通用多重不對(duì)稱PCR聯(lián)合基因芯片實(shí)現(xiàn)下呼吸道病原菌及耐藥基因快速檢測(cè)*

劉俊杰,謝海宇,張艷妮,陳桂柳,何小維,王 羽

1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510641;2.廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司,廣東廣州 510670;3.生物島實(shí)驗(yàn)室/廣州再生醫(yī)學(xué)與健康廣東省實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510005

下呼吸道感染(LRTI)已經(jīng)成為全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題。2016年全球約有3.36億例LRTI患者,導(dǎo)致約238萬人死亡,是全球第六大致死原因[1]。由不同病原菌引起的LRTI臨床表現(xiàn)非常相似,單憑臨床癥狀和病理特征難以鑒別,在病原菌沒有得到正確識(shí)別的情況下,可能會(huì)導(dǎo)致抗菌藥物濫用[2]。同時(shí),耐碳青霉烯酶的革蘭陰性桿菌在全球范圍內(nèi)廣泛傳播,碳青霉烯類抗菌藥物的不合理使用是導(dǎo)致革蘭陰性桿菌耐藥率上升的重要原因[3]。因此,快速鑒定識(shí)別呼吸道感染病原菌及其攜帶的耐藥基因?qū)εR床準(zhǔn)確診斷和合理用藥具有重要意義。用于識(shí)別呼吸道病原菌的傳統(tǒng)方法包括病原菌分離培養(yǎng)法、涂片鏡檢法、ELISA和免疫熒光法等[4],這些傳統(tǒng)方法均存在檢測(cè)周期長、操作復(fù)雜、靈敏度低等不容忽視的問題。近年來,分子檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展在很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)和免疫分析方法用于呼吸道病原菌檢測(cè)的不足,大大提高了呼吸道病原菌檢測(cè)的速度、靈敏度和特異度[5]。然而,受熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)通道的限制,一次檢測(cè)不超過5種靶標(biāo)[6-7],基因芯片結(jié)合通用多重不對(duì)稱PCR能夠有效解決這一問題?；蛐酒夹g(shù)是依據(jù)核酸序列堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則,將被標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與固定在芯片表面的探針進(jìn)行分子雜交,然后通過采集雜交信號(hào)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分析,是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的基因分析方法。通用多重不對(duì)稱PCR是在特異性引物的5′端連接一段異源通用序列,通過特異性引物介導(dǎo)的第1階段擴(kuò)增和通用引物介導(dǎo)的第2階段擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)對(duì)多種靶序列的同步、高靈敏、高特異性擴(kuò)增,從而較好地解決多重PCR中引物相互干擾、擴(kuò)增效率差等缺點(diǎn),提高PCR的反應(yīng)重?cái)?shù)。因此,基因芯片檢測(cè)技術(shù)與通用多重不對(duì)稱PCR技術(shù)聯(lián)合使用可實(shí)現(xiàn)二者優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),通用多重不對(duì)稱PCR的擴(kuò)增作用和基因芯片的多位點(diǎn)雜交技術(shù)可以很好地提高檢測(cè)通量[8]。本研究建立的基于通用多重不對(duì)稱PCR聯(lián)合基因芯片技術(shù)的LRTI病原菌及耐藥基因檢測(cè)方法(下稱本方法)可同步檢測(cè)大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌6種常見的下呼吸道病原菌和兩種碳青霉烯酶基因(blaKPC和blaVIM),可在4 h內(nèi)完成檢測(cè)并輸出結(jié)果,可有效助力臨床LRTI的快速診斷及干預(yù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株 選取目標(biāo)菌株和非目標(biāo)菌株的標(biāo)準(zhǔn)菌株共14株,用于方法的建立及特異度和靈敏度的評(píng)估。肺炎克雷伯菌(ATCC BAA-1902)、大腸埃希菌(ATCC BAA-2452)、金黃色葡萄球菌(ATCC 43300)、肺炎鏈球菌(ATCC 49619)、鮑曼不動(dòng)桿菌(GDMCC 1.1336)、卡他莫拉菌(ATCC 25238)、弗氏檸檬酸桿菌(GDMCC 1.1337)、陰溝腸桿菌(GDMCC 1.1338)、產(chǎn)酸克雷伯菌(GDMCC 1.1340)、黏質(zhì)沙雷菌(ATCC 8100)、奇異變形桿菌(ATCC 35659)、表皮葡萄球菌(ATCC 700566)、唾液鏈球菌(ATCC 13419)、流感嗜血桿菌(ATCC 49766)均購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2儀器與試劑 賽默飛ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)、晶芯LuxScanTM10K微陣列芯片掃描儀(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司)、晶芯BioMixerTMⅡ芯片雜交儀(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司)、sciFLEXARRAYER S12非接觸式超微量噴點(diǎn)系統(tǒng)(德國Scienion公司)、2×Lyo-Ready qPCR Mix(美國Meridian公司)、核酸提取及純化試劑(廣州達(dá)安基因股份有限公司)、環(huán)氧硅烷修飾芯片片基(德國Schott公司)、洗液1[1×檸檬酸鈉鹽緩沖液(SSC)+0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)]、洗液2(0.1×SSC+0.1%SDS)、雜交緩沖液(美國Boston BioProducts公司)。

