一例長(zhǎng)頸鹿支原體感染的診斷

何松，湯德元，毛茵茗，周飄，廖正波，袁盛林，陳旭

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

支原體又稱霉形體，天然無(wú)細(xì)胞壁，細(xì)胞柔軟，高度多形性，其大小介于細(xì)菌和病毒之間，具有三層膜結(jié)構(gòu)，可通過200～450 納米孔徑的濾膜，以二分裂方式生長(zhǎng)繁殖，在液體或固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較慢，一般在5%CO2細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 天，染色其形狀呈典型的“油煎蛋”樣，革蘭氏染色陰性但著色效果不佳，姬姆薩染色良好。支原體于1961 年在美國(guó)首次于病?；加腥橄傺椎牟×现蟹蛛x出，我國(guó)在1983 年首次在患有牛乳腺炎的牛奶中分離到牛支原體。目前，支原體廣泛分布于自然界，許多動(dòng)物都有感染，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近200 種。支原體在避免陽(yáng)光直射條件下可存活數(shù)周，在4℃牛乳和海綿中可存活2 個(gè)月之久，在水中可存活2 周以上，但支原體一般不耐高溫，在65℃經(jīng)2 分鐘、70℃經(jīng)1 分鐘即可失活，但在4℃～37℃液體介質(zhì)中的存活力不受影響，可以存活半年之久。支原體能夠引起動(dòng)物呼吸系統(tǒng)疾病、關(guān)節(jié)炎、乳腺炎或角膜結(jié)膜炎等癥狀，給世界相關(guān)養(yǎng)殖戶帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

長(zhǎng)頸鹿是一種生長(zhǎng)在非洲稀樹草原地帶以樹葉及小樹枝為主食的反芻偶蹄動(dòng)物，隸屬于哺乳綱長(zhǎng)頸鹿科，是世界上現(xiàn)存最高的陸生動(dòng)物,牙齒為原始的低冠齒, 舌長(zhǎng)且靈活, 具短角, 角上被有毛的皮膚覆蓋。成年長(zhǎng)頸鹿高4～6 米，體重600～900 千克，是當(dāng)前最具觀賞性的陸生動(dòng)物。羅琴等人調(diào)查了廣州市某野生動(dòng)物園草食類及靈長(zhǎng)類野生動(dòng)物腸道寄生蟲的感染情況，他們采用糞便檢查法共檢查36 種動(dòng)物500 份糞樣，總陽(yáng)性率達(dá)到了50.6%，其中長(zhǎng)頸鹿、角馬、彎角劍羚樣品多為混合感染，表明長(zhǎng)頸鹿等野生動(dòng)物被一些寄生蟲及微生物混合感染較為普遍。在本病例中，我們發(fā)現(xiàn)貴州森林野生動(dòng)物園一只長(zhǎng)頸鹿發(fā)病死亡，其臨床癥狀表現(xiàn)為精神沉郁、消瘦、食欲下降和呼吸困難，病程大約一個(gè)星期，根據(jù)其臨床癥狀疑似支原體感染，隨后我們采集其心臟、肺臟和肝臟等病變組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，以期從樣品病料中找到長(zhǎng)頸鹿死亡原因，為今后更好保護(hù)長(zhǎng)頸鹿預(yù)防支原體感染提供參考。

1 臨床癥狀

長(zhǎng)頸鹿的發(fā)病臨床癥狀為消瘦、食欲下降、呼吸急促、頻率60 次/分鐘，體溫升高達(dá)40.3℃，病程大約一個(gè)星期，對(duì)死亡長(zhǎng)頸鹿進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)：肺有壞死點(diǎn)，心臟有大量的心包積液。采集病變樣品：心包積液、肝臟和肺臟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 細(xì)菌鏡檢

對(duì)送檢長(zhǎng)頸鹿心組織、肝組織、肺組織進(jìn)行革蘭氏染色：初染，滴加結(jié)晶紫，染色1～2 分鐘，水洗；媒染，用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1分鐘，水洗；脫色，用濾紙吸取或甩去載玻片上的殘水，將載玻片傾斜，在白色背景下，用滴管滴加95%乙醇脫色，直至流出的乙醇無(wú)紫色時(shí)（20～30秒），立即水洗；復(fù)染，用藩紅復(fù)染約2 分鐘，水洗；鏡檢，用濾紙吸水，干燥后，顯微鏡油鏡觀察。鏡下檢查結(jié)果顯示：有少許革蘭氏陰性菌。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無(wú)菌操作從死亡的長(zhǎng)頸鹿的肺組織﹑心臟組織和肝組織取樣分別劃線接種于需氧及厭氧的血清LB 培養(yǎng)基培和麥康凱培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 小時(shí)，LB 培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上未見細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.3 支原體PCR 檢測(cè)

