miR-181b 通過(guò)靶向PTEN 調(diào)控缺血性腦卒中后血管新生的作用和機(jī)制研究

張 燁，莊雪明，王 靜，徐海婷，王忠祥，王詩(shī)波，張 莉，唐廣滿

缺血性腦卒中是腦血管疾病常見(jiàn)類型，也是老年人死亡的常見(jiàn)病因， 主要病理為腦血管灌注不足，導(dǎo)致腦組織局部缺血、壞死，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙。在腦動(dòng)脈阻塞后， 腦梗死恢復(fù)區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，形成新生血管，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[1]。 因此，如何促進(jìn)血管新生成為缺血性腦卒中治療的關(guān)鍵點(diǎn)。 微小RNA（mircoRNA，miRNAs）是一類非編碼RNA，在調(diào)控細(xì)胞各種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。 最近研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 在調(diào)控腦梗死血管新生中扮演著重要角色[2~4]。miR-181b 是最近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA， 在調(diào)控腫瘤、心腦血管疾病中發(fā)揮作用[5，6]。 葛麗等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-181b 在動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)miR-181b 可抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖。 但miR-181b 與缺血性腦卒中后血管新生的關(guān)系尚不清楚。 人張力蛋白同源物基因 （phosphate and tension homology deleted on chromosome 10，PTEN） 是一種與侵襲和血管生成過(guò)程有關(guān)的致癌基因，上調(diào)PTEN 可抑制多種疾病的血管生成[8~10]。 研究發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p可通過(guò)PTEN/肌醇磷脂-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threoninekinase，AKT）通路調(diào)控腦梗死后血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[11]。但miR-181b 是否亦能調(diào)控PTEN 影響血管新生尚不清楚。 筆者研究通過(guò)構(gòu)建大鼠腦缺血模型， 觀察miR-181b 對(duì)大鼠腦組織血管生成的影響， 并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討miR-181b 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

65 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠， 鼠齡10 ～12 周，體質(zhì)量50 ～280 g。 購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（蘇）2018-0008。 動(dòng)物飼養(yǎng)于無(wú)錫恒泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司， 晝夜交替12 h，溫度24 ℃，濕度45%。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20220012）。

1.1.2 細(xì)胞與主要試劑

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 （human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）（上海弘順生物科技有限公司，中國(guó)）。

達(dá)氏修正伊氏培養(yǎng)液/營(yíng)養(yǎng)混合（Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12，DMEM/F-12）、胰酶及青霉素/鏈霉素（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司， 中國(guó)）；miR-NC 質(zhì)粒、miR-181b mimics質(zhì)粒、 野生型 （wild type，WT）-PTEN 載體、 突變型（mutant，MUT）-PTEN 載體及聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）包備的脂質(zhì)體（北京擎科生物有限公司，中國(guó)）；Lipofectamine 2000、CCK-8 （cell counting kit-8）試劑盒及Matrigel 膠（武漢卡諾斯科技有限公司，中國(guó)）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）試劑（武漢華翔科潔生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；熒光素酶報(bào)告試劑盒（艾美捷科技有限公司，中國(guó)）；Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（TAKARA 生物有限公司，日本）；兔抗鼠簇分化抗原34（cluster of differentiation 34，CD34）、山羊抗鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、 兔抗鼠磷酸酯酶-張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）、二抗（北京普魯頓生物科技有限公司，中國(guó)）；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、 藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的二抗及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino 2-phenylindole，DAPI）（北京中杉金橋生物有限公司，中國(guó)）。

1.1.3 儀器

酶標(biāo)儀（南京貝燈醫(yī)療器械有限公司，中國(guó)）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （polymerase chain reaction，PCR）儀（ABI 公司， 美國(guó)）；ZEISS Axio Zoom.V16 蔡司熒光顯微鏡（蔡司，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 動(dòng)物模型制備與分組 隨機(jī)將65 只大鼠分為假手術(shù)組15 只，其余50 只大鼠進(jìn)行建模。50 只大鼠成功建模45 只，成功率90%。將45 只建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、miR-NC 組及miR-181b 組，每組15 只。

使用大腦中動(dòng)脈線栓法進(jìn)行大鼠腦缺血再灌注模型的制備。 具體步驟如下：將SD 大鼠采用乙醚麻醉后，放置于操作臺(tái)上，消毒；解剖出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈；在頸內(nèi)、外動(dòng)脈交匯處用絲線將頸內(nèi)動(dòng)脈掛線阻塞，2 h 后解除絲線； 等待大鼠清醒后采用Zea-Longa 神經(jīng)功能評(píng)分法判斷建模的成功與否（評(píng)分≥2 分提示建模成功，<2 分提示建模失敗）。

