角膜晶狀體蛋白醛脫氫酶分類和功能的研究進展

任沐晨 何宇茜 王淑榮 張妍

角膜作為眼球最前端的透明的非血管組織，在引導(dǎo)外部光線至眼部，并抵御紫外線、入侵的微生物和環(huán)境毒素等外界刺激方面有著重要作用。就引導(dǎo)外部光線至眼部而言，醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase，ALDH）作為角膜晶狀體蛋白參與了角膜折光系統(tǒng)的組成。就抵御由紫外線引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)而言，角膜形成了以代謝酶和小分子形式存在的強大的抗氧化劑防御系統(tǒng)，ALDH便是防御系統(tǒng)中重要的一環(huán)。ALDH通過其代謝特性、伴侶活性和抗氧化劑還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）[Reduced nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate)，NAD(P)H]的生成來避免紫外線輻射（Ultraviolet radiation，UVR）誘導(dǎo)的損傷[1]，減輕角膜氧化應(yīng)激反應(yīng)，進一步維持角膜透明度和折射率。此外，ALDH還參與角膜細胞分裂分化的調(diào)節(jié)，在維持不同物種角膜的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著不可替代的作用。隨著ALDH在角膜結(jié)構(gòu)、細胞活動、氧化應(yīng)激等方面的研究日益受到重視，ALDH與眼病的關(guān)系也逐漸成為眼科焦點。盡管其相關(guān)機制目前尚不十分清楚，但對ALDH更深入的研究可能為未來臨床眼病的治療提供新的思路和更有效的靶標。筆者將對ALDH在角膜中的分類、功能及臨床應(yīng)用前景進行綜述。

1 ALDH作為角膜晶狀體蛋白的起源、種類及表達位置

角膜晶狀體蛋白為具有代謝功能的多種胞質(zhì)蛋白，顯示分類群特異性并在透明角膜組織中有高水平積累，其晶狀體蛋白的多樣性源自晶狀體蛋白基因啟動子內(nèi)多個獨立形成的Pax6/PaxB結(jié)合位點的融合進化?，F(xiàn)已證實調(diào)節(jié)ALDH1A3、ALDH3A1[2]和X-crystallin/ALDH1A9合成的基因都受Pax6調(diào)控[3]。盡管原始ALDH基因是否也受到Pax6/PaxB的調(diào)控這一問題仍不明確，但經(jīng)實驗驗證Pax6/PaxB和ALDH之間的直接聯(lián)系符合“插層進化”假說。ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH1A3中的PaxB在眼的形成和進化中是視黃酸代謝中的重要酶，而視黃酸是控制眼發(fā)育的關(guān)鍵因素。在晶狀體進化之前，ALDH基因?qū)τ谧钤佳鄣男纬梢呀?jīng)非常重要，并且可以擴展到它與角膜晶狀體蛋白相關(guān)的功能。

一個原始ALDH基因通過多次基因復(fù)制，擴展為一個多基因家族。目前已知的ALDH類角膜晶狀體蛋白種類已達24種。ALDH的第一個公認的角膜晶狀蛋白是同源二聚體ALDH3A1，其最初被鑒定為是牛眼角膜中的一種特定抗原（牛角膜54-kDa蛋白）。迄今為止，研究人員已在人類中發(fā)現(xiàn)20個醛脫氫酶超家族的基因，在真核生物中發(fā)現(xiàn)24個[4-5]。ALDH1、ALDH2和ALDH3家族的成員在脊椎動物和無脊椎動物的角膜中以分類群特異性方式高度表達。ALDH3A1存在于人類、牛、豬、小鼠、大鼠、狒狒等大多數(shù)哺乳動物的角膜中，主要在角膜上皮、角膜基質(zhì)細胞中表達，占角膜晶狀體蛋白的5%～50%[6]。ALDH1A1是另一種常見的角膜晶狀體蛋白，存在于人以及兔子、雞、青蛙、鱒魚等脊椎動物的角膜中。在人類角膜中，ALDH1A1主要分布于角膜上皮和基質(zhì)層，約占角膜總可溶性蛋白的3%[1]。ALDH1A1兔子、雞、青蛙和鱒魚等脊椎動物也在角膜中大量表達[7-8]。在兔角膜中，ALDH1A1分別占上皮、基質(zhì)層和內(nèi)皮總可溶性蛋白的3%、16%和11%。ALDH2存在于雞、鱒魚和斑馬魚等動物角膜中[4]，主要在角膜上皮細胞和基質(zhì)層細胞中表達，其表達水平與ALDH1A1的表達水平相當[9]。ALDH家族中在眼部發(fā)現(xiàn)的還有ALDH1A8、ALDH1A9、ALDH1C1/2等，均由角膜細胞合成[10]。

