細(xì)菌，并有極微量的藍(lán)藻門(mén)。這些細(xì)菌門(mén)類(lèi)的出現(xiàn)的對(duì)本研究的培養(yǎng)環(huán)境的反應(yīng)：該試驗(yàn)在室外進(jìn)行，盆內(nèi)雨水容易聚集。但根袋內(nèi)土壤很可能受到根系影響，減少了浮霉菌門(mén)和綠彎菌門(mén)等的相對(duì)豐度，即減少了培養(yǎng)環(huán)境的影響。細(xì)菌中出現(xiàn)的適宜水生和可光合作用的細(xì)菌包括浮霉菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、疣微菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌、藍(lán)藻門(mén)等，是對(duì)試驗(yàn)環(huán)境的反應(yīng)。

表現(xiàn)出品種間差異的細(xì)菌屬有6個(gè)：黃桿菌（Flavisolibacter，0.003%-0.083%），Candidatus Solibacter（0.009%～9.069%），Kutzneria，Holophaga，Niastella（0.008%～0.223%），Legionella（0.003%～0.068%），且均為SC205>GR4。其中Holophaga下屬有細(xì)菌種可以降解甲氧基化芳香化合物[35]。品種間存在差異的細(xì)菌很可能與根系分泌物的差異有關(guān)。

表現(xiàn)出品種間差異的細(xì)菌屬有6個(gè)，包括Flavisolibacter（0.003%～0.083%），Candidatus Solibacter（0.009%～9.069%），Kutzneria，Holophaga，Niastella（0.008%～0.223%），Legionella（0.003%～0.068%），且均為SC205大于GR4。表現(xiàn)出根袋內(nèi)外差異的細(xì)菌屬有39個(gè)，其中根袋內(nèi)小于根袋外有30個(gè)，T7GR4

GR4根域特有6個(gè)細(xì)菌種，包括有酸土環(huán)脂芽孢桿菌，噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga sp.BHS15）等，SC205根域則僅獨(dú)有1個(gè)細(xì)菌種：Novosphingobium sp.，其為鞘脂單胞菌科下的屬。鞘脂單胞菌科中的部分細(xì)菌具有降解酚類(lèi)物質(zhì)的功能[41]。特有種表明一定的專(zhuān)一性，也暗示著特殊的根系分泌物成分。

細(xì)菌α多樣性結(jié)果表明2倍施氮量處理GR4根域土壤的細(xì)菌物種豐度小于SC205根域和非根際土壤。品種間的細(xì)菌多樣性有所差異，蘇小惠等[15]研究表明不同苧麻品種根際微生物的α多樣性也有一定的差異。

總之，品種間根域細(xì)菌群落的差異暗示品種間根系分泌物的差異。

3.2 根域土壤真菌群落

各處理真菌相對(duì)豐度最高的門(mén)為子囊菌門(mén)（43.71%±11.59%～59.79%±8.05%），其次為毛霉門(mén)，擔(dān)子菌門(mén)等。真菌綱共有21個(gè)，相對(duì)豐度最大的為Eurotiomycetes（36.65%），Sordariomycetes（12.89%），Dothideomycete（2.858%），Pucciniomycetes（1.656%）等。方差分析表明施肥比不施肥處理降低了木薯根域土壤壺菌門(mén)（Chytridiomycota）的相對(duì)豐度。真菌有4個(gè)綱表現(xiàn)出了處理間的顯著差異。相對(duì)于根域土壤，2倍施氮量提高了非根際土壤中的Agaricomycetes，Geminibasidiomycetes和Microbotryomycetes綱的相對(duì)豐度，三者的相對(duì)豐度均在有施肥的根域內(nèi)顯著降低，說(shuō)明三者對(duì)施肥和根域土壤均有相應(yīng)。Chytridiomycetes綱則表現(xiàn)為T(mén)1SC205> T7SC205，表明2倍施氮肥會(huì)比不施氮肥顯著降低根袋內(nèi)該真菌綱的相對(duì)豐度。

LEfSe結(jié)果表明：哈茨木霉的相對(duì)豐度順序?yàn)門(mén)7SC205≈T3SC205>T1SC205。說(shuō)明施肥導(dǎo)致根袋內(nèi)該真菌種相對(duì)豐度顯著增加，由于該種是真菌的優(yōu)勢(shì)種群，很可能表明該真菌種與木薯根域環(huán)境內(nèi)的肥料轉(zhuǎn)化有關(guān)。哈茨木霉也是益生菌，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，也對(duì)植物病蟲(chóng)害有一定的防治效果[42-44]。哈茨木霉在木薯根域的出現(xiàn)暗示著其可能在木薯根域起作用，添加含有哈茨木霉的菌劑可能對(duì)木薯有一定的作用，需要進(jìn)一步的研究。

3.3 根域土壤微生物α多樣性

真菌α多樣性則表現(xiàn)出了粘土1倍施氮量比2倍處理的物種豐度高，無(wú)論是屬還是種水平，根袋內(nèi)或者根袋外。Chao1指標(biāo)還支持2倍施氮量的真菌物種豐度比不施肥的低。總之，本研究中施肥或者施2倍氮肥減少了真菌物種豐度。這與其它研究得到的結(jié)論有異同，如單施化肥增加了紅壤真菌種群豐度與多樣性，但是對(duì)細(xì)菌的種群豐度與多樣性影響不大[45]。Zhou 等[46]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)東北黑土增施用氮肥和氮、磷肥配施可增加真菌數(shù)量，降低真菌多樣性。丁建莉等[47]的研究結(jié)果表明，施化肥對(duì)黑土中真菌多樣性影響不顯著，對(duì)真菌豐度也沒(méi)有顯著影響。聶三安等[48]研究表明黃泥田水稻土三個(gè)處理（不施肥CK、單施化肥NPK、化肥配施秸稈NPKS）的細(xì)菌α多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)無(wú)顯著性差異，但NPK處理的Chao1和ACE指數(shù)均顯著低于CK和NPKS處理。真菌的4個(gè)α多樣性指數(shù)均表現(xiàn)為NPK處理顯著低于CK和NPKS處理?？梢?jiàn)，施肥處理對(duì)土壤微生物多樣性指標(biāo)因土壤和作物等有所差異。

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