梁王茶醇提物及其不同極性部位中總黃酮含量測定及抗菌抗氧化活性研究*

劉穎琳，李自鴻，孫 敬，王順康，戴 鑫，段寶忠，周 萍

(1 云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)，云南 大理 671000；2 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000；3 大理州煙草公司，云南 大理 671000)

梁王茶為五加科(Araliaceae)梁王茶(NothopanaxMiq.)屬植物掌葉梁王茶的莖皮或葉；分布于貴州、云南、四川等地；全株無毒，可入藥，有清熱消炎、生津止瀉、鎮(zhèn)痛的作用，主治喉炎[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)梁王茶含有三萜皂苷、黃酮苷、多糖和精油等成分[4-7]，梁王茶及其多糖具有較好的抗氧化能力[6，8-9]。

目前，國內(nèi)外對梁王茶的研究較少，主要集中在提取純化、資源開發(fā)利用、功能活性[3，10-13]等研究，還未見梁王茶在總黃酮含量和抗菌抗氧化活性方面的比較研究，而這正是研究開發(fā)梁王茶的一個重要環(huán)節(jié)。因此，本研究首次對梁王茶不同極性部位的總黃酮含量、抗菌及抗氧化活性進(jìn)行了比較研究，探索了各極性部位總黃酮含量與抗菌、抗氧化活性之間的關(guān)系，為梁王茶的深入研究提供了前期的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

梁王茶供試品樣品于2021年采自云南大理，由大理大學(xué)藥學(xué)院姜北教授鑒定為五加科植物掌葉梁王茶M.delavayi(Franchet)J. Wen &Frodin；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，編號43300)、大腸桿菌(Escherichiacoli，編號25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，編號25923)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium，編號50222)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，編號3610)由大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室提供；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，上海麥克林生化科技有限公司；3-乙基-2-亞硝基亞胺-2，3(2H)苯噻唑(ABTS)，阿拉丁試劑有限公司；蛋白胨，廣州環(huán)凱生物科技有限公司；酵母提取物，廣州環(huán)凱生物科技有限公司；瓊脂粉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；96孔板，無錫耐思生命科技股份有限公司；蘆丁對照品(純度≥97%)，上海源葉生物科技有限公司；樹脂天青，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；L-抗壞血酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；AL204電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；YXQ-LS-50S11高壓滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPX-250B-D培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BHWY-2102變頻搖床，寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UPT-11-10T超純水儀，成都超純科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總黃酮含量的測定

(1)供試品溶液的制備

梁王茶莖和葉經(jīng)干燥、粉碎后，稱取一定量，用98%乙醇冷浸提取3次，每次24 h，濾過，合并濾液，45 ℃條件下減壓蒸餾濃縮，回收溶劑，-80 ℃預(yù)凍12 h后冷凍干燥，得乙醇提取物凍干粉備用(以下稱醇提物)。稱取醇提物以蒸餾水制成水混懸液，之后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，各極性萃取3次，萃取液經(jīng)過減壓濃縮，-80 ℃預(yù)凍12 h后冷凍干燥，分別制得梁王茶石油醚部位(L1)、乙酸乙酯部位(L2)、正丁醇部位(L3)和水溶性部位(L4)凍干粉。精密稱取醇提物及各極性部位供試品，加95%乙醇超聲溶解，定容搖勻，得濃度為1 mg/mL的供試液。

(2)對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品11.4 mg，加95%乙醇溶解定容至50 mL，搖勻，即得濃度為0.228 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

(3)供試品總黃酮含量的測定

按照文獻(xiàn)[14]方法，在紫外-可見分光光度計(jì)200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)對照品及供試液均在510 nm波長下有較大吸收波長，故選取510 nm為檢測波長。

精密量取1.3.1(1)中的供試液0.1 mL，置于10 mL量瓶中，加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min，再加入0.4 mL 5%硝酸鋁溶液，混勻，靜置6 min，最后加入1.6 mL 4%氫氧化鈉試液后，加95%乙醇至刻度10 mL，混勻，靜置15 min，以95%乙醇溶液做空白，450 nm處測定吸光度。計(jì)算樣品中總黃酮的含量，每份3個重復(fù)?？傸S酮含量(μg/mg)的計(jì)算公式如下：

總黃酮含量=C×V/m

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的總黃酮濃度，μg/mL；V為樣品溶液總體積，mL；m為稱量樣品質(zhì)量，mg。