2 ALDH功能的研究進展

ALDH主要在維持角膜的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)細胞周期、減輕角膜氧化應(yīng)激反應(yīng)和減輕自由基對角膜傷害等方面起作用。結(jié)構(gòu)方面，ALDH作為光學(xué)元件參與維持角膜透明性、減少入射光的散射并維持角膜折射率；細胞周期方面，ALDH參與調(diào)節(jié)角膜細胞的增殖與分化；減輕角膜氧化應(yīng)激反應(yīng)方面，ALDH可減少脂質(zhì)過氧化，避免角膜蛋白酶體失活或降解；減輕自由基對角膜傷害方面，ALDH可對UVR進行直接吸收并協(xié)助角膜的抗氧化劑功能。

2.1 ALDH是角膜結(jié)構(gòu)要素的一部分

ALDH作為角膜晶狀體蛋白維持著角膜透明結(jié)構(gòu)。Chen等[11]為了評估ALDH3A1和ALDH1A1對角膜光散射特性的影響，將小鼠分為3組進行實驗：ALDH3A1基因單敲除小鼠、ALDH1A1基因單敲除小鼠和ALDH1A1、ALDH3A1基因雙敲除小鼠，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠角膜有少量散射，并且在9 個月后所有小鼠均出現(xiàn)白內(nèi)障癥狀，這與蛋白酶活性降低和氧化蛋白增加有關(guān)[11]。此外，小鼠和大鼠出生后9～14 d，尤其是在它們睜開眼時，ALDH3A1的含量迅速增加，并且Torricelli和Wilson[12]與Raghunathan等[13]研究發(fā)現(xiàn)兔角膜傷口愈合過程失調(diào)易形成基質(zhì)混濁或瘢痕，伴有角膜晶狀體蛋白ALDH3A1、ALDH1A1表達降低，光散射增加，并產(chǎn)生結(jié)構(gòu)紊亂、不透明的細胞外基質(zhì)。Meek和Knupp[14]研究表明，ALDH3A1和ALDH1A1極大地提高了角膜組織的透明度和折射能力，證實了ALDH是角膜光學(xué)元件的組成部分。

2.2 ALDH調(diào)節(jié)角膜細胞的增殖與分化

ALDH3A1抑制角膜上皮細胞和角膜成纖維細胞的增殖，使細胞具有更長的倍增時間，更長的細胞周期長度和更低的集落形成效率。Koppaka等[15]在實驗中建立了Tet-On人角膜上皮細胞系，該系表達四環(huán)素誘導(dǎo)的野生型或催化失活的ALDH3A1。實驗觀察到人角膜上皮細胞的增殖速率隨ALDH3A1的表達而降低，與不表達ALDH3A1蛋白的細胞相比，這些細胞的種群倍增時間延長，同時伴隨著鋪板效率的降低和DNA合成減少。細胞周期蛋白A，B，E，E2F和p21 被下調(diào)，細胞周期蛋白依賴性激酶活性也降低。在體內(nèi)角膜傷口愈合模型中，ALDH3A1的表達在損傷后立即下調(diào)，與損傷部位周圍的基底細胞的活性增殖期一致。實驗結(jié)果表明ALDH3A1抑制角膜細胞的增殖。同時，在另一組小鼠角膜中，僅在ALDH1A1、ALDH3A1基因雙敲除小鼠中注意到細胞增殖加快，這表明ALDH1A1 可以在一定程度上抵消ALDH3A1的抗增殖效果。ALDH蛋白之間可能存在相互作用。此外，角膜中的ALDH1A1 可以通過氧化ALDH3A1的底物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）來補償ALDH3A1[16]。

