UPLC測(cè)定不同產(chǎn)地茯苓中5種三萜類成分的含量*

張麗君，王 凱，劉 鳴，雷 麗，高 波，譚 沛，高 巍，3

(1 安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司，安徽 淮北 235000；2 華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；3 華潤(rùn)三九(六安)中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，安徽 六安 237000；4 華潤(rùn)三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000)

茯苓是我國(guó)大宗常用菌類藥材，已有二千多年應(yīng)用歷史，具有利水滲濕，健脾寧心的功效[1-2]，廣泛用于臨床配方。茯苓在我國(guó)廣有分布，但經(jīng)年采收，野生資源已稀存，藥材主要依靠栽培提供，且不同產(chǎn)地栽培的茯苓藥材存在一定的差異。2020版《中國(guó)藥典》茯苓項(xiàng)下未制定含量測(cè)定項(xiàng)，不能對(duì)茯苓質(zhì)量進(jìn)行全面控制。以往文獻(xiàn)研究顯示，多糖和三萜類化合物為茯苓的主要化學(xué)成分為[3-4]。根據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道，茯苓菌絲體和菌核中分離到的三萜類化合物多屬于四環(huán)三萜類，且主要為羊毛甾型四環(huán)三萜[5]。本實(shí)驗(yàn)主要采用UPLC法，對(duì)茯苓中5種三萜類成分去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、去氫茯苓酸、松苓新酸[6-12]同時(shí)測(cè)定，以期對(duì)茯苓藥材不同產(chǎn)地[13-14]的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定的參考。

1 儀器與試藥

Thermo Vanquish超高效液相色譜儀，賽默飛科技有限公司；KQ-800 DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；XPE 26、MS204S電子天平，METTLER TOLEDO公司。

12批茯苓藥材分別從湖南、湖北、云南、安徽4個(gè)主產(chǎn)區(qū)收集，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核、去氫土莫酸對(duì)照品(批號(hào)：170112-202012，純度98.0%)、豬苓酸C對(duì)照品(批號(hào)：260087-202107，純度96.0%)、松苓新酸對(duì)照品(批號(hào)：190166-202009，純度98.0%)，上海鴻永生物科技有限公司；去氫茯苓酸對(duì)照品(批號(hào)：21060701，純度99.5%)，成都格力普生物科技有限公司；3-表去氫土莫酸對(duì)照品(批號(hào)：020177-202107，純度96.0%)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為娃哈哈水；其它試劑均為分析純。

表1 茯苓樣品來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：HSS T3-C18(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(78∶22)；柱溫：25 ℃；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：243 nm；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、去氫茯苓酸、松苓新酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL中含去氫土莫酸25 μg、豬苓酸C 12.5 μg、3-表去氫土莫酸7.5 μg、去氫茯苓酸15 μg、松苓新酸5 μg的混合溶液，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定茯苓藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇10 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，濾過(guò)，即得。

UPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 茯苓UPLC

2.4 線性范圍考察

精密稱定5種三萜類指標(biāo)成分對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL中含去氫土莫酸0.1947 mg、豬苓酸C 0.0964 mg、3-表去氫土莫酸0.0548 mg、去氫茯苓酸0.1145 mg、松苓新酸0.0368 mg的混合對(duì)照品母液，精密吸取母液5 mL加甲醇定容至10 mL，依次等比稀釋，得到7份系列濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定并記錄相應(yīng)峰面積。將峰面積做為縱坐標(biāo)Y，將對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)做為橫坐標(biāo)X，并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性回歸關(guān)系結(jié)果

2.5 供試品精密度試驗(yàn)

對(duì)同一份茯苓藥材粉末(批號(hào)201004)精密稱定，按供試品制備方法處理，同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各指標(biāo)成分的峰面積，結(jié)果5種三萜類指標(biāo)成分的峰面積RSD均<2%，說(shuō)明該方法儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)同一批茯苓藥材粉末(批號(hào)201004)精密稱定，按供試品制備方法處理，并進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)各指標(biāo)成分峰面積計(jì)算含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD，結(jié)果去氫土莫酸RSD為0.92%；豬苓酸CRSD為0.99%；3-表去氫土莫酸RSD為1.01%；去氫茯苓酸RSD為0.98%；松苓新酸RSD為0.92%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)同一份茯苓藥材粉末(批號(hào)201004)精密稱定，按供試品制備方法處理，并分別在第0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算各指標(biāo)成分的峰面積RSD，結(jié)果去氫土莫酸RSD為0.10%；豬苓酸CRSD為0.09%；3-表去氫土莫酸RSD為0.19%；去氫茯苓酸RSD為0.19%；松苓新酸RSD為1.86%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)(樣品盤25 ℃)穩(wěn)定，可以滿足測(cè)定需要。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