1.3方法

1.3.1DNA提取 標(biāo)準(zhǔn)菌株、肺泡灌洗液和痰液均按照達(dá)安基因核酸提取及純化試劑說明書進(jìn)行標(biāo)本核酸提取。

1.3.2引物探針設(shè)計(jì)與合成 參考文獻(xiàn)[9-14]設(shè)計(jì)與合成檢測(cè)肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、卡他莫拉菌的特異性引物。根據(jù)GenBank中已公布的mt-DNA、blaKPC、blaVIM基因序列,使用Primer premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)特異性引物,用于第1步PCR擴(kuò)增。在每對(duì)特異性引物的5′端設(shè)計(jì)一段非同源通用片段。使用Primer premier 5.0軟件根據(jù)不對(duì)稱PCR產(chǎn)物分別設(shè)計(jì)捕獲探針和熒光探針,熒光探針5′端使用HEX標(biāo)記,捕獲探針5′端氨基化修飾并加poly(T4)。引物探針序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。設(shè)計(jì)的引物目標(biāo)片段的序列長度為100～300 bp,針對(duì)各靶基因設(shè)計(jì)的探針長度為23 bp左右。

1.3.3芯片制備 使用點(diǎn)樣緩沖液稀釋探針至40 μmol/L的終濃度,混勻加入384孔板中。在室溫和50%相對(duì)濕度的條件下利用芯片點(diǎn)樣儀將探針按預(yù)設(shè)程序在環(huán)氧基玻片上進(jìn)行噴點(diǎn)式點(diǎn)樣,點(diǎn)陣排列見圖1。每個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)樣量為670 pL,點(diǎn)樣直徑為100 μm,點(diǎn)樣間距為300 μm。將點(diǎn)樣完畢的芯片置于敞口盒中,在22 ℃、70%相對(duì)濕度水化過夜。在封閉液中浸泡5 min,超純水清洗;使用0.1%的SDS溶液以50 r/min搖床清洗5 min,再次用超純水清洗后以1 000 r/min離心干燥,置于室溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

注:①為質(zhì)控DNA;②為碳青霉烯酶基因blaKPC;③為碳青霉烯酶基因blaVIM;④為鮑曼不動(dòng)桿菌;⑤為金黃色葡萄球菌;⑥為肺炎鏈球菌;⑦為大腸埃希菌;⑧為卡他莫拉菌;⑨為肺炎克雷伯菌;為定位探針;為陰性對(duì)照。

1.3.4PCR擴(kuò)增 以DNA為模板,使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第1步PCR體系:2×Lyo-Ready qPCR Mix 25 μL,10 μmol/L的上、下游特異性引物各0.5 μL,模板5 μL,補(bǔ)充ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序:94 ℃ 120 s;94 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,10個(gè)循環(huán);94 ℃ 5 s,65 ℃ 30 s,12個(gè)循環(huán),產(chǎn)物4 ℃保存。第2步PCR體系:2×Lyo-Ready qPCR Mix 25 μL,10 μmol/L的上游通用引物5 μL,10 μmol/L的下游通用引物0.25 μL,模板5 μL(第1步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物),補(bǔ)充ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序:94 ℃ 120 s;94 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,30個(gè)循環(huán),產(chǎn)物4 ℃保存。