ALDH3A1還可調(diào)節(jié)角膜上皮分化[17]。在高鈣濃度下生長的永生化人角膜上皮細胞系中，ALDH3A1表達改變了一組角膜分化標志物的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，并可通過其酶活性進行調(diào)節(jié)。此外，ALDH家族的ALDH1A1，ALDH1A2，ALDH1A3，ALDH1A7和ALDH8A1中的PaxB是在眼的形成和進化以及視黃酸代謝過程中的重要酶[18]，可催化視黃醛不可逆地轉(zhuǎn)化為視黃酸，后者通過調(diào)節(jié)類維生素A信號的傳導(dǎo)在發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，是控制眼發(fā)育的關(guān)鍵因素[19]，可與視黃醛共同調(diào)控基因表達，減弱上皮細胞向鱗片狀分化，增加上皮生長因子受體的數(shù)量。它與和DNA連接及調(diào)控基因表達有關(guān)的受體結(jié)合，可調(diào)節(jié)上皮組織的導(dǎo)向分化。

準分子激光角膜切削術(shù)后或角膜移植失敗后發(fā)生混濁、瘢痕化或凍傷角膜病變區(qū)的角膜細胞中，ALDH所占比例會明顯下降[20-21]。臨床應(yīng)用姜黃素可明顯減輕角膜基質(zhì)細胞纖維化程度，隨著姜黃素質(zhì)量濃度的增加，ALDH mRNA表達量增加，對角膜基質(zhì)細胞增生的抑制率逐漸增加，在術(shù)后修復(fù)中起到抑制角膜瘢痕生成的作用[22]。此外，Yusof等[23]的實驗發(fā)現(xiàn)富含洋槐蜜的培養(yǎng)基中角膜細胞醛脫氫酶的基因表達較高，可促進離體角膜細胞增殖，證實了角膜細胞中的ALDH可被洋槐蜜保留用以對抗角膜瘢痕形成和促進角膜傷口愈合。ALDH的這一特性為研發(fā)促進角膜傷口愈合的潛在天然產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)。角膜晶狀體蛋白在對抗角膜瘢痕形成，促進角膜傷口愈合中有重要作用，為藥物研發(fā)提供了新思路。ALDH3A1等醛脫氫酶的表達可能有助于角膜再生。有研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜中含有干細胞分化后的角膜基質(zhì)細胞表達ALDH3A1等標志物，有助于角膜再生[24]。

2.3 ALDH減輕角膜氧化應(yīng)激反應(yīng)

氧化應(yīng)激與脂質(zhì)膜的氧化降解有關(guān)，也稱為脂質(zhì)過氧化。此過程會產(chǎn)生200多種醛，其中許多具有高反應(yīng)性和毒性。對于產(chǎn)生的活性氧和不間斷積累引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的數(shù)百種醛，ALDH3A1可進行代謝，減輕氧化應(yīng)激并促進角膜細胞中DNA氧化損傷的修復(fù)[25-26]。Voulgaridou等[26]建立了穩(wěn)定表達人ALDH3A1 基因的HCE-2 細胞系，分別用不同氧化劑處理后發(fā)現(xiàn)表達ALDH3A1 的細胞均具有較低的ROS水平，證實了其極強的抗氧化保護作用。此外，HCE-2 細胞系中大多數(shù)與DNA損傷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（DNA damage signaling，DDS）相關(guān)蛋白的基因表達被上調(diào)，說明ALDH3A1 可能通過改變特定DDS相關(guān)基因的表達來維持DNA完整性，從而維持角膜穩(wěn)態(tài)。ALDH可減輕糖尿病大鼠眼組織的脂質(zhì)氧化損傷，在預(yù)防糖尿病相關(guān)性眼部并發(fā)癥發(fā)生方面發(fā)揮一定的作用[27-29]。

