基于不同培養(yǎng)需求的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容設(shè)計(jì)與實(shí)踐
——以“茶葉中咖啡因提取”為例*

謝俊杰，張 舜，張胥雪，陳燕勤

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

茶葉中含有多種生物堿，其中以咖啡因(又稱咖啡堿)為主，其含量占茶葉干物質(zhì)總質(zhì)量的2.0%～5.0%之間[1]。而咖啡因作為一種重要的醫(yī)藥工業(yè)原料，它具有刺激心臟、興奮大腦神經(jīng)、利尿和消除疲勞等作用[2]。從茶葉中提取咖啡因是本科有機(jī)化學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的一個(gè)重要有機(jī)化合物制備實(shí)驗(yàn)[3-4]，在農(nóng)業(yè)院校或農(nóng)科專業(yè)更是必須開(kāi)設(shè)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。與此同時(shí)，隨著中學(xué)化學(xué)教學(xué)改革，“從茶葉中提取咖啡因”實(shí)驗(yàn)在很多高中已作為供學(xué)生選修的探究(綜合設(shè)計(jì))性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目[5-8]。甚至該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容還出現(xiàn)在了2019年全國(guó)高考理綜試卷中。

茶葉中咖啡因提取實(shí)驗(yàn)中的提取步驟主要用到共沉淀法、直接升華法、索氏提取法和樹(shù)脂層析法等[9-11]。由于受學(xué)時(shí)限制，多數(shù)都會(huì)選擇直接升華法，但因升華溫度控制困難，產(chǎn)率低，初學(xué)者的實(shí)驗(yàn)效果經(jīng)常差強(qiáng)人意。為了提升實(shí)驗(yàn)效果，培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)綜合能力，高校教師們從提取方法[12]、儀器設(shè)備[13]、檢測(cè)方法[14]等方面不斷的嘗試改進(jìn)和探索。為使“茶葉中咖啡因提取”實(shí)驗(yàn)更貼合“新工科、新農(nóng)科”對(duì)學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰碗p創(chuàng)能力培養(yǎng)的要求，依托新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)，在反復(fù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行重新梳理，以天然產(chǎn)物科學(xué)研究方法和步驟將實(shí)驗(yàn)進(jìn)行模塊化劃分。提出以水為提取劑采用超聲提取法，既可縮短提取時(shí)間還能使提取溶劑對(duì)環(huán)境的危害降到最低；分離純化時(shí)為了提高提取率將超聲提取后的茶葉參加與濃縮提取液合并進(jìn)行2～3遍的升華操作；針對(duì)檢測(cè)、鑒定環(huán)節(jié)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)限制提出將檢測(cè)分為定性檢測(cè)、結(jié)構(gòu)鑒定及分析和定量測(cè)試三個(gè)模塊，實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)根據(jù)實(shí)際可選擇完成一個(gè)模塊、多個(gè)模塊或?qū)⒉煌K中的內(nèi)容遴選組合。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要試劑、材料和儀器

茶葉(散裝綠茶)，烏魯木齊北園春市場(chǎng)；碳酸鈉(AR)、氧化鈣(AR)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

ME204E電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9055A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；UV-2600紫外分光光度計(jì)，日本Shimadzu；LC-16高效液相色譜儀，日本Shimadzu；SGW X-4顯微熔點(diǎn)儀，上海申光儀器儀表有限公司；PICOSPIN 80核磁共振波譜儀，美國(guó)Thermo；IRPrestige-21傅里葉變換紅外光譜儀，日本Shimadzu。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 咖啡因提取、純化

稱取5 g茶葉和1 g碳酸鈉放入研缽中，加入10 mL蒸餾水研磨成糊狀后，用藥匙舀入250 mL燒杯中，用10 mL蒸餾水洗滌研缽，將洗滌后的液體全部?jī)A倒于燒杯中，再加入30 mL蒸餾水。將燒杯放入超聲波清洗器，設(shè)置功率120 W，溫度80 ℃，時(shí)間10 min。超聲結(jié)束后，將燒杯自超聲波清洗器中取出，減壓過(guò)濾燒杯中混合物，得抽濾液和固體殘?jiān)?。將固體殘?jiān)B同濾紙?jiān)?5 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干；抽濾液轉(zhuǎn)移至250 mL燒杯，在電熱板上蒸發(fā)濃縮至少量液體，再將燒杯中少量液體轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，加入研細(xì)的氧化鈣和茶葉粉末，攪拌成漿狀后成粉末狀，焙炒片刻，除去水分。冷卻后，在蒸發(fā)皿上蓋一張刺有許多小孔且孔刺向上的濾紙，再在濾紙上罩一個(gè)大小合適的玻璃漏斗，漏斗頸部塞一小團(tuán)疏松的棉花。用電熱板緩慢加熱蒸發(fā)皿，升華溫度控制在200 ℃左右，待蒸發(fā)皿內(nèi)無(wú)蒸汽升起時(shí)，停止加熱，在濾紙上可見(jiàn)白色針狀晶體，即為咖啡因產(chǎn)品。