1.3.5通用不對(duì)稱引物濃度比的優(yōu)化 通用引物的上、下游引物濃度比是影響通用不對(duì)稱PCR產(chǎn)物雜交效率的關(guān)鍵因素。選擇8種靶標(biāo)的混合菌液作為標(biāo)本進(jìn)行優(yōu)化,首先固定下游通用引物濃度為50 nmol/L,然后設(shè)置不同濃度比(1∶1、5∶1、10∶1、20∶1和50∶1)的上、下游引物進(jìn)行多重不對(duì)稱PCR和芯片雜交分析。

1.3.6芯片雜交與信號(hào)分析 取30 μL擴(kuò)增產(chǎn)物、80 μL雜交緩沖液、10 μmol/L的熒光探針各1.6 μL,補(bǔ)充ddH2O至160 μL混合均勻轉(zhuǎn)移至芯片雜交儀中以55 ℃、10 r/min連續(xù)避光雜交70 min。雜交完成后取出芯片,將雜交反應(yīng)完畢的基因芯片置于玻片架上,分別在洗液1、2中清洗2次,每次1 min,離心甩干。使用晶芯LuxScanTM10K微陣列芯片掃描儀采集熒光信號(hào),設(shè)定條件:Cy3綠色熒光通道,Power:50%,PMT:600,分辨率:5 μm。分析每個(gè)樣點(diǎn)熒光信號(hào)的中值,當(dāng)某一位點(diǎn)的信號(hào)值大于陰性質(zhì)控探針信號(hào)值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差即判定該位點(diǎn)為陽性,每個(gè)靶基因設(shè)置的4個(gè)重復(fù)位點(diǎn)出現(xiàn)≥3個(gè)位點(diǎn)為陽性,即可判定該靶標(biāo)為陽性。按照上述操作,將8種靶標(biāo)的標(biāo)本核酸等量混勻作為PCR模板,進(jìn)行雜交溫度(45、50、55、60 ℃)和雜交時(shí)間(30、50、70、90 min)的優(yōu)化,選擇最佳雜交溫度和雜交時(shí)間。

1.3.7靈敏度試驗(yàn) 將各目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)模板調(diào)整至104copy/mL進(jìn)行10倍梯度稀釋作為模板,按照最優(yōu)的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增和雜交,以驗(yàn)證本方法的靈敏度。

1.3.8標(biāo)本檢測(cè) 選取實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)無致病菌污染的肺泡灌洗液為基質(zhì),分別與不同目標(biāo)菌液混合,制備人工模擬標(biāo)本,利用本方法進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證本方法對(duì)多重感染檢測(cè)的準(zhǔn)確性。同時(shí),收集24份臨床痰液標(biāo)本使用本方法及分離培養(yǎng)后的VITEK 2 生化鑒定法、單重qPCR進(jìn)行檢測(cè)并鑒定,通過比較3種方法的最終檢測(cè)結(jié)果,評(píng)估臨床應(yīng)用效果。

2 結(jié) 果

2.1不同通用引物濃度比對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)值 通用引物的濃度比是影響通用不對(duì)稱PCR效率的關(guān)鍵因素。利用通用引物不同濃度比的上、下游引物分別進(jìn)行多重不對(duì)稱PCR和芯片雜交分析見表1。當(dāng)上、下游引物濃度比為20∶1時(shí),雜交信號(hào)最強(qiáng)。因此,確定通用多重不對(duì)稱PCR上游通用引物的最佳濃度為1 000 nmol/L,下游通用引物的最佳濃度為50 nmol/L。

表1 不同通用引物濃度比對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)值(A.U.)

2.2不同芯片雜交溫度對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)值 為選擇最佳的標(biāo)本雜交溫度,將芯片置于45、50、55、60 ℃條件下雜交30 min后進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)見表2。在相同時(shí)間內(nèi),55 ℃時(shí)雜交信號(hào)最強(qiáng)。

表2 不同芯片雜交溫度對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)值(A.U.)

2.3不同芯片雜交時(shí)間對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)值 為選擇最佳的標(biāo)本雜交時(shí)間,將雜交溫度設(shè)置為55 ℃,分析雜交30、50、70、90 min的芯片熒光信號(hào)強(qiáng)度見表3。熒光信號(hào)的整體強(qiáng)度隨雜交時(shí)間的延長而增強(qiáng)。在相同溫度下,雜交反應(yīng)時(shí)間為70 min時(shí)熒光信號(hào)最強(qiáng)。

表3 不同芯片雜交時(shí)間對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)值(A.U.)