1.2.1.2 大鼠治療方法 假手術(shù)組大鼠暴露頸內(nèi)、外動(dòng)脈后不進(jìn)行結(jié)扎， 其他組處理與模型組大鼠一樣。術(shù)后6 h 對(duì)各組大鼠進(jìn)行干預(yù)：miR-NC 組大鼠給予尾靜脈注射PEG-miR-NC（2 mg/kg，1 次/天）；miR-181b組大鼠給予尾靜脈注射PEG-miR-181b（2 mg/kg，1次/天）；模型組、假手術(shù)組大鼠給予尾靜脈注射PEG包備的空載脂質(zhì)體（2 mg/kg，1 次/天）。 所有大鼠治療2 周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.3 大鼠改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分 分別于治療前、治療后14 d，對(duì)大鼠進(jìn)行大鼠改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS），該評(píng)分共包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡木、反射消失或動(dòng)作異常等項(xiàng)目，滿分18 分，分值越高，神經(jīng)系統(tǒng)損傷越重。

1.2.1.4 腦組織TTC 染色 治療14 d 后安樂(lè)死各組大鼠，無(wú)菌下獲取腦組織，于-80 ℃條件下冷凍，制備2 mm 的冰凍切片。 在室溫下使用2，3，5-氯化三苯基四氮唑 （2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染料孵育30 min。 然后將切片在4 ℃條件下用4%多聚甲醛中固定、 保存。 采用Image J 軟件計(jì)算梗死面積（梗死部位呈灰白色）。

1.2.1.5 免疫熒光檢測(cè)腦組織中CD34、VEGF 表達(dá)將各組大鼠腦組織用甲醛溶液浸泡48 h 后， 石蠟包埋，制備切片5 μm；依次通過(guò)二甲苯、梯度酒精脫水，檸檬水高壓修復(fù)抗原，山羊血清室溫封閉1 h后加入CD34（1 ∶200）、VEGF（1 ∶250）一抗4 ℃冰箱過(guò)夜， 其次復(fù)溫后加入對(duì)應(yīng)的二抗室溫避光孵育1 h，洗滌3 次后加入含有DAPI 的封片劑封片；干燥，倒置熒光顯微鏡拍照，用Image J 軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.2.2 體外實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 對(duì)HUVEC 使用DMEM/F-12 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素）。培養(yǎng)條件：體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37°C，待細(xì)胞融合達(dá)到80%時(shí)傳代。 取傳3 代的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用Lipofectamine 2000 將不同物質(zhì)轉(zhuǎn)染至HUVEC， 分為Control 組（正常培養(yǎng)）、miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC 空質(zhì)粒）及miR-181b 組（轉(zhuǎn)染miR-181b mimics 質(zhì)粒）。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 收集各組細(xì)胞及腦組織，加入1 mL Trizol 試劑提取總RNA。 使用miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green 熒光定量試劑盒檢測(cè)miR-181b 表達(dá)水平，U6 為內(nèi)參。 反應(yīng)體系（25 μL）：TB Green Advantage Premix（2X）12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，ROX Dye （50X） 0.5 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 9 μL。 循環(huán)條件：95 ℃5 s，60 ℃20 s，共40 個(gè)循環(huán)。檢測(cè)細(xì)胞、組織miR-181b 表達(dá)水平。相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

miR-181b 上、下游引物：5′-ATGGTTCGTGGGTTCACA-3′，5′-GTGGCTAAGTTCCGACG-3′；U6 上、 下游引物：5′-TACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′，5′-ACACGATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′。

1.2.2.3 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 制備單細(xì)胞懸液，將2×103個(gè)細(xì)胞接種到96 孔板。 培養(yǎng)24 h、48 h及72 h 后加入10 μL CCK-8 溶液，于37 ℃條件下避光培養(yǎng)4 h， 用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的光密度（optical density，OD）值。

1.2.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶消化后，按照每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種到6 孔板， 待細(xì)胞融合達(dá)到80%時(shí)在板底部使用白色槍頭劃線，再磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3 次后，換成無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；然后再光學(xué)顯微鏡下拍照，測(cè)量細(xì)胞間距離。 遷移率（%）=（0 h 細(xì)胞間距離-24 h 時(shí)細(xì)胞間距離）/0 h細(xì)胞間距離×100%。