對(duì)同一批已知含量的茯苓藥材粉末(批號(hào)201004)6份(未扣水分去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、去氫茯苓酸、松苓新酸的含量分別為0.29、0.12、0.08、0.17、0.05 mg/g)精密稱定，每份約0.5 g，另用甲醇配制每1 mL中含去氫土莫酸140 μg、豬苓酸C 65 μg、3-表去氫土莫酸42 μg、去氫茯苓酸87 μg、松苓新酸28 μg的混合對(duì)照品溶液，精密加入1 mL該混合對(duì)照品溶液至每份供試品樣品中，再按2.3項(xiàng)下制備方法處理樣品，并對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明該方法回收率良好。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3～表7。

表3 去氫土莫酸加樣回收率

表4 豬苓酸C加樣回收率

表5 3-表去氫土莫酸加樣回收率

表6 去氫茯苓酸加樣回收率

表7 松苓新酸加樣回收率

2.9 樣品測(cè)定

分別對(duì)12批不同產(chǎn)地的茯苓藥材樣品，按確定的供試品制備方法和色譜條件測(cè)定，5種三萜類成分的含量見(jiàn)表8。

表8 5種成分含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 波長(zhǎng)的選擇

對(duì)去氫土莫酸等五種三萜類成分在190～400 nm下進(jìn)行3D圖譜全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在波長(zhǎng)為243 nm時(shí)五種三萜類目標(biāo)成分均呈現(xiàn)出最大吸收，故最終確定茯苓藥材樣品的檢測(cè)波長(zhǎng)為243 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇

分別考察了乙腈-水，甲醇-水，乙腈-0.1%磷酸，甲醇-0.1%磷酸四種不同流動(dòng)相，結(jié)果顯示當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸時(shí)，5種三萜類目標(biāo)成分出峰時(shí)間較短，峰形、分離度等系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)也較好。

3.3 提取方法的選擇

對(duì)供試品提取方法進(jìn)行考察時(shí)，主要研究了超聲和回流兩種不同提取方法的差異，結(jié)果顯示，當(dāng)提取方法為超聲時(shí)，5種三萜類目標(biāo)成分色譜峰峰面積均高于回流提取，且超聲在實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中更簡(jiǎn)便，故最終選擇提取方法為超聲；并進(jìn)一步對(duì)不同提取溶劑(水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇)進(jìn)行考察，對(duì)比試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇的提取效果更加充分完全；在此基礎(chǔ)上，比較了甲醇超聲不同提取時(shí)間(15 min、30 min、45 min)的差別，結(jié)果超聲30 min、45 min各色譜峰峰面積基本無(wú)變化，故確定30 min為最終超聲提取時(shí)間；進(jìn)而考察了甲醇提取溶劑用量5 mL、10 mL、20 mL的提取效果，結(jié)果三者差異不大，考慮到操作性，最終選擇提取溶劑用量為10 mL。

3.4 質(zhì)量分析

4個(gè)產(chǎn)地茯苓藥材中5種三萜類成分總含量差異不大，可能原因?yàn)楫a(chǎn)地樣品的代表性不夠，后續(xù)建議擴(kuò)大收集樣本量，進(jìn)一步探討各產(chǎn)地之間茯苓質(zhì)量的差異。

4 結(jié) 論

三萜類化合物作為茯苓的主要有效成分，具有抗炎、利尿、免疫抑制、神經(jīng)生長(zhǎng)促進(jìn)、抗癌等作用。本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC方法可同時(shí)測(cè)定5種三萜類成分(去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、去氫茯苓酸、松苓新酸)含量，具有方法準(zhǔn)確可靠、快速、操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)椴煌a(chǎn)地茯苓的質(zhì)量控制提供一定的參考。