氧化石墨烯固定化溶菌酶的研究進(jìn)展*

李 慧，龐姍姍，田家瑤，王云云，薛志飛，龔國利

(1 陜西科技大學(xué)設(shè)計(jì)與藝術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710021；2 陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

GO雖然對(duì)溶菌酶具有良好的吸附作用，但GO與蛋白質(zhì)的相互作用，會(huì)擾亂蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性，從而導(dǎo)致活性的降低[17-18]。Yang等[19]研究了溶菌酶在GO和RGO上的吸附，測定了載體對(duì)酶活性的抑制作用，與RGO相比，GO對(duì)溶菌酶活性表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用，GO誘導(dǎo)酶去折疊，導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)喪失，色氨酸殘基暴露于水環(huán)境中，GO濃度從2 μg/mL增加到18 μg/mL，溶菌酶的活性從93.8%降低至56.2%，RGO濃度從0 μg/mL增加到2 μg/mL，溶菌酶活性增加2.4%，當(dāng)RGO濃度增加到18 μg/mL，仍保留初始酶活94.9%。Chakrabarti等[16]研究了雞蛋清溶菌酶(HEWL)吸附在GO上對(duì)結(jié)構(gòu)和功能的影響。結(jié)果顯示，雞蛋溶菌酶可以在GO上自發(fā)固定，固定后溶菌酶的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)變化較小，但熱穩(wěn)定性和酶的活性顯著降低。GO對(duì)溶菌酶活性和構(gòu)象具有顯著影響，GO固定溶菌酶，色氨酸殘基(Trp)的環(huán)境變化影響酶的活性位點(diǎn)，對(duì)酶活性產(chǎn)生抑制作用。

本文綜述近年來通過功能化修飾、包覆-吸附法、與天然高分子共混、位點(diǎn)特異性固定等方法，穩(wěn)定GO對(duì)溶菌酶的吸附量，減少抑制酶活的原理、方法，并對(duì)未來該領(lǐng)域的發(fā)展方向做出展望。

1 GO固定化溶菌酶的途徑

傳統(tǒng)的固定化酶的方式有共價(jià)結(jié)合、物理吸附、交聯(lián)、包埋四種。GO表面有豐富的含氧官能團(tuán)，在固定溶菌酶時(shí)，主要有物理吸附法和共價(jià)結(jié)合法兩種途徑。

1.1 物理吸附法

GO作為載體，目前采用物理吸附法固定溶菌酶的應(yīng)用較為廣泛。物理吸附法是通過載體表面和酶分子表面之間的范德華力、離子鍵、氫鍵、疏水相互作用等分子間弱相互作用力達(dá)到酶固定目的的方法。這種酶固定方式實(shí)驗(yàn)條件便利，眾多研究學(xué)者在固定溶菌酶時(shí)采用了物理吸附法。比如：Zhang等[20]通過靜電吸附作用把溶菌酶固定在GO表面，然后將溶菌酶-GO共混到聚醚砜鑄膜液中，通過相轉(zhuǎn)化法制備了對(duì)大腸桿菌抑菌率可達(dá)68%的聚醚砜超濾膜。

1.2 共價(jià)結(jié)合法

共價(jià)結(jié)合法是通過共價(jià)鍵將酶表面的氨基酸殘基與載體表面的活性基團(tuán)連接，進(jìn)行酶固定的方法。與物理吸附法相比，共價(jià)固定的酶穩(wěn)定性更強(qiáng)，不易從載體表面脫離。這一方法要求載體上有較多的化學(xué)基團(tuán)或者有較強(qiáng)的可修飾性，便于與酶分子結(jié)合。GO表面富含羥基，可以通過在載體表面引入氨基，再通過交聯(lián)劑固定化酶。文獻(xiàn)報(bào)道，溶菌酶可以通過共價(jià)結(jié)合法固定在殼聚糖表面[21-22]，殼聚糖分子中的游離氨基可通過雙功能試劑戊二醛與溶菌酶發(fā)生偶聯(lián)，固定后酶的最適pH降低0.5，最適溫度升高5 ℃，熱穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性的到提高。

2 固定化方法對(duì)溶菌酶吸附量及酶活性的影響

2.1 修飾-固定法對(duì)溶菌酶吸附量及酶活性的影響

納米材料的化學(xué)功能化是一種成熟的技術(shù)，用于將所需的官能團(tuán)接枝到其表面上，獲得功能化改性納米材料的方法。GO表面具有環(huán)氧基、羥基、羧基等多種含氧基團(tuán)，利用這些活性含氧基團(tuán)與其它試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，如GO的氨基化[23]、蛋白質(zhì)修飾[24]、化學(xué)還原[25]和聚乙二醇化[26]，可改善GO與生物分子之間的親和力。