1.3.2 抗菌活性的測定

(1)供試液與菌懸液的制備

參照文獻(xiàn)[15]方法，稱取供試品各50 mg，用含10% DMSO的無菌水于漩渦混合器上助溶，然后配成濃度為50 mg/mL的供試液。試驗(yàn)前一天，把所需菌株接種到LB瓊脂平板上，置35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)前用接種環(huán)轉(zhuǎn)移細(xì)菌至試管，于37 ℃恒溫?fù)u床中繼續(xù)培養(yǎng)過夜，實(shí)驗(yàn)前用LB培養(yǎng)基配成2×105CFU/mL的菌液，測定最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。

(2)MIC及MBC的測定

采用二倍稀釋法用菌液對50 mg/mL的供試液進(jìn)行稀釋，稀釋濃度為：25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39 mg/mL。使用96孔板進(jìn)行MIC的測定每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。先在96孔板上每孔加100 μL的菌液，樣品孔加100 μL的供試液，吸出100 μL進(jìn)行倍比稀釋，含5% DMSO的無菌水溶劑作陰性空白對照，液體培養(yǎng)基作為陰性對照，在搖床搖勻后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后每個孔加入20 μL 0.2 mg/mL樹脂天青，置于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)2 h，樹脂天青由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色的孔所對應(yīng)的最大濃度就是供試品的MIC[16]。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。

從MIC測定結(jié)果的96孔板藍(lán)色的孔中吸取50 μL于固體LB培養(yǎng)基上，涂布均勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以培養(yǎng)基表面出現(xiàn)的菌落小于5個的最低濃度判斷為MBC。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.3.3 抗氧化活性的測定

(1)DPPH自由基清除率測定

參考文獻(xiàn)[17]方法，稱取DPPH 16 mg，用無水乙醇溶解，并定量轉(zhuǎn)入200 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為80 mg/L的DPPH儲備液。

配制濃度為2.5，5，10，25，50，100，250，500，1000 mg/L的供試品和陽性對照L-抗壞血酸無水乙醇溶液。取上述溶液1.5 mL，分別加入1.5 mL 80 mg/L的DPPH甲醇溶液，混合均勻，在室溫避光條件下，靜置反應(yīng)45 min，再用紫外-可見分光光度計(jì)在517 nm處測定其吸光度Ai；取1.5 mL DPPH溶液，加入1.5 mL無水乙醇，混勻，在517 nm下測吸光度，作為A0值；取1.5 mL樣品液，加入1.5 mL無水乙醇，在517 nm下測吸光度，作為Aj值。根據(jù)以下公式計(jì)算各樣品的DPPH自由基清除率和IC50。

自由基清除率(K)計(jì)算公式如下：

K=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

IC50(清除50%自由基時樣品濃度)的計(jì)算：以樣品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，DPPH自由基清除率(%)為縱坐標(biāo)，繪制樣品的清除率曲線。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)計(jì)算線性回歸方程，根據(jù)回歸方程計(jì)算IC50值。

(2)ABTS自由基清除率測定

按照文獻(xiàn)方法[18]，制備ABTS工作液：精確配制濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液50 mL。準(zhǔn)確稱量96.02 mg ABTS，用過硫酸鉀溶液溶解并定容至25 mL容量瓶中，室溫，避光放置16 h，得濃度為7 mmol/L的ABTS儲備液。使用前用磷酸鹽緩沖液(PBS，10 mmol/L，pH=7.4)稀釋成在734 nm波長處吸光度為(0.7±0.020)，即可得到ABTS工作液。

配制濃度為1，2.5，5，10，25，50，100 mg/L的供試品和陽性對照L-抗壞血酸無水乙醇溶液。取1 mL待測樣品無水乙醇溶液，加入2 mL ABTS自由基工作液，混勻，室溫下放置10 min，分光光度計(jì)734 nm波長處測定吸光度，作為Ai值；2 mL ABTS自由基工作液，加入1 mL無水乙醇，混勻，在734 nm處測定吸光度，作為A0值；取1 mL樣品溶液，加入2 mL PBS，混勻，在734 nm處測定吸光度，作為Aj值；以L-抗壞血酸作為陽性對照。參照1.33(1)法，計(jì)算各樣品對ABTS自由基的清除率和IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 總黃酮含量的測定方法學(xué)研究結(jié)果

2.1.1 線性范圍考察

精密量取對照品溶液0.1、0.25、0.5、1、1.5、2.5、3 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min，再加入0.4 mL 5%硝酸鋁溶液，混勻，靜置6 min，最后加入1.6 mL 4%氫氧化鈉試液后，加95%乙醇至刻度10 mL，混勻，靜置15 min，以95%乙醇溶液做空白，450 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y= 9.041x+0.013，R2=0.9999。結(jié)果表明，蘆丁濃度在2.28～68.40 μg/mL線性關(guān)系良好，可用于總黃酮含量測定。

