血清SP、MT、HSP70水平與口腔扁平苔蘚病損程度及細(xì)胞免疫-炎癥反應(yīng)的關(guān)系*

汪 靜,王 婷,付芳岐△

寶雞市中心醫(yī)院:1.口腔科;2.檢驗(yàn)科,陜西寶雞 721000

口腔扁平苔蘚(OLP)屬于一類(lèi)慢性炎癥疾病,好發(fā)于中年女性人群[1]。OLP的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,有研究表明,T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能紊亂及炎癥反應(yīng)在OLP的發(fā)病過(guò)程中起重要作用[1-2]。有報(bào)道顯示,血清P物質(zhì)(SP)、褪黑素(MT)、熱休克蛋白70(HSP70)3種物質(zhì)均參與了多種炎癥性和免疫性疾病的進(jìn)程[3-4]。例如在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中血清HSP70水平較健康人群明顯升高,游離HSP70和抗HSP70抗體呈高表達(dá),說(shuō)明HSP70介導(dǎo)的免疫反應(yīng)參與了類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥因子激活過(guò)程[5]。致炎因子SP可刺激細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6的分泌,加重氣道炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致疾病進(jìn)展[6]。有學(xué)者切除小鼠松果體后發(fā)現(xiàn),小鼠胸腺體積和質(zhì)量均明顯減少,而切除松果體并注射MT的小鼠卻無(wú)明顯變化,證實(shí)MT參與了胸腺的分化、發(fā)育而影響免疫調(diào)節(jié)[7]。本研究通過(guò)檢測(cè)MT、SP及HSP70在OLP中的表達(dá)水平,探討3項(xiàng)指標(biāo)與OLP患者病損程度及細(xì)胞免疫-炎癥反應(yīng)的關(guān)系,旨在為OLP的診療和病情評(píng)估提供更多選擇,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年7月至2021年7月本院收治的45例OLP患者作為OLP組,45例健康體檢者作為對(duì)照組。OLP組男15例,女30例;平均年齡(46.15±5.08)歲。對(duì)照組男20例,女25例;平均年齡(46.08±4.89)歲。將45例OLP患者根據(jù)OLP臨床分型診斷標(biāo)準(zhǔn)分為糜爛型(糜爛組,n=22)、非糜爛型(非糜爛組,n=23)。糜爛組男8例,女14例;平均年齡(46.02±5.03)歲。非糜爛組男7例,女16例;平均年齡(46.28±5.14)歲。OLP組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)就診前未接受任何治療;(2)病變局限于口腔黏膜;(3)3周內(nèi)未接受抗菌藥物治療;(4)病歷資料完整;(5)經(jīng)組織病理學(xué)檢查診斷為OLP[8]。OLP組排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患有糖尿病、高血脂等疾病;(2)患有其他免疫系統(tǒng)疾病;(3)患有良、惡性腫瘤;(4)患有感染性疾病;(5)3個(gè)月內(nèi)接受過(guò)免疫抑制劑治療;(6)存在皮膚損害;(7)妊娠期婦女。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)就診前未服用任何藥物;(2)經(jīng)診斷未患OLP;(3)年齡和性別與OLP組相仿;(4)病歷資料完整;(5)進(jìn)行血生化檢測(cè)。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患有其他系統(tǒng)疾病;(2)有扁平苔蘚家族史;(3)妊娠期婦女;(4)口腔潰瘍、牙周炎患者。糜爛型診斷依據(jù):假膜覆蓋,邊緣不規(guī)則,可見(jiàn)充血糜爛[6];非糜爛型診斷依據(jù):病灶未見(jiàn)明顯充血糜爛[8]。所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2方法