GO的氨基化對(duì)酶的穩(wěn)定性有積極的影響，相比于GO，GO-NH對(duì)酶活性的影響更小。固定化酶的催化行為與其α-螺旋含量有關(guān)，α-螺旋含量是酶正確折疊的良好指標(biāo)，雖然完整的α-螺旋結(jié)構(gòu)并不能保證酶的活性，但這種二級(jí)結(jié)構(gòu)元素的丟失通常會(huì)導(dǎo)致酶失活。Stamatis等[27]對(duì)比分析了脂肪酶固定在GO表面和氨基化GO表面時(shí)酶的α-螺旋含量，直接固定在GO表面，脂肪酶α-螺旋含量下降，而固定在氨基化GO表面時(shí)，脂肪酶α-螺旋含量卻增加。氨功能化會(huì)在GO表面形成隔離層，減少載體的聚集，也有助于避免酶與載體的剛性碰撞。此外，氨功能化提高了GO表面的親和性并引入大量氨基，有助于后續(xù)修飾過程的進(jìn)行，也中和了GO的負(fù)電荷，減小了靜電相互作用對(duì)酶活性的影響[28]。親和固定可以避免隨機(jī)固定化引起的構(gòu)象變化，從而保證了酶的活性[29]。

牛血清白蛋白(BSA)通常用于控制蛋白質(zhì)與各種固體表面的粘附，通過對(duì)BSA殘基的化學(xué)修飾，控制其在GO表面的吸附，為酶在GO表面的結(jié)合提供了有利條件。Kumar等[30]將高度陽離子化的牛血清白蛋白(cBSA)吸附于GO表面，有效維持與GO結(jié)合后酶的結(jié)構(gòu)和活性，GO經(jīng)過cBSA修飾后，表面親和力提高，可以有效保持固定化酶的活性，GO表面cBSA吸附量越多，載體對(duì)酶活的影響越小。

還原氧化石墨烯(RGO)是由GO經(jīng)過反應(yīng)去除一些氧化的官能團(tuán)得到的，RGO有高比表面積、低電導(dǎo)率、高缺陷和親水性等特性[31]。GO和RGO在不修飾或使用偶聯(lián)劑的情況下，依靠氫鍵、靜電、疏水、弱范德華力、π-π相互作用以及共價(jià)相互作用可以直接固定蛋白質(zhì)，但這些相互作用會(huì)影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象、活性和穩(wěn)定性[20，25]。Yang等[19]比較了GO和RGO對(duì)溶菌酶構(gòu)象和活性的影響。相較于RGO，GO對(duì)酶活性的抑制更為嚴(yán)重，而RGO對(duì)酶活性幾乎沒有影響；GO和RGO對(duì)溶菌酶活性的不同影響是由于它們誘導(dǎo)了酶構(gòu)象發(fā)生了不同的變化；GO固定溶菌酶，降低了α-螺旋含量，酶二級(jí)結(jié)構(gòu)喪失，活性位點(diǎn)暴露于水環(huán)境中，導(dǎo)致酶失活。RGO固定溶菌酶，α-螺旋含量卻略有增加，表明RGO對(duì)溶菌酶的生物相容性高于GO。

聚乙二醇(PEG)是一種水溶性聚合物，被用于許多藥物和生物技術(shù)應(yīng)用中生物大分子和表面的修飾，作為一種間隔物，可以保護(hù)酶免受變性作用[26]。Wang等[32]合成了一種新型磁性多臂納米復(fù)合材料GO@Fe3O4@6arm-PEG-NH2，并進(jìn)行HRP的固定化研究，與游離酶相比，固定化HRP的熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性均有提高；經(jīng)8次循環(huán)后，固定化HRP的活性仍在68.1%以上。

2.2 包覆-吸附法對(duì)溶菌酶吸附量及酶活性的影響

包覆-吸附法也可以改善GO對(duì)酶的活性和穩(wěn)定性的影響。Luo等[33]提出了一種原位自由基聚合技術(shù)與非共價(jià)吸附方法相結(jié)合的雙固定化酶的方法，可有效提高酶的活性和穩(wěn)定性。通過原位自由基聚合法在酶表面包裹N-烯酰氧基琥珀酰亞胺(NAS)單體聚合物殼，形成帶正電荷的NOPH10納米球，可穩(wěn)定酶的構(gòu)象并保護(hù)其結(jié)構(gòu)在固定化過程中不變形；同時(shí)該殼層結(jié)構(gòu)可保護(hù)酶結(jié)構(gòu)免受熱效應(yīng)的影響，提高酶的熱穩(wěn)定性。Griebenow等[34]研究了化學(xué)糖基化對(duì)酶在GO納米片上固定后穩(wěn)定性的影響。膽紅素氧化酶(BOD)共價(jià)連接葡聚糖生成糖基化BOD，穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，用GO固定糖基化BOD時(shí)，酶結(jié)構(gòu)基本不變。糖基化通過限制蛋白質(zhì)遷移率來增加穩(wěn)定性，有助于生成高度穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-GO生物結(jié)合物，用于生物納米技術(shù)領(lǐng)域。