1.2.2.5 成管實(shí)驗(yàn) 首先把Matrigel 膠與無(wú)血清培養(yǎng)液按照1 ∶2 比例鋪到24 孔板中。 然后將制備好的細(xì)胞懸液，按照3 × 104/孔細(xì)胞接種到板中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后光學(xué)顯微鏡下拍照，任意選取5 個(gè)視野，測(cè)量?jī)?nèi)皮細(xì)胞伸出分支的長(zhǎng)度即為成管長(zhǎng)度。兩個(gè)細(xì)胞之間的連接數(shù)量即為連接數(shù)，細(xì)胞之間形成的網(wǎng)孔即為網(wǎng)孔數(shù)，取平均值。

1.2.2.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 通過(guò)TargetScan 在線網(wǎng)站 （http://www.targetscan.org/） 預(yù)測(cè)miR-181b 與PTEN 的靶向關(guān)系。 將miR-NC 或miR-181b mimics分別與WT-PTEN、MUT-PTEN 載體共轉(zhuǎn)染至HUVEC 細(xì)胞，繼續(xù)孵育48 h 后收集各孔細(xì)胞，裂解各組細(xì)胞并收集上清液，然后按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性。

1.2.2.7 Western blot 檢測(cè) 收集各組細(xì)胞及腦組織，加入細(xì)胞裂解溶液提取總蛋白，于100 ℃煮5 min 后檢測(cè)蛋白濃度及純度。 制備10%分離膠及5%濃縮膠，每孔中加入30 μg 蛋白樣品，在110 V 電壓下將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%無(wú)脂牛奶室溫下封閉1 h，加入PTEN（1 ∶1 000）、β-actin（1 ∶1 000）一抗，4°C 條件下過(guò)夜。 次日將PVDF 膜與二抗室溫下孵育1 h，加入發(fā)光液，曝光，用Image J 分析灰度值，采用目標(biāo)蛋白/β-actin 表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。 檢測(cè)細(xì)胞、組織中PTEN 表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。 計(jì)量資料使用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布時(shí)，多組間行ANOVA 檢驗(yàn)，兩組間使用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1.1 4組大鼠改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

治療前各組大鼠mNSS 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=0.003，P>0.05）。治療14 d 后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠mNSS 升高 （q 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量= 17.420，P＜0.05）； 與miR-NC 組比較，miR-181b 組大鼠mNSS降低（t=14.730，P＜0.05）。 提示造模成功。 見(jiàn)表1。

表1 4 組大鼠mNSS 比較Tab.1 Comparison of mNSS of rats in 4 groups

2.1.2 4組大鼠腦梗死面積比較

與假手術(shù)組（0.08±0.01）比較，模型組大鼠腦梗死面積增加（79.11±9.05。 t=34.000，P＜0.05）。 與miR-NC 組（71.01 ± 7.23）比較，miR-181b 組大鼠腦梗死面積降低（24.12±5.32。t=21.160，P＜0.05）。 見(jiàn)圖1。

圖1 4 組大鼠腦梗死面積比較Fig.1 Comparison of cerebral infarction area of rats in 4 groups

2.1.3 4 組大鼠腦組織中miR-181b 表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組（0.74±0.11）比較，模型組大鼠腦組織中miR-181b 表達(dá)下降（0.14±0.02。t=20.780，P＜0.05）。 與miR-NC 組（0.16±0.03）比較，miR-181b 組大鼠腦組織中miR-181b 表達(dá)升高 （3.02±0.45。 t=24.56，P＜0.05）。

2.1.4 4組大鼠腦組織中CD34、VEGF 蛋白表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組比較， 模型組大鼠腦組織中CD34、VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞率 （45.03 % ± 5.22 % vs 76.11 % ±6.02%、25.06%±5.11%vs 89.43%±8.07%）及蛋白表達(dá)水平（0.25±0.06 vs 0.91±0.09、0.21±0.04 vs 0.89±0.11）下降（t=15.37、26.27、23.63、22.50，P＜0.05）。 與miR-NC 組比較，miR-181b 組大鼠腦組織中CD34、VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞率（68.73%±7.04%vs 43.76%±5.17%、21.43%±5.02%vs 0.23%±0.06%） 及蛋白表達(dá)水平（0.91±0.09 vs 0.86±0.12、0.72±0.09 vs 0.19±0.02）升高（t=11.26、14.88、18.19、22.26，P＜0.05）。 見(jiàn)圖2、3。

圖2 免疫熒光檢測(cè)4 組大鼠腦組織CD34、VEGF 蛋白表達(dá)（50 μm）Fig.2 Diagrams of CD34 and VEGF expression in brain tissue by immunofluorescence in 4 groups(50 μm)