ALDH超家族包含NAD（P）+依賴性酶，可將多種內(nèi)源性醛和外源性醛氧化為相應(yīng)的羧酸。在數(shù)百種醛中，最具代表性的醛是4-羥基-2-壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE），它在細胞中可以使蛋白酶體失活或降解。受損蛋白質(zhì)的積累將對角膜透明性產(chǎn)生不可逆的不良影響。ALDH3A1 的表達抑制了促進4-HNE加成的蛋白質(zhì)的形成，從而避免了4-HNE誘導(dǎo)的細胞毒性和凋亡。ALDH3A1轉(zhuǎn)染的細胞對4-HNE 誘導(dǎo)的細胞毒性具有更高的抵抗力[30]。ALDH1A1 也可代謝4-HNE和MDA[31]。ALDH3A1和ALDH1A1 保護細胞免受4-HNE的不利影響。以乙醇為例，乙醇主要被乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）氧化成乙醛，后主要被ALDH2 進一步氧化成乙酸。ADH和ALDH都需要的輔助因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）被轉(zhuǎn)化為還原形式NADH[32]，這個過程可能導(dǎo)致NAD+/NADH失衡引發(fā)線粒體功能受損，會促進ROS的形成并增強氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而引發(fā)脂質(zhì)過氧化并產(chǎn)生反應(yīng)性醛如4-HNE，會誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和DNA的共價修飾[33]。在人類20種ALDH同工酶中，ALDH2是乙醇衍生乙醛代謝最有效的酶[34-35]。在ALDH2過表達小鼠中的研究表明，增強ALDH2活性可以減輕乙醇乙醛的毒性，修復(fù)氧化應(yīng)激引起的角膜急性或慢性損傷[36-37]。ALDH1A1 和ALDH1B1 也對這一過程有貢獻，ALDH1A1能夠?qū)⒁朁S醛氧化為視黃酸[38]，還能代謝乙醇代謝物乙醛和脂質(zhì)過氧化物的主要產(chǎn)物等。屈光手術(shù)中酒精法去上皮會影響角膜上皮緊密連接的修復(fù)，在壓陷式眼壓計接觸角膜時，乙醇消毒后，并未徹底揮發(fā)干凈，此時也會造成部分角膜上皮灼傷、剝脫[39]。ALDH在這種情況下即可發(fā)揮作用，減輕角膜氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.4 ALDH保護眼部免受UVR誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基的傷害

UVR進入眼會帶給眼球較嚴重的傷害，可導(dǎo)致鏈斷裂、蛋白質(zhì)交聯(lián)以及嘧啶和胸腺嘧啶二聚體在DNA鏈中的形成。有研究顯示UVR可以引起眼部炎癥[40]，進一步的影響包括白介素-1的釋放，單線態(tài)氧、超氧陰離子、羥基和過氧自由基的增加，都會導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終將造成光化性角膜炎、白內(nèi)障、黃斑變性等眼部疾病。

在眼最前部角膜處ALDH對抵御UVR具有重要作用，它們是抵抗紫外線輻射引起的眼組織損傷的細胞防御機制的重要組成部分。在Marchitti等[41]實驗中，與對照組相比，高劑量紫外線照射（0.2 J/cm2）導(dǎo)致所有ALDH缺乏癥小鼠出現(xiàn)嚴重的角膜水腫。ALDH抵御UVR的機制主要表現(xiàn)為以下4個方面：①ALDH可對UVR進行直接吸收[41]。在角膜中高度表達的ALDH3A1 會變性并被UVR滅活，這被視為一種變相的被動保護。②ALDH可清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物和衍生物。ALDH3A1的活性氧自由基清除作用是其抗氧化作用的體現(xiàn)[41]，可保護角膜免受氧化劑誘導(dǎo)的氧化和遺傳毒性影響[26]。③角膜中失活蛋白ALDH3A1 的聚集還可防止晶狀體內(nèi)晶狀體蛋白積聚誘發(fā)的白內(nèi)障[6]。Lassen等[42]實驗證明角膜中缺乏ALDH3A1可導(dǎo)致角膜中過氧化醛或其他ROS積累并進入晶狀體造成晶狀體混濁。角膜中的ALDH3A1、ALDH1A1可能通過過濾紫外線及時代謝UVR誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化物，避免在角膜中積累的醛擴散到晶狀體中，保護了晶狀體免受環(huán)境引起的氧化損傷，降低了白內(nèi)障發(fā)病率。④作為分子伴侶的ALDH3A1可產(chǎn)生抗氧化劑NAD（P）H協(xié)助角膜的抗氧化劑功能。蛋白酶體是負責清除受損蛋白質(zhì)的主要蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)[43]，ALDH3A1可修飾其活性來阻止UVR引起的氧化損傷。作為一種新型分子伴侶，ALDH3A1在保持活性酶的還原能力的同時，還可促進其他新合成蛋白的穩(wěn)定并加快其折疊變性[6]。在Voulgaridou等[44]研究中，ALDH3A1在4 ℃高溫下可保護檸檬酸合酶免受熱失活。