2.3 共混對(duì)溶菌酶吸附量及酶活性的影響

殼聚糖、海藻酸鈉、明膠等天然高分子材料是酶固定化研究中常用的傳統(tǒng)載體，具有良好的生物相容性，可延長酶的壽命，提高酶的穩(wěn)定性。GO和天然高分子材料的復(fù)合物可作為一種生物友好的生物相容性界面，用于固定生物分子，為生物分子提供良好的微環(huán)境，并有效地保持其活性[35-36]。GO表面的靜電荷會(huì)使其聚集，用殼聚糖、海藻酸鈉等材料與GO共混能防止GO聚集，增強(qiáng)其穩(wěn)定性[37]。通過靜電層層自組裝、化學(xué)沉淀法、靜電液滴法、自由基聚合法等方法，天然高分子材料與GO可以形成微球、納米粒子、復(fù)合膜水凝膠、復(fù)合膜等復(fù)合材料，以這些復(fù)合材料為載體，不僅可以提高酶的吸附量，還可以提高固定化酶的活性、穩(wěn)定性和重復(fù)利用性[36，38]。Xue和Wang[39-40]分別測試了新型羧甲基殼聚糖-GO雜化顆粒和功能性胍離子液體包覆的磁性殼聚糖GO對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能，發(fā)現(xiàn)兩種復(fù)合材料對(duì)溶菌酶均有良好的吸附性。He等[38]將GO包裹在海藻酸鈉中，制備了鈣離子交聯(lián)的海藻酸鈉/GO復(fù)合凝膠珠(Ca-SA/GO)，并將其用于對(duì)溶菌酶的吸附。GO的濃度越高，Ca-SA/GO對(duì)溶菌酶的吸附能力越好；CA-SA/GO經(jīng)3個(gè)循環(huán)使用后，對(duì)溶菌酶的吸附能力仍保持在80%以上。Ca-SA/GO具有良好的穩(wěn)定性、吸附能力和再生能力，是一種很有前途的溶菌酶吸附劑。

2.4 位點(diǎn)特異性固定對(duì)溶菌酶吸附量及酶活性的影響

GO固定溶菌酶導(dǎo)致酶失活的主要原因是酶構(gòu)象的改變以及活性位點(diǎn)無法到達(dá)底物。位點(diǎn)特異性共價(jià)固定，允許酶以確定的、可控的方式排列，通過形成親和鍵來改善一些缺點(diǎn)。GO經(jīng)表面修飾之后，可以避開酶的活性位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)定向固定化酶，減少對(duì)酶活的損失。Bundy等[41]在不同條件下，將T4溶菌酶分別固定在離活性位點(diǎn)近和遠(yuǎn)位置，比較了兩種情況下酶的活性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，定向共價(jià)固定化酶的活性和穩(wěn)定性超過傳統(tǒng)隨機(jī)共價(jià)固定化酶。經(jīng)過嚴(yán)格的凍融三次和化學(xué)變性處理后，位點(diǎn)特異性固定化酶的活性比隨機(jī)固定化酶高50%和73%。酶的定向固定在酶活性和穩(wěn)定性中起著重要作用，通過控制酶的固定化取向，可避免載體與酶活性位點(diǎn)的之間接觸并有效降低固定酶活性位點(diǎn)的空間位阻效應(yīng)，提高酶的活性和穩(wěn)定性。

3 結(jié) 語

固定化酶有效提高了酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率，在眾多工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，有利于酶的工業(yè)化，是酶工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[42]。用GO直接固定溶菌酶，會(huì)導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)的變化，影響酶的催化活性，但通過GO表面的氨基化、生物膠修飾、化學(xué)還原、聚乙二醇化等功能化修飾，可明顯改善其表面的生物相容性，調(diào)控與酶之間的相互作用，減小對(duì)溶菌酶構(gòu)象和活性的影響；通過氧化石墨與天然高分子材料的共混，形成具有生物相容性界面的復(fù)合材料，有效保持了溶菌酶在固定化后的酶活；GO或溶菌酶通過包覆-吸附的方式，可有效避免酶與載體的直接接觸所導(dǎo)致的酶活損失；位點(diǎn)特異性固定避開了酶的活性位點(diǎn)，避免了固定化過程對(duì)酶活性的影響。

GO具有多種優(yōu)良的特性，在食品、生物醫(yī)藥、生物傳感器、紡織品、酶固定等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，未來，要繼續(xù)開發(fā)既能提高酶吸附量，又能提高酶活性的改性GO材料以及GO的復(fù)合材料，進(jìn)一步推進(jìn)GO在固定化酶領(lǐng)域的應(yīng)用。