1.2.2 咖啡因定性檢測(cè)

(1)顏色反應(yīng)

取極微量的咖啡因與濃鹽酸數(shù)滴混勻，再加入氯酸鉀結(jié)晶少許，蒸發(fā)至干，殘?jiān)霭闭魵饬⒓闯霈F(xiàn)紫色為正反應(yīng)。另外取咖啡因的飽和水溶液，加碘試劑，不發(fā)生沉淀，但再加稀鹽酸3滴，即產(chǎn)生紅棕色沉淀，此沉淀能在稍過(guò)量的氫氧化鈉溶液中溶解。

(2)熔點(diǎn)測(cè)定

使用顯微熔點(diǎn)儀進(jìn)行咖啡因熔點(diǎn)測(cè)定。在干凈且干燥的載玻片上放微量提取咖啡因晶體并蓋一片載玻片，放在加熱臺(tái)上。調(diào)節(jié)反光鏡、物鏡和目鏡，使顯微鏡焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)樣品，開(kāi)啟加熱器，先快速后慢速加熱，溫度快升至熔點(diǎn)時(shí)，控制溫度上升的速度為每分鐘1～2 ℃，當(dāng)樣品結(jié)晶棱角開(kāi)始變圓時(shí)，表示熔化已經(jīng)開(kāi)始，記錄儀器顯示溫度，結(jié)晶形狀完全消失表示熔化已完成，再次記錄儀器顯示溫度。測(cè)定結(jié)束停止加熱，稍冷，用鑷子拿走載玻片，將鋁板蓋在加熱臺(tái)上，溫度降至室溫后收存儀器。實(shí)驗(yàn)測(cè)得咖啡因產(chǎn)品的熔點(diǎn)在136.1～136.8 ℃，與理論值137 ℃基本一致[15]。

1.2.3 咖啡結(jié)構(gòu)鑒定及分析

(1)傅里葉紅外光譜分析

使用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行咖啡因產(chǎn)品官能團(tuán)分析。稱取一定質(zhì)量的咖啡因產(chǎn)品制備溴化鉀樣品壓片，同時(shí)制備溴化鉀空白樣片。以壓制好的空白樣片采集參比背景光譜，背景譜圖采集完畢后，將待測(cè)樣品片放入光譜儀內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。設(shè)置光譜分辨率4 cm-1，掃描范圍4000～400 cm-1，掃描次數(shù)40次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，茶葉中咖啡因的主要特征吸收峰為：3121 cm-1(=CH伸縮振動(dòng)峰)，2943 cm-1(-CH3伸縮振動(dòng)峰)，1701，1650 cm-1(-C=O伸縮振動(dòng)峰)，1540 cm-1(C=N伸縮振動(dòng)峰)，1483 cm-1(C=C伸縮振動(dòng)峰)，與文獻(xiàn)值吻合[12，15]。

(2)核磁共振光譜分析

使用核磁共振光譜儀進(jìn)行咖啡因結(jié)構(gòu)分析。先用蒸餾水做核磁共振H譜圖，獲得穩(wěn)定的峰之后，再測(cè)定事先配置好的咖啡因氘代二甲基砜(DMSO)溶液的核磁共振H譜圖。1H NMR解析結(jié)果為，δ：2.52(DMSO)，3.33(H2O)，8.00(1H，s，C8-H)，3.85(3H，s，N7-CH3)，3.41(3H，s，N3-CH3)，3.26(3H，s，N1-CH3)，四種H原子分別在咪唑環(huán)8位C原子和芳環(huán)的1，3，7位的甲基上，且其峰面積之比為1∶3∶3∶3，與咖啡因分子結(jié)構(gòu)中氫質(zhì)子數(shù)和類型一致[16]。

1.2.4 咖啡因含量測(cè)定(分光光度法)

(1)咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取咖啡因?qū)φ掌?.00 mg，置于50 mL燒杯中用少量蒸餾水溶解，并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，用少量蒸餾水潤(rùn)洗燒杯3次，潤(rùn)洗液也全部轉(zhuǎn)移至容量瓶中，再用蒸餾水定容至刻度，搖勻，得到濃度為50 μg·mL-1的咖啡因?qū)φ掌啡芤?，備用?/p>