2.1.2 線性關(guān)系的考察及測定結(jié)果

(1)精密度試驗(yàn)

精密量取對照品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的顯色方法，測定吸光度，重復(fù)測定6次吸光度值，RSD=0.17%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

(2)穩(wěn)定性試驗(yàn)

取梁王茶醇提物供試品溶液適量，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的顯色方法，分別于0，15，30，45，60，120 min時，測定其吸光度值，RSD=0.89%(n=6)，結(jié)果表明顯色后120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(3)重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取梁王茶醇提物6份，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的顯色方法，測定其總黃酮含量，RSD=1.04%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

(4)加樣回收率試驗(yàn)

精密取已知總黃酮含量的梁王茶醇提物6份，精密加入一定量的蘆丁對照品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的顯色方法，計(jì)算樣品的回收率。結(jié)果顯示總黃酮的回收率平均值為99.05%，RSD=0.58%(n=6)，表明該方法回收率良好。

(5)總黃酮含量的測定

按照以上建立的方法，對梁王茶醇提物及不同極性部位的總黃酮進(jìn)行含量測定，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算得出總黃酮含量如表1所示。

表1 醇提物及不同極性部位的總黃酮含量測定結(jié)果

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，梁王茶莖葉中含有豐富的總黃酮，總黃酮在不同極性部位中均有分布，其含量大小順序?yàn)椋篖2>醇提物>L3>L1>L4。其中，L2中總黃酮含量最高為(448.68±1.85)μg/mg，L1和L4中總黃酮含量最低分別為(134.02±1.37)和(111.92±1.79)μg/mg，說明石油醚和水對于富集黃酮類成分效果不佳，而在乙酸乙酯中的富集效果最好。

2.2 抗菌活性的測定結(jié)果

將供試品針對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌進(jìn)行了MIC和MBC的測定。在實(shí)驗(yàn)前，對于5種細(xì)菌進(jìn)行了DMSO的抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)5種細(xì)菌在DMSO含量低于5%時對細(xì)菌生長沒有影響，因此選擇含有10% DMSO的無菌水作為溶劑進(jìn)行倍比稀釋。樹脂天青是一種細(xì)胞毒性檢測的常用試劑，活細(xì)菌中含有乳酸脫氫酶，使用樹脂天后菌液顏色由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色，而死細(xì)菌則不變色[19]。因此，可通過樹脂天青法觀察確定MIC和MBC值。由表2的結(jié)果可知，醇提物及各極性部位對于5種細(xì)菌的MIC值為3.13～12.5 mg/mL，MBC值為6.25～25 mg/mL；其中，L1的MIC值為6.25～12.5 mg/mL，MBC值為12.5～25 mg/mL，對MRSA抑菌及殺菌活性最佳；L2的MIC值為3.13～12.5 mg/mL，MBC值為3.13～25 mg/mL，對枯草芽孢桿菌的抑菌和殺菌活性最佳；L3的MIC值為12.5～25 mg/mL，對金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和MRSA沒有殺菌活性；L4活性較差，對MRSA和大腸桿菌具有一定的抑菌活性，沒有殺菌活性。以上結(jié)果可知，醇提物及不同極性部位對革蘭氏陽性細(xì)菌和格蘭氏陰性細(xì)菌均具有不同程度的的抑制作用，因此，梁王茶具有廣譜抑菌活性。4個提取部位中，通過對MIC及MBC值的比較，發(fā)現(xiàn)L2的抑菌和殺菌活性最好。該結(jié)果與之前總黃酮含量結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)總黃酮含量及抗菌活性均是L2最佳，可知抑菌活性與總黃酮含量有一定的相關(guān)性，與之前學(xué)者的研究結(jié)果一致[20]。L2的抑菌活性與醇提物相比略差，說明醇提物中成分繁多，各成分之間可能相互協(xié)同加強(qiáng)了抑菌作用。