3 ALDH的實驗應(yīng)用與腫瘤治療

ALDH作為角膜實驗中必不可少的檢測指標參與了多項研究[1,42,45-47]。ALDH可作為靜息角膜基質(zhì)細胞的分子標記參與實驗結(jié)果檢測。角膜處于傷口愈合過程中或離體培養(yǎng)基中時，存在的血清或生長因子會激活角膜基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞和成肌纖維細胞，ALDH蛋白不再表達，失去角膜基質(zhì)細胞的功能，這對于將離體角膜細胞摻入基于細胞的治療中以維持正常的角膜透明度和功能至關(guān)重要。ALDH3A1 也可作為判斷角膜上皮細胞是否處于增殖狀態(tài)的一個標志。由于ALDH3A1 的表達與細胞增殖速率之間呈反比關(guān)系，在活躍增殖的人原代角膜上皮細胞中，ALDH3A1基因逐漸喪失表達，而在ALDH3A1穩(wěn)定表達的人角膜上皮細胞則顯示出生長減慢、細胞周期延長。ALDH在檢測角膜基質(zhì)細胞形態(tài)和發(fā)炎狀況中也起著重要作用。在培養(yǎng)的圓錐角膜基質(zhì)細胞中發(fā)現(xiàn)ALDH明顯減少，而圓錐角膜正與角膜炎癥狀態(tài)有關(guān)[45]。此外，ALDH也充當評估角膜信號傳導(dǎo)通路的標志物。在探討慢性史蒂文斯-約翰遜綜合征（Stevens-Johnson syndrome，SJS）中類維生素A代謝基因表達的改變的實驗中，Srividya等[47]通過ALDH1A1的表達量評估患者維甲酸受體信號傳導(dǎo)中視黃酸受體的基因表達情況。有關(guān)ALDH在調(diào)節(jié)角膜穩(wěn)態(tài)中新作用的見解可最終轉(zhuǎn)化為針對角膜病理學(xué)如干眼癥、角膜損傷、基于感染引起的角膜瘢痕、角膜混濁和白內(nèi)障[48-49]等更有效的治療干預(yù)措施，奠定了探索與晶狀體蛋白相關(guān)的眼病病理生理機制的基礎(chǔ)，并為其臨床應(yīng)用提供了潛在的治療靶標。

目前對角膜中ALDH的研究方興未艾，但很多臨床應(yīng)用都處于研究階段，較為有限，ALDH的腫瘤治療為研究重點。ALDH活性是癌癥干細胞的重要特征[50]，在這些細胞中ALDH的表達有助于消除氧化應(yīng)激并賦予癌細胞對化學(xué)治療劑（如草氮磷，紫杉烷和鉑類藥物）的抗性[51]。ALDH是多種腫瘤的治療靶標[52]，如針對膠質(zhì)母細胞瘤和結(jié)直腸細胞中的重要靶標ALDH1A3、ALDH1A3的選擇性競爭性抑制劑可體外抑制癌細胞的生長侵襲[53]。我們也期待角膜晶狀體蛋白ALDH這一充滿潛力的研究課題取得更多突破性進展。

4 小結(jié)

ALDH作為角膜晶狀體蛋白對角膜、晶狀體和視網(wǎng)膜在保持結(jié)構(gòu)和功能方面都是必不可少的，其可維持角膜透明性、調(diào)節(jié)細胞周期、抵御UVR、抗氧化應(yīng)激、降低白內(nèi)障發(fā)病率和抑制角膜瘢痕生成，在維持角膜穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。隨著對ALDH的不斷研究，對ALDH超家族的研究會更加深入。更前沿地了解與ALDH相關(guān)的眼部疾病發(fā)病機制可為角膜疾病、晶狀體疾病等的預(yù)防和治療方面提供新的研究思路。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明任沐晨：收集數(shù)據(jù)；參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋；撰寫論文。何宇茜：參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論。王淑榮：資料的分析與解釋，修改文中關(guān)鍵性結(jié)論。張妍：主持選題、設(shè)計、資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)論