(2)測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

將紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的掃描波長(zhǎng)設(shè)定為200～400 nm，以蒸餾水樣品進(jìn)行基線掃描，待基線平穩(wěn)后，分別取供試樣品和對(duì)照品溶液在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上在200～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，測(cè)定樣品和對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)測(cè)得，咖啡因的最大吸收波長(zhǎng)為273 nm。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確移取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL至5個(gè)25 mL容量瓶中，分別用蒸餾水定容至刻度，得到濃度依次為4.0、8.0、12.0、16.0和20.0 μg·mL-1的咖啡因溶液。測(cè)定以上溶液在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制咖啡因濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實(shí)驗(yàn)咖啡因濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.0609C-0.0015，線性范圍為：4～20 μg·mL-1。

(4)茶葉中咖啡因含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取咖啡因粗產(chǎn)品2 mg(準(zhǔn)確至0.0001 g)至50 mL燒杯，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，燒杯用蒸餾水潤(rùn)洗2～3次，潤(rùn)洗溶液全部轉(zhuǎn)入容量瓶，再用蒸餾水定容至刻度，得樣品溶液。在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定樣品溶液在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度，將吸光度數(shù)值代入咖啡因濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得樣品溶液中咖啡因濃度。按式(2)計(jì)算茶葉中咖啡因含量。本實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)試結(jié)果顯示，茶葉中咖啡因含量為2.74%。

式中：C0為粗咖啡因樣品溶液濃度，μg/mL；m2為稱取咖啡因粗產(chǎn)品質(zhì)量，本試驗(yàn)中為2 mg。

2 教學(xué)實(shí)施方案

對(duì)大學(xué)經(jīng)典有機(jī)化學(xué)“茶葉中咖啡因提取”實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行綜合改革，提取選用超聲法，不僅可使提取時(shí)間由1～2 h縮短至10～30 min，實(shí)驗(yàn)也更綠色、安全；提取劑選用蒸餾水，提取液經(jīng)初步加熱濃縮后直接進(jìn)行升華，不使用醋酸鉛和三氯甲烷(沸點(diǎn)61.2 ℃)進(jìn)行提取液的處理，不會(huì)產(chǎn)生環(huán)境污染問(wèn)題和在焙炒過(guò)程中因溶劑揮發(fā)對(duì)操作人員身體健康帶來(lái)危害[17]。在提取、純化的基礎(chǔ)上，通過(guò)熔點(diǎn)、紅外、核磁共振對(duì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，利用簡(jiǎn)單易掌握的分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定，涵蓋了有機(jī)化合物合成研究的全過(guò)程，既能滿足學(xué)生對(duì)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作技能的掌握，還能滿足對(duì)學(xué)生研究性思維的培養(yǎng)，提升學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Α?/p>

為滿足不同專業(yè)的培養(yǎng)需求，對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行相對(duì)獨(dú)立的模塊化設(shè)計(jì)，各專業(yè)可根據(jù)人才培養(yǎng)需求對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行拆分實(shí)施。新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)施時(shí)，在農(nóng)科類各專業(yè)等非化學(xué)學(xué)生中開(kāi)設(shè)時(shí)，學(xué)生選擇2～3種茶葉完成咖啡因的提取和升華操作，對(duì)獲得的產(chǎn)品進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定和紅外表征，實(shí)驗(yàn)在2個(gè)學(xué)時(shí)內(nèi)完成；在應(yīng)用化學(xué)專業(yè)學(xué)生中開(kāi)設(shè)時(shí)，實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)為3～4學(xué)時(shí)，學(xué)生在獲取產(chǎn)品和進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，還需利用分光光度法進(jìn)行茶葉中咖啡因含量的測(cè)定；在“卓越”班、“圖志”班和“拔尖創(chuàng)新”班等開(kāi)設(shè)本實(shí)驗(yàn)時(shí)可再加上核磁共振表征等，有條件的還可以探索高效液相色譜法測(cè)定含量和質(zhì)譜測(cè)定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)可在4～6學(xué)時(shí)內(nèi)完成，可以有效滿足學(xué)生科研訓(xùn)練的系統(tǒng)性。此外，若作為高中階段培養(yǎng)學(xué)生實(shí)驗(yàn)基本素養(yǎng)以及對(duì)科學(xué)研究的認(rèn)識(shí)，可只進(jìn)行提取和升華模塊操作，讓學(xué)生切實(shí)感受理論到實(shí)踐的轉(zhuǎn)化。

3 結(jié) 語(yǔ)

作為大學(xué)有機(jī)化學(xué)教學(xué)中天然產(chǎn)物提取的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)之一，對(duì)于學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能提升、雙創(chuàng)意識(shí)培養(yǎng)、嚴(yán)謹(jǐn)科研態(tài)度養(yǎng)成和實(shí)驗(yàn)安全、環(huán)境安全理念的建立等都十分重要。改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)，不僅能讓學(xué)生在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)得到相應(yīng)訓(xùn)練，而且能讓學(xué)生在課堂上的獲得感提升，也更能激發(fā)學(xué)生創(chuàng)新意識(shí)，提高其綜合實(shí)踐能力。