表2 醇提物及不同極性部位的MIC、MBC值

2.3 抗氧化活性的測定結(jié)果

2.3.1 清除DPPH自由基的能力

DPPH中氮自由基可以穩(wěn)定存在，其醇溶液顯紫色，加入抗氧化劑，其醇溶液的紫色會減弱甚至消失。溶劑顏色褪去的越多，DPPH的清除率越高，表明抗氧化活性越高[21]。由圖1知，醇提物及不同極性部位清除DPPH自由基的能力呈明顯的劑量依賴性，清除率隨濃度增加而提高，當(dāng)濃度增加到一定值后，清除率趨于穩(wěn)定。表3可知，在醇提物及不同極性部位中，L2對DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)(IC50=89.46 mg/L)，L4的清除能力最弱(IC50=773.67 mg/L)。說明乙酸乙酯相富集的化合物具有較好的DPPH自由基的清除能力，水相中富集的化合物清除DPPH自由基的能力較弱。梁王茶醇提物及不同極性部位與陽性對照DPPH自由基清除能力的順序?yàn)椋篖-抗壞血酸>L2>醇提物>L3>L1>L4，該結(jié)果與之前的總黃酮含量的測定結(jié)果一致，說明梁王茶的DPPH自由基清除能力與黃酮類化合物有一定的相關(guān)性。

圖1 醇提物及不同極性部位DPPH自由基清除率曲線

表3 醇提物及不同極性部位DPPH自由基清除率的IC50值及線性方程

2.3.2 清除ABTS自由基的能力

ABTS自由基是一種被氧化成綠色的自由基，當(dāng)抗氧化物存在時，ABTS自由基與之反應(yīng)，使其藍(lán)綠色褪去，褪色越明顯，表明該物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)[22]。由圖2可知，醇提物及不同極性部位清除ABTS自由基的能力呈明顯的劑量依賴性，清除率隨濃度增加而提高，當(dāng)濃度增加到一定值后，除石油醚相外，清除率趨于穩(wěn)定并達(dá)到100%。如表4所示，不同極性部位均具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除能力。其中，L2對ABTS自由基的清除能力最強(qiáng)(IC50=19.31 mg/L)，L1的清除能力最弱(IC50=183.29 mg/L)，L3、L4的清除能力與醇提物相當(dāng)。說明乙酸乙酯相富集的化合物具有較好的ABTS自由基的清除能力，石油醚相中富集的化合物清除ABTS自由基的能力較弱。與DPPH自由基清除能力相比，發(fā)現(xiàn)醇提物及不同極性部位對ABTS自由基清除率的IC50值差異不大且數(shù)值總體偏小，說明醇提物及不同極性部位的ABTS自由基清除能力總體強(qiáng)于DPPH自由基的清除能力。

圖2 醇提物及不同極性部位ABTS自由基清除率曲線

表4 醇提物及不同極性部位ABTS自由基清除率的IC50值及線性方程

醇提物及不同極性部位和陽性對照對ABTS自由基的清除能力順序?yàn)椋篖-抗壞血酸>L2>醇提物>L3>L4>L1。該結(jié)果中，L2表現(xiàn)出較強(qiáng)的ABTS自由基清除能力，之前的測定結(jié)果可知，L2是ABTS自由基的清除能力最強(qiáng)的組分，同時也是富集總黃酮含量最多的組分。綜上，不同極性部位的自由基清除能力與總黃酮類化合物有明顯的相關(guān)性，且含量越高自由基清除能力越強(qiáng)，與之前學(xué)者發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物具有較好的抗氧化能力的研究結(jié)果相一致[23]。

3 結(jié) 論

本文首次研究了梁王茶醇提物及不同極性部位的總黃酮含量、抗菌及抗氧化活性，探討分析了醇提物及4個不同極性部位之間總黃酮含量的差異，以及總黃酮與抗菌、抗氧化活性之間的關(guān)系。結(jié)果表明，醇提物經(jīng)過萃取后，總黃酮在乙酸乙酯相(L2)富集效果最好，含量為(448.68±1.85)μg/mg，水相(L4)富集效果最差，含量為(111.92±1.79)μg/mg。醇提物及不同極性部位具有廣譜抑菌活性，MIC值為3.13～25 mg/mL，MBC值為3.13～25 mg/mL，4個極性部位中L2的抑菌和殺菌活性最好。同時，醇提物及不同極性部位表現(xiàn)出較強(qiáng)的自由基清除能力，其中L2對DPPH自由基(IC50=89.46 mg/L)和ABTS自由基(IC50=19.31 mg/L)的清除能力較強(qiáng)。綜上，梁王茶莖葉中含黃酮類化合物，L2富集黃酮類化合物效果最佳，同時L2也表現(xiàn)出較好的抗菌及抗氧化活性，說明梁王茶的抗菌和抗氧化活性與總黃酮有明顯的相關(guān)性，為梁王茶的開發(fā)以及在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供前期的理論基礎(chǔ)。