1.2.1血清SP、MT、HSP70水平檢測(cè) OLP組于入院次日、對(duì)照組于體檢當(dāng)日采集空腹靜脈血6 mL。將OLP組采集的血液分為2份,一份以3 000 r/min離心10 min得到血清,放置于-20 ℃恒溫箱中保存待檢,所有血液標(biāo)本狀態(tài)均無(wú)黃疸、溶血。采用MT酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)、SP ELISA試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)、HSP70 ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)檢測(cè)MT、SP、HSP70水平。首先離心標(biāo)本懸浮液,確保血液標(biāo)本無(wú)其余雜質(zhì),而后制備洗滌液,用蒸餾水1∶20稀釋,再進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品配置,采用蒸餾水或去離子水將標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次稀釋為480、240、120、60、30、15 pmol/L 6種梯度,設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,每一標(biāo)準(zhǔn)品孔各放入稀釋倍數(shù)不等的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待檢樣品孔和空白孔,將波長(zhǎng)設(shè)置在固定450 nm測(cè)定吸光度值。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.2.2外周血淋巴細(xì)胞亞群水平檢測(cè) 于OLP組血液中吸取100 μL置于流式檢測(cè)管,再向其加入20 μL單克隆抗體,于恒溫箱內(nèi)37 ℃孵育15 min向其加入2 mL紅細(xì)胞裂解液,混勻后以3 000 r/min離心10 min得到血清放置于-20 ℃恒溫箱中保存待檢。除去上清液后洗滌,加入500 μL磷酸鹽緩沖液混勻,采用MACSQuant Analyzer 10流式分析儀(德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+56水平,計(jì)算CD4+/CD8+。

1.2.3炎癥因子指標(biāo)水平檢測(cè) 將OLP組另一份血液混勻后以3 000 r/min離心10 min得到血清,放置于-80 ℃冰箱中保存待檢。選取酶標(biāo)儀(BK-EL10C,濟(jì)南好來(lái)寶醫(yī)療器材有限公司)檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6及IL-8水平。

2 結(jié) 果

2.1OLP組和對(duì)照組血清SP、MT、HSP70水平比較 OLP組血清MT水平明顯低于對(duì)照組,SP和HSP70水平均明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 OLP組和對(duì)照組血清SP、MT、HSP70水平比較

2.2OLP組和對(duì)照組血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比較 OLP組血清TNF-α、IL-6、IL-8水平均明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 OLP組和對(duì)照組血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比較

2.3OLP組和對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群水平比較 OLP組CD3+、CD4+、CD8+水平均明顯低于對(duì)照組,CD19+、CD4+/CD8+均明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);OLP組和對(duì)照組CD16+56水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 OLP組和對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群水平比較

2.4糜爛組和非糜爛組血清SP、MT、HSP70水平比較 糜爛組血清MT水平明顯低于非糜爛組,SP和HSP70水平均明顯高于非糜爛組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 糜爛組和非糜爛組血清SP、MT、HSP70水平比較

2.5OLP組SP、MT、HSP70水平與外周血淋巴細(xì)胞亞群、血清炎癥因子水平的相關(guān)性 SP、HSP70水平與CD3+、CD4+、CD8+水平均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與CD4+/CD8+、TNF-α、IL-6、IL-8水平均呈正相關(guān)(P<0.05);MT水平與TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與CD3+、CD4+、CD8+水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 OLP組SP、MT、HSP70水平與外周血淋巴細(xì)胞亞群、血清炎性因子水平的相關(guān)性

3 討 論

OLP是一種常見(jiàn)的慢性口腔黏膜皮膚疾病,一般不具有傳染性[1]。OLP發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,有研究表明,T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫及炎癥反應(yīng)是OLP發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[2]?？谇唤琴|(zhì)形成細(xì)胞在形成初始狀態(tài)時(shí)被抗原攻擊,刺激CD4+等T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,繼而促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞凋亡及T淋巴細(xì)胞增殖,造成炎癥反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)展,導(dǎo)致OLP發(fā)生[9]。因此,尋找可對(duì)OLP病損程度進(jìn)行評(píng)估的血清學(xué)指標(biāo),對(duì)臨床診斷和尋找輔助治療方法至關(guān)重要。