圖3 Western blot 檢測(cè)4 組腦組織CD34、VEGF 表達(dá)電泳圖Fig. 3 Electrophoretograms of CD34 and VEGF expression in brain tissue by Western blot in 4 groups

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 3組細(xì)胞miR-181b 表達(dá)水平

Control 組與miR-NC 組細(xì)胞miR-181b 表達(dá)水平（0.24±0.06、0.25±0.07）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.188，P>0.05）；而miR-181b 組細(xì)胞miR-181b表達(dá)水平（2.31±0.32）高于miR-NC 組（t=10.890，P＜0.05）。

2.2.2 過(guò)表達(dá)miR-181b 對(duì)HUVEC 增殖、遷移的影響

Control 組與miR-NC 組細(xì)胞24 h、48 h 及72 h OD 值、遷移率（0.24±0.03 vs 0.23±0.03、0.34±0.04 vs 0.31 ± 0.03、0.63 ± 0.05 vs 0.58 ± 0.04、0.33 ± 0.04 vs 0.34±0.06）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OD 值：t=0.480、1.414、2.041，P > 0.05。 遷移率：t = 0.480，P > 0.05）。 miR-181b 組細(xì)胞48 h 及72 h OD 值、遷移率高于miR-NC組（0.47±0.05 vs 0.34±0.04、0.99±0.06 vs 0.63±0.05、0.87 ± 0.11 vs 0.34 ± 0.06）（OD 值：t = 6.245、17.29，P＜0.05。 遷移率：t=7.326，P＜0.05）。 見(jiàn)圖4。

圖4 過(guò)表達(dá)miR-181b 對(duì)HUVEC 遷移的影響Fig.4 Diagram of effect of overexpression miR-181b on HUVEC migration

2.2.3 過(guò)表達(dá)miR-181b 對(duì)HUVEC 成管作用的影響

Control 組與miR-NC 組成管長(zhǎng)度（1 234±103 vs 1 253±104）、分支長(zhǎng)度（1 524±111 vs 1 563±109）、連接數(shù)（18±1 vs 19±2）和網(wǎng)孔數(shù)（4±1 vs 5±1）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.225、0.434、0.775、1.519，P>0.05）。 miR-181b 組成管長(zhǎng)度（2 484±105）、分支長(zhǎng)度（1 234±103）、連接數(shù)（53±6）和網(wǎng)孔數(shù)（21±3）高于miR-NC 組 （t = 14.43、14.97、9.311、8.337，P＜0.05）。 見(jiàn)圖5。

圖5 過(guò)表達(dá)miR-181b 對(duì)HUVEC 成管作用的影響Fig.5 Diagrams of effect of overexpression miR-181b on angiogenesis of HUVEC

2.2.4 miR-181b 與PTEN 的靶向關(guān)系

Control 組與miR-NC 組細(xì)胞PTEN 蛋白表達(dá)水平比較（0.43±0.07 vs 0.42±0.08），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =0.163，P>0.05）；而miR-181b 組細(xì)胞PTEN 蛋白表達(dá)水平（0.12±0.02）低于miR-NC 組（t=6.301，P＜0.05）。

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織PTEN 蛋白表達(dá)水平（0.93±0.05 vs 0.31±0.04）升高（t=16.770，P＜0.05）。 與miR-NC 組比較，miR-181b 組大鼠腦組織PTEN 蛋白表達(dá)水平（0.37±0.02 vs 0.96±0.08）降低（t=12.390，P＜0.05）。

miR-181b 與PTEN 核苷酸存在結(jié)合位點(diǎn)。 WTPTEN + miR-181b 組細(xì)胞熒光素酶活性低于WTPTEN + miR-NC 組 （0.21 ± 0.01 vs 1.00 ± 0.01）（t =61.19，P＜0.05）。 這些結(jié)果提示兩者存在靶向調(diào)控關(guān)系。 見(jiàn)圖6。

圖6 3 組細(xì)胞PTEN 蛋白表達(dá)水平電泳圖（A）和miR-181b 與PTEN 基因核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（B）Fig.6 Electrophoretogram of PTEN protein expression level(A)and nucleotide binding site of miR-181b and PTEN(B)in 3 groups