2.4靈敏度 將各目標(biāo)菌株的標(biāo)準(zhǔn)菌液進(jìn)行梯度稀釋,按照最優(yōu)的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增和雜交見圖2。高濃度菌液的芯片掃描圖均有清晰可見的熒光位點(diǎn),隨著菌液濃度降低,熒光強(qiáng)度也明顯減弱。最終,本方法檢測(cè)大腸埃希菌的靈敏度為104copy/mL,碳青霉烯酶基因blaKPC、碳青霉烯酶基因blaVIM、鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌的靈敏度均為103copy/mL,金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和卡他莫拉菌的靈敏度均為102copy/mL。

注:A為碳青霉烯酶基因blaKPC;B為碳青霉烯酶基因blaVIM;C為鮑曼不動(dòng)桿菌;D為金黃色葡萄球菌;E為肺炎鏈球菌;F為大腸埃希菌;G為卡他莫拉菌;H為碳青霉烯酶基因blaKPC+肺炎克雷伯菌;數(shù)字1、2、3分別表示濃度為104、103、102 copy/mL。

2.5特異度 標(biāo)準(zhǔn)菌株加入臨床檢測(cè)無菌的肺泡灌洗液作為模擬標(biāo)本,無菌肺泡灌洗液作為陰性標(biāo)本,在最佳反應(yīng)條件下分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),評(píng)價(jià)本方法的特異度。圖3A～3H目標(biāo)菌株各靶基因?qū)?yīng)的探針位點(diǎn)出現(xiàn)的雜交信號(hào)清晰可見,均符合陽性的預(yù)期結(jié)果。而其他位點(diǎn)均未出現(xiàn)熒光信號(hào),并且以產(chǎn)酸克雷伯菌、黏質(zhì)沙雷菌、奇異變形桿菌、表皮葡萄球菌、唾液鏈球菌、流感嗜血桿菌為干擾菌的模擬標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與陰性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果一致,靶標(biāo)位置均無熒光信號(hào)檢出,見圖3I。

注:A為碳青霉烯酶基因blaKPC;B為碳青霉烯酶基因blaVIM;C為鮑曼不動(dòng)桿菌;D為金黃色葡萄球菌;E為肺炎鏈球菌;F為大腸埃希菌;G為卡他莫拉菌;H為碳青霉烯酶基因blaKPC+肺炎克雷伯菌;I為陰性標(biāo)本及干擾菌。

2.6模擬標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 將不同菌株組合混勻,模擬多重細(xì)菌感染,對(duì)模擬標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)見圖4。模擬標(biāo)本檢測(cè)符合率均可達(dá)100%,能特異性檢出對(duì)應(yīng)的靶標(biāo),說明本方法具有較好的檢測(cè)分辨力。

注:A為碳青霉烯酶基因blaVIM+肺炎鏈球菌+卡他莫拉菌;B為鮑曼不動(dòng)桿菌+金黃色葡萄球菌+卡他莫拉菌;C為碳青霉烯酶基因blaKPC+鮑曼不動(dòng)桿菌+金黃色葡萄球菌+卡他莫拉菌+肺炎克雷伯菌;D為鮑曼不動(dòng)桿菌+肺炎鏈球菌。

2.7臨床痰液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 利用本方法對(duì)24份臨床痰液標(biāo)本進(jìn)行核酸提取、擴(kuò)增及芯片雜交,分析雜交信號(hào)見表4。本方法檢出單一病原菌感染17份,多病原菌感染7份,攜帶耐藥基因5份,該檢測(cè)結(jié)果與單重qPCR鑒定結(jié)果一致。由于VITEK 2生化鑒定法不能進(jìn)行碳青霉烯類耐藥基因鑒定,且VITEK 2生化鑒定法需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng),對(duì)于混合感染標(biāo)本的檢測(cè)易受優(yōu)勢(shì)菌株干擾而導(dǎo)致漏檢,故VITEK 2生化鑒定法鑒定出單一病原菌感染22份,多病原菌感染2份,與真實(shí)結(jié)果存在一定誤差。

表4 臨床痰液標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果(n)

3 討 論

多重PCR可以快速、靈敏地同步擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)片段,已被越來越多地用于病原菌檢測(cè)技術(shù)研究領(lǐng)域。基因芯片也是一種高通量、快速、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。本方法可以在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)6種下呼吸道常見病原菌和兩種碳青霉烯酶基因。