本研究結(jié)果顯示,OLP組血清MT水平明顯低于對(duì)照組,SP和HSP70水平均明顯高于對(duì)照組,提示MT、SP和HSP70水平變化可能在病情發(fā)生和發(fā)展中起促進(jìn)作用。究其原因,MT具有抗炎作用,主要與預(yù)防硝基氧化應(yīng)激及減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)[10]。MT可減少炎癥細(xì)胞增殖引起組織損傷,在正常組織中水平較高,而在OLP中因細(xì)胞免疫功能紊亂,在過(guò)度炎癥反應(yīng)刺激下,MT水平逐漸下降,使黏膜組織修復(fù)細(xì)胞數(shù)量減少,導(dǎo)致病情進(jìn)一步加重,因此,OLP患者M(jìn)T水平低于對(duì)照組[11]。SP是神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的一種重要介質(zhì),調(diào)節(jié)人體炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。SP在健康人群中表達(dá)程度較低,炎癥反應(yīng)發(fā)生后SP合成和釋放增多,導(dǎo)致口腔角質(zhì)形成細(xì)胞大量凋亡,口腔黏膜屏障打破,促進(jìn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化,進(jìn)一步加重局部炎癥反應(yīng)和外周增敏[6]。HSP70是一類(lèi)非常保守的蛋白質(zhì)分子家族,在細(xì)胞保護(hù)、免疫應(yīng)答、信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)節(jié)凋亡等方面具有重要作用。健康成人血清HSP70水平較低,OLP患者機(jī)體因淋巴細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)產(chǎn)生了大量細(xì)胞因子,刺激HSP70表達(dá),從而導(dǎo)致其水平高于對(duì)照組[12]。本研究結(jié)果顯示,糜爛組血清MT水平明顯低于非糜爛組,SP和HSP70水平均明顯高于非糜爛組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步說(shuō)明SP、MT、HSP70與病損程度存在一定聯(lián)系,SP和HSP70水平越高,MT水平越低,其病損程度越重。究其原因,可能是SP、MT、HSP70等致炎因子導(dǎo)致上皮細(xì)胞抗原性質(zhì)發(fā)生改變,而巨噬細(xì)胞攝取此類(lèi)變性抗原傳遞至T淋巴細(xì)胞,促使T淋巴細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子,進(jìn)而加重細(xì)胞免疫-炎癥反應(yīng)。

OLP的發(fā)生和發(fā)展常伴隨炎癥反應(yīng),病情進(jìn)展至一定程度可導(dǎo)致糜爛[13]。炎癥反應(yīng)伴隨著多種促炎介質(zhì)的釋放,如TNF-α、IL-6和IL-8,引起OLP炎癥反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體損傷[14-15]。本研究結(jié)果顯示,OLP組血清TNF-α、IL-6及IL-8水平均明顯高于對(duì)照組,提示促炎介質(zhì)與OLP的發(fā)生存在一定聯(lián)系,是由于促炎因子的活躍,病變上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)目增多、遷移,進(jìn)而引起患者口腔組織糜爛和炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示,OLP組CD3+、CD4+、CD8+水平均明顯低于對(duì)照組,CD19+和CD4+/CD8+均明顯高于對(duì)照組,提示OLP組機(jī)體細(xì)胞免疫功能較對(duì)照組更加紊亂。考慮可能與炎癥細(xì)胞因子遷移至病損組織有關(guān),且能夠通過(guò)改變T淋巴細(xì)胞功能而引起OLP特異性免疫應(yīng)答。本研究還發(fā)現(xiàn),SP、HSP70水平與CD3+、CD4+、CD8+水平均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與CD4+/CD8+、TNF-α、IL-6、IL-8水平均呈正相關(guān)(P<0.05),MT水平與TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與CD3+、CD4+、CD8+水平均呈正相關(guān)(P<0.05),提示OLP患者處于免疫功能紊亂狀態(tài)。MT可能改善機(jī)體免疫狀態(tài),維持內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定,在正常機(jī)體內(nèi)抑制過(guò)度的先天性免疫反應(yīng),降低炎癥因子產(chǎn)生,同時(shí),促進(jìn)獲得性免疫反應(yīng),加快特異性抗體產(chǎn)生[16]。SP、HSP70通過(guò)促進(jìn)B淋巴細(xì)胞和免疫球蛋白增殖,使體液免疫亢進(jìn),導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量抗體[17-18]。相關(guān)研究證實(shí),MT可抑制TNF-α水平從而減輕炎癥反應(yīng),同時(shí),MT還可降低IL-1β水平從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[19]。此外,SP、HSP70可通過(guò)影響細(xì)胞免疫功能,提高外周炎癥因子水平,進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)狀態(tài)[20]。

綜上所述,OLP患者隨著病損程度加重,SP和HSP70水平升高,MT水平降低。血清SP、HSP70與MT水平異常變化可能與細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)。