3 討論

缺血性腦卒中是一種全球性疾病，其發(fā)病率和死亡率均較高，目前尚無(wú)有效的治療方法。普遍認(rèn)為，在腦卒中后腦功能的恢復(fù)高度依賴于血液供應(yīng)的有效恢復(fù)[1]。血管生成是一種生理過(guò)程，通過(guò)現(xiàn)有血管的延伸或擴(kuò)展來(lái)形成新的血管。 這一過(guò)程依賴于內(nèi)皮細(xì)胞， 并受到多種血管生成刺激因子和抑制因子的調(diào)控。 miRNAs 是一種約22 nt 的RNA， 通過(guò)與mRNA目標(biāo)的3′非翻譯區(qū) （3′-untranslated region，3′-UTR）結(jié)合，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。 研究表明，miRNAs 在多種缺血性疾病中血管生成的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[12~14]。 然而，血管生成相關(guān)的miRNAs 在血管生成的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

miR-181b 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的miRNA 重要類型，在調(diào)控血管生成中發(fā)揮重要作用。 Wang Y 等[15]發(fā)現(xiàn)miR-181b 促進(jìn)食管癌的血管生成， 而另外研究表明miR-181b 抑制HUVEC 在體外的遷移和管形成[16]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-181b 在缺血性腦卒中動(dòng)物模型及細(xì)胞模型中表達(dá)[17]，但miR-181b 是否參與調(diào)控了缺血性腦卒中血管生成尚不清楚。 筆者研究結(jié)果表明，miR-181b 在腦缺血再灌注模型大鼠腦組織中低表達(dá)，與前面研究結(jié)果一致。 mNSS 是評(píng)價(jià)腦缺血嚴(yán)重程度及治療效果的常用指標(biāo)。 研究結(jié)果顯示，模型大鼠mNSS 明顯降低，說(shuō)明腦缺血再灌注大鼠存在嚴(yán)重的腦缺血損傷，提示造模成功；miR-181b 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒治療后，模型大鼠的mNSS 明顯下降，提示miR-181b上調(diào)改善了腦缺血大鼠的神經(jīng)功能。腦梗死面積是評(píng)價(jià)神經(jīng)元損害最為直接的指標(biāo)。 筆者研究結(jié)果顯示，miR-181b 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒治療后的腦梗死面積顯著下降，提示miR-150 可改善腦缺血梗死面積的增加。 上述結(jié)果證明miR-181b 過(guò)表達(dá)對(duì)腦缺血大鼠具有一定的改善功能。

為進(jìn)一步探索miR-181b 對(duì)腦缺血大鼠腦組織中血管生成的影響， 筆者觀察了腦組織中CD34、VEGF 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-181b 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒治療后的大鼠腦組織高表達(dá)CD34、VEGF。 VEGF 是調(diào)控血管生成的關(guān)鍵因子，與受體結(jié)合后促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移等，促進(jìn)血管新生，改善微循環(huán)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。CD34 是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，其表達(dá)水平與血管數(shù)量成正比。 隨后體外實(shí)驗(yàn)觀察了miR-181b 對(duì)HUVEC 增殖、遷移及成管的影響，結(jié)果表明，上調(diào)miR-181b 可促進(jìn)HUVEC 增殖、遷移及成管，提示miR-181b 過(guò)表達(dá)可促進(jìn)血管新生。

miRNAs 一般與下游的靶基因結(jié)合后發(fā)揮作用，通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-181b 與PTEN mRNA 核苷酸存在結(jié)合位點(diǎn)，提示兩者可能存在調(diào)控關(guān)系。 PTEN 在調(diào)控細(xì)胞侵襲和血管生成中扮演著重要角色[18]。 最近研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNAs 可靶向PTEN調(diào)控缺血性疾病， 如miR-499a 可通過(guò)靶向PTEN 減輕缺血性腦卒中的星形細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[19]。 此外，microRNA-221 通過(guò)調(diào)控PTEN/PI3K/AKT 途徑調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能參與缺血性腦卒中的研究[20]。筆者研究結(jié)果顯示，缺血再灌注大鼠腦組織高表達(dá)PTEN 蛋白，經(jīng)過(guò)miR-181b 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒治療后PTEN 表達(dá)水平明顯降低。 隨后的體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明， 過(guò)表達(dá)miR-181b 的HUVEC 低表達(dá)PTEN， 提示miR-181b與PTEN 存在靶向關(guān)系。最后熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-181b 可負(fù)性調(diào)控PTEN。

但筆者研究也存在一些問(wèn)題需要進(jìn)一步解決。第一，miR-181b 在缺血性腦卒中患者外周血中表達(dá)情況需要進(jìn)一步明確；其次，PTEN 對(duì)HUVEC 功能的影響需要基礎(chǔ)研究探索。

綜上所述，miR-181b 在缺血再灌注損傷大鼠腦組織中低表達(dá)， 上調(diào)miR-181b 可通過(guò)負(fù)性調(diào)控PTEN 促進(jìn)新生血管生成從而保護(hù)腦組織，有望成為缺血性腦卒中的治療靶點(diǎn)。