水溶劑快速萃取-超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜測定土壤中磺胺類抗生素*

羅火焰，皮施施，吉義平，宋 洲，4，周宇齊，鐘 旭，楊 杰

(1 湖北華祥地質(zhì)環(huán)境檢測科技有限公司，湖北 武漢 430000；2 中國地質(zhì)大學(武漢)，湖北 武漢 430074；3 湖北省地質(zhì)實驗測試中心，湖北 武漢 430034；4 資源與生態(tài)環(huán)境地質(zhì)湖北省重點實驗室(湖北省地質(zhì)局)，湖北 武漢 430034)

磺胺類抗生素(sulfonamides，SAs)具有抗菌譜廣、高效、吸收迅速完全和價格低廉等特點而被大量應用于人和動物的疾病治療[1-4]，磺胺類藥物以母體及代謝物的形式排入環(huán)境，在系統(tǒng)中發(fā)生遷移、轉化、沉降富集于環(huán)境介質(zhì)[5-6]或直接吸附于土壤沉積物上[7]，長期持續(xù)污染對生態(tài)系統(tǒng)和人體健康帶來巨大的潛在危害。磺胺類抗生素作為一類新型有機污染物，其環(huán)境污染程度、環(huán)境行為和潛在的風險研究已經(jīng)是21世紀的熱點[8-10]。目前國內(nèi)關于土壤中磺胺類抗生素殘留的分析方法[11-16]，主要是通過乙腈、甲醇和有機試劑-緩沖鹽溶液等體系進行提取，前處理過程較為繁瑣，且有機試劑的使用易導致二次環(huán)境污染。本論文利用磺胺類抗生素具有一定的極性和水溶性的特點[11]，采用純水作為提取劑，在高溫高壓下進行提取，通過優(yōu)化萃取條件、固相萃取富集凈化條件、濃縮條件，解決了現(xiàn)有磺胺類抗生素測定方法中提取劑含有有機溶劑及其他復雜成分的問題，降低了后續(xù)分離富集的難度，開發(fā)出了一種結果準確且簡單綠色的測定方法。

1 實 驗

1.1 儀器和設備

ACQUITY UPLC Xevo TQ-S超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters公司；Dionex ASE 350加速溶劑萃取儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；TURBOVAP II全自動氮吹濃縮儀，瑞典Biotage公司；Scientz-18N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；3K15型臺式高速冷凍離心機，德國Sigma公司；CNW 24位固相萃取真空裝置，德國CNW Technologies GmbH公司；Milli-Q Direct 8型水純化系統(tǒng)，德國Merk Millipore公司。

1.2 標準和主要試劑

磺胺嘧啶(固體，純度99.22%)，磺胺噻唑(100 μg/mL，甲醇，純度99.1%)，磺胺吡啶(固體，純度99.75%)，磺胺甲基嘧啶(固體，純度99.72%)，磺胺二甲嘧啶(固體，純度99.46%)，磺胺甲氧噠嗪(100 μg/mL，甲醇，純度99.7%)，磺胺氯噠嗪(100 μg/mL，甲醇，純度99.1%)，磺胺甲基異噁唑(固體，純度99.56%)，磺胺二甲異噁唑(100 μg/mL，甲醇，純度99.6%)和磺胺間二甲氧嘧啶(固體，純度99.47%)，德國Dr. Ehrenstorfer公司；磺胺甲噻二唑-13C6(固體，內(nèi)標物)，WITEGA Laboratorien。

甲酸(LC/MS級，純度≥98.0%)、CNW Poly-Sery HLB Pro固相萃取柱(6 mL/500 mg)、CNWBOND大孔硅藻土(10～20目)，德國CNW Technologies GmbH公司；0.22 μm尼龍微孔濾膜、50 mL PP離心管，上海安譜實驗科技股份有限公司；色譜流動相用甲醇(Optima LC/MS級)，F(xiàn)isher Chemical；凈化用甲醇(色譜純)，F(xiàn)isher Chemical；鹽酸(分析純)，開封東大化工有限公司；石英砂(分析純，25～50目)，國藥集團化學試劑有限公司；臨用前在馬弗爐中650 ℃烘烤4 h；實驗用水均為超純水，電阻率18.2 MΩ·cm。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

先將磺胺類抗生素固體標準品用LC/MS級甲醇分別配制成100 μg/mL的標準儲備液，然后將所有磺胺類抗生素配制為1.0 μg/mL的混合標準工作溶液，于-20 ℃避光保存。使用時，用LC/MS級甲醇-水溶液(體積比1∶1)根據(jù)需要稀釋成不同質(zhì)量濃度的標準工作液，4 ℃避光保存。

1.3.2 樣品前處理

提?。翰杉男迈r土壤樣品經(jīng)冷凍干燥后研磨混勻，轉移至密閉棕色玻璃瓶中4 ℃避光保存?zhèn)溆?。準確稱取5.0 g樣品于瑪瑙研缽中，添加3.0 g硅藻土研磨混勻后轉入22 mL萃取池中，萃取池底部和上部分別填有石英砂。萃取溶劑為超純水，系統(tǒng)壓力1500 psi，溫度100 ℃，加熱時間5 min，靜態(tài)時間5 min，循環(huán)2次，潤洗體積60%，吹掃時間60 s。提取液轉移至50 mL離心管中8000 r/min離心2 min，上清液調(diào)pH待過柱凈化。

凈化：依次用6 mL甲醇和6 mL超純水活化平衡小柱5 min，待上述上清液上樣后再用10 mL超純水淋洗，真空抽干10 min，隨后用10 mL甲醇洗脫，收集洗脫液在40 ℃水浴中氮氣壓力7～10 psi條件下濃縮至近1 mL，添加內(nèi)標后超純水定容至2 mL，過0.22 μm濾膜，待上機測試。