病死長(zhǎng)頸鹿的肺部等剖檢病變不能作為診斷的依據(jù), 必須采用實(shí)驗(yàn)室診斷以進(jìn)行確診，取肺組織﹑心臟組織和肝組織各一小塊置于研缽中碾碎，再用勻漿機(jī)打碎組織，打碎組織后反復(fù)凍融3 次，取上清100 微升，加入200 微升蛋白酶K，再加入200 微升溶液AL，渦旋振蕩15 秒，56℃孵育10 分鐘。實(shí)驗(yàn)室保存的陽(yáng)性病料處理：取陽(yáng)性對(duì)照100 微升，加入20 微升蛋白酶K，再加入200 微升溶液AL，渦旋振蕩15 秒，56℃孵育10 分鐘，之后按照支原體DNA 的提取試劑盒要求提取DNA。PCR 擴(kuò)增每份總體積25 微升，2微升Taq DNA 聚合酶，2 微升模板DNA，2 微升引物，最后加ddH2O 到25 微升。在PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 分鐘、94℃變性30 秒、50℃退火30 秒、72℃延伸45 秒，共35 次，最后72℃延伸10 分鐘。反應(yīng)結(jié)束后取7 微升PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。其結(jié)果中檢測(cè)出支原體特異性陽(yáng)性條帶，結(jié)合前面的臨床癥狀和診斷，表明長(zhǎng)頸鹿死于支原體感染。

3 討論

本研究通過對(duì)死亡長(zhǎng)頸鹿的相關(guān)臟器進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及PCR 鑒定，從肺臟和心臟中檢測(cè)出支原體特異性陽(yáng)性條帶，結(jié)合臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室診斷綜合分析，診斷為支原體感染引起的肺炎和心肌炎造成長(zhǎng)頸鹿死亡。支原體感染往往并不導(dǎo)致直接致命的損傷，而是通過長(zhǎng)期持續(xù)的感染，誘發(fā)機(jī)體發(fā)生免疫損傷和凋亡而導(dǎo)致病變及續(xù)發(fā)感染，進(jìn)而導(dǎo)致患病動(dòng)物的死亡。肺炎支原體致病菌株在肺組織中具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)繁殖能力，能引起肺部炎癥，并誘發(fā)嚴(yán)重的續(xù)發(fā)感染，從而導(dǎo)致感染動(dòng)物死亡。本病例中長(zhǎng)頸鹿感染支原體而死亡，為長(zhǎng)頸鹿支原體病防控敲響了警鐘。

圖 支原體PCR 擴(kuò)增結(jié)果

國(guó)內(nèi)動(dòng)物園關(guān)于長(zhǎng)頸鹿支原體感染的病例報(bào)道很少，如果日常飼養(yǎng)管理中觀察不夠細(xì)致，極有可能延誤最佳治療期，導(dǎo)致病情加重而死亡。由于支原體沒有細(xì)胞壁，因此對(duì)青霉素和頭孢類藥物不敏感，用來(lái)治療支原體的感染其效果不佳；而支原體對(duì)環(huán)丙沙星、四環(huán)素、泰樂菌素、泰妙菌素等抗菌藥物較為敏感，可以對(duì)支原體的感染起到一定的治療作用，但不同藥物其臨床效果存在一定的差異，這可能與感染動(dòng)物的抵抗力、支原體的耐藥性及繼發(fā)感染等因素有一定的關(guān)系。支原體病的發(fā)生與環(huán)境、天氣、喂食、飲水、管理等因素有關(guān)，因此本病的防制不能完全依賴抗生素和疫苗，而應(yīng)采取綜合性防制措施，同時(shí)加強(qiáng)環(huán)境的消毒和改善飼養(yǎng)管理?xiàng)l件。近期有人評(píng)估了不同濃度的檸檬酸和次氯酸鈉對(duì)支原體的消毒效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)物質(zhì)存在條件下，0.5%檸檬酸和1%次氯酸鈉能使支原體的活力顯著降低，達(dá)到了預(yù)期的消毒效果，為長(zhǎng)頸鹿圈舍消毒提供了參考。在本案例中其他長(zhǎng)頸鹿也出現(xiàn)了征兆明顯的臨床癥狀，隨后采集其血液進(jìn)行支原體抗體檢測(cè)，檢測(cè)出支原體抗體，同時(shí)通過使用阿奇霉素類藥物進(jìn)行治療并清潔環(huán)境衛(wèi)生，效果明顯，這為長(zhǎng)頸鹿感染支原體的防制提供了參考。