在致病菌檢測(cè)領(lǐng)域,多重PCR和基因芯片的聯(lián)合應(yīng)用已有相關(guān)報(bào)道,有研究建立了一種基于將多重連接酶檢測(cè)反應(yīng)及通用不對(duì)稱PCR與通用基因芯片方法聯(lián)合的檢測(cè)方法,純培養(yǎng)物的檢測(cè)靈敏度為102～103copy/mL[15],與本方法的靈敏度相當(dāng)。SONG等[16]針對(duì)8種碳青霉烯酶基因建立了基于多重PCR和基因芯片的檢測(cè)方法,其檢測(cè)靈敏度最低為30 copy/μL。基于多重PCR的基因芯片技術(shù)使在一個(gè)試管中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的基因成為可能,但通過電泳法根據(jù)產(chǎn)物序列大小分離并不能有效鑒定各種片段[17]。相比之下,本方法耗時(shí)更短,并且可以在單次反應(yīng)中設(shè)計(jì)更多的待檢靶標(biāo)。

本研究通過多重PCR擴(kuò)增富集目的基因,并利用通用不對(duì)稱PCR擴(kuò)增大量單鏈目標(biāo)片段用于DNA雜交,二者結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)多重PCR和基因芯片的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),達(dá)到較高的靈敏度和特異度。此外,針對(duì)每個(gè)靶基因設(shè)計(jì)了特異的熒光探針,在雜交反應(yīng)中特異性結(jié)合在目標(biāo)片段的5′端。只有當(dāng)標(biāo)本中靶基因經(jīng)兩輪PCR后的擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在芯片表面的捕獲探針和雜交液中的熒光探針同時(shí)發(fā)生雜交反應(yīng)時(shí),才能在芯片表面的預(yù)設(shè)位點(diǎn)檢測(cè)到熒光信號(hào),這一雙重特異性設(shè)計(jì)保證了本方法的準(zhǔn)確性。

此外,目標(biāo)片段的長度是影響雜交效率的重要因素。有研究表明,短片段較長片段目標(biāo)序列能產(chǎn)生更高的雜交信號(hào)[18]。因此,本研究設(shè)計(jì)的引物目標(biāo)片段的序列長度為100～300 bp。探針的設(shè)計(jì)是建立基因芯片檢測(cè)方法的關(guān)鍵,本研究針對(duì)各靶基因設(shè)計(jì)的探針長度為23 bp左右,且具有相近的DNA熔解溫度,使各靶基因的雜交反應(yīng)接近最佳反應(yīng)條件,經(jīng)過NCBI BLAST驗(yàn)證,均具有較強(qiáng)的特異性。此外,有研究表明,DNA雜交效率與目標(biāo)序列上捕獲探針的位置具有關(guān)聯(lián),具體表現(xiàn)為目標(biāo)序列的5′伸出端的長度與雜交信號(hào)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)[19]。因此,本研究設(shè)計(jì)的捕獲探針與目標(biāo)序列的結(jié)合區(qū)域均靠近5′端,以提高信號(hào)強(qiáng)度。

考慮到下呼吸道病原菌種類繁多且細(xì)菌耐藥方式并不局限于產(chǎn)碳青霉烯酶,本研究建立的DNA微陣列不能涵蓋所有的病原菌基因。因此,一些致病菌和耐藥基因不在芯片的檢測(cè)范圍內(nèi)。在后期研究中,可以根據(jù)臨床需求靈活改變或增加反應(yīng)體系中的引物和探針序列,將本方法用于其他靶標(biāo)的檢測(cè)。

使用本方法對(duì)下呼吸道病原菌進(jìn)行檢測(cè),在預(yù)先制備好基因芯片的情況下,經(jīng)過核酸提取、PCR擴(kuò)增、基因芯片分子雜交、芯片掃描等步驟,總檢測(cè)時(shí)間約為4 h,且具有高靈敏度、高特異度、高準(zhǔn)確度的特點(diǎn),相對(duì)于傳統(tǒng)的病原菌檢測(cè)方法更高效、準(zhǔn)確。本方法也可搭載于廣州萬孚BoxArray全自動(dòng)多重核酸檢測(cè)分析系統(tǒng)上,將核酸提取、擴(kuò)增、雜交和檢測(cè)的所有過程集成于卡盒內(nèi)部,實(shí)現(xiàn)標(biāo)本進(jìn)結(jié)果出的全自動(dòng)檢測(cè)過程,為臨床診斷提供快速指導(dǎo),避免藥物濫用[20]。