1.3.3 UPLC-MS/MS分析條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1 mm×100 mm×1.7 μm；流動相：A(0.1%甲酸水溶液)，B(甲醇)；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子模式(ESI+)；源溫度：150 ℃；毛細管電壓：3.00 kV；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流速：1000 L/h；噴霧氣壓力：7 bar；監(jiān)測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；目標化合物的質(zhì)譜參數(shù)設置如表2所示，UPLC-MS/MS色譜圖見圖1。

圖1 目標化合物UPLC-MS/MS色譜圖

表2 目標化合物質(zhì)譜參數(shù)

2 結果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

影響快速萃取效率的因素主要包括萃取溫度、萃取時間和次數(shù)等因素，筆者為了篩選出合適的快速溶劑萃取儀的萃取溫度和次數(shù)，分別通過實際空白土壤樣品加標實驗，對萃取溫度40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃和120 ℃，萃取次數(shù)1、2和3次進行了試驗，結果見圖2和圖3。

圖2 不同提取溫度下目標化合物萃取回收率(化合物序號對應物質(zhì)如表2所示)

圖3 不同循環(huán)次數(shù)下目標化合物萃取回收率(化合物序號對應物質(zhì)如表3所示)

由圖2可知，在萃取溫度為100、120 ℃的條件下，10種磺胺類物質(zhì)的平均回收率在78.8%～129%，整體優(yōu)于其它溫度條件；由圖3可知，在萃取循環(huán)大于1次數(shù)時，平均回收率明顯提高的趨勢，而循環(huán)2、3次時，整體回收率無明顯變化趨勢。因此從萃取效率和消耗能量的角度綜合考慮，選擇萃取溫度100 ℃，萃取次數(shù)為2次作為快速萃取條件10種磺胺類的平均回收率為78.8%～115%。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

選用HLB固相萃取小柱，對水溶劑萃取液中的10種磺胺類的富集效果進行研究，考慮了磺胺類抗生素具有磺酰氨基和氨基等官能團，在水溶劑具有酸堿兩性的性質(zhì)，其上樣的pH值直接會改變目標化合物在萃取小柱中的保留形態(tài)，導致其與小柱填料中官能團的相互作用力產(chǎn)生差異，從而直接影響固相小柱的富集效率與洗脫效率。為此，本實驗為了篩選出最合適的上樣pH值和洗脫條件，在空白樣品萃取液中加入一定量的目標化合物標液，通過酸堿試劑調(diào)節(jié)不同的pH值(2、4、7、9、11)后上樣，用不同體積(4、6、8、10 mL)的甲醇洗脫小柱，考察不同條件下的回收率，結果如圖4和圖5所示。

圖4 不同上樣溶液pH下目標化合物凈化回收率(化合物序號對應物質(zhì)如表2所示)

圖5 不同洗脫液體積下目標化合物凈化回收率(化合物序號對應物質(zhì)如表2所示)

由圖4可知，除磺胺嘧啶化合物，其余化合物在pH值2～11范圍內(nèi)上樣，富集的平均回收率在66.4%～108%，表明HLB小柱在酸、中、堿性pH范圍內(nèi)對本文研究磺胺類均有較好的富集能力；pH值為7時，目標化合物整體回收率最高；如圖5可知，當甲醇溶劑洗脫體積大于8 mL時，目標化合物平均回收率均高于91.3%。綜上考慮，本文選擇萃取液上樣的pH值為7左右，甲醇洗脫體積為10 mL。

2.3 濃縮條件的優(yōu)化

水浴溫度和氮氣壓力是控制目標化合物快速濃縮的主要因素。本實驗選擇在氮氣壓力7～10 psi條件下，考察了不同水浴溫度條件下濃縮對目標回收率的影響，結果如圖6所示。結果表明，水浴溫度40 ℃為最佳條件。

圖6 不同水浴溫度下目標化合物濃縮的回收率(化合物序號對應物質(zhì)如表2所示)

2.4 方法線性范圍、檢出限及回收率

考慮到儀器靈密度和實際樣品檢測中的應用，配制濃度為0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0和50.0 μg/L的標準系列，其中內(nèi)標濃度均為5.00 μg/L，以各組分的峰面積與內(nèi)標峰面積的比值對質(zhì)量濃度繪制標準曲線。同時根據(jù)HJ168-2020的規(guī)定[17]，連續(xù)測定7個接近預期方法檢出限濃度的空白加標樣品，用其測定值的標準偏差計算方法檢出限。

由表3可知，在0.5～50 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，10目標化合物的線性關系良好，擬合相關系數(shù)均>0.997，可用于化合物定量。10種磺胺類化合物的檢出限為0.03～0.06 μg/kg。

表3 目標化合物測定線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、平均回收率、相對標準偏差及方法檢出限

為進一步考察本方法對土壤樣品測定的適用性，采集某地的實際土壤樣品，進行了基體加標回收實驗。經(jīng)測定，土壤中磺胺類化合物本底值均小于方法檢出限，再向其中添加低、中和高3個水平的目標物，平行測試測定6次，計算回收率和相對偏差，結果如表3所示。10種磺胺類化合物的平均加標回收率為63.1%～112%，測定結果的標準偏差為0.70%～14.7%(n=6)，說明該方法可用于土壤樣品中10磺胺類的準確測定。

3 結 論

通過對土壤中10種磺胺類抗生素的萃取、富集凈化和濃縮等前處理條件進行優(yōu)化，研究建立了水溶劑加速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定土壤中磺胺類抗生素的方法，該方法檢出限低，靈敏度高且加標回收率和精密度均能滿足土壤樣品中痕量磺胺類的分析要求。