基因芯片和RNA-seq 聯(lián)合組織芯片分析CLDN8 在乳頭狀腎細(xì)胞癌的表達(dá)及意義

張觀蘭，李建棣，楊藝洲，許靜婕，陳思智，楊小萱，陳 罡，李生華

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，主要有透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）、乳頭狀腎細(xì)胞癌（papillary renal cell carcinoma，PRCC）和嫌色細(xì)胞腎細(xì)胞癌3 個(gè)亞型；其中PRCC 是第二常見(jiàn)的亞型，約占所有腎細(xì)胞癌的10%～15%[1，2]，好發(fā)于60 ～80 歲老年人群，男性患者多見(jiàn)。 有研究表明局限性的PRCC 預(yù)后比ccRCC 的好，但轉(zhuǎn)移的2型PRCC 預(yù)后較轉(zhuǎn)移的ccRCC 差。 由于臨床上以ccRCC 較為常見(jiàn)， 腎癌的臨床研究以ccRCC 為主，PRCC 多數(shù)的診斷與治療模式都來(lái)自于ccRCC 相關(guān)的研究，但PRCC 的獨(dú)特特征可能對(duì)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性PRCC 的診斷和治療有一定影響[3，4]。因此，探索PRCC的相關(guān)特征有一定意義。

Claudin-8（CLDN8）是一種參與構(gòu)成緊密連接的跨膜蛋白， 通過(guò)形成膜內(nèi)原纖維構(gòu)成緊密連接的骨架，其羧基末端的PDZ（postsynaptic density-95/discslarge/zona occludens 1，PSD95-Discs large-ZO1） 結(jié)構(gòu)能與其他緊密連接蛋白分子相互作用，從而固定在緊密連接復(fù)合體上[5]，在維持緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用。 目前，CLDN8 的異常表達(dá)已被證實(shí)與多種腫瘤有關(guān)，如ccRCC、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、乳腺癌等。 研究表明CLDN8 在ccRCC 中為低表達(dá)， 認(rèn)為CLDN8 可通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）通路抑制ccRCC 細(xì)胞進(jìn)行增殖、遷移和侵襲[6]。 CLDN8 在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中低表達(dá)，miR-361-5p 通過(guò)miR-361-5p/CLDN8 軸負(fù)調(diào)控CLDN8 的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，從而抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞死亡[7]。 另外，CLDN8 在乳腺癌中低表達(dá)且與雄激素受體表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，但其在乳腺癌中明確調(diào)控機(jī)制仍有待完善闡明[8]。

目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道CLDN8 在PRCC 中的作用。 筆者擬通過(guò)實(shí)施免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CLDN8蛋白表達(dá)強(qiáng)度， 并收集全球范圍內(nèi)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中PRCC 的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)集， 計(jì)算CLDN8 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)合癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)一步分析CLDN8 表達(dá)在PRCC 中的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Gene Expression Omnibus （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） 數(shù)據(jù)庫(kù)、Sequence Read Archive（https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/） 數(shù)據(jù)庫(kù)和ArrayExpress 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/）集合了全球范圍內(nèi)各研究的基因芯片和高通量測(cè)序數(shù)據(jù)集，是公認(rèn)的生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。 實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)以上數(shù)據(jù)庫(kù)篩選PRCC 的mRNA 數(shù)據(jù)集， 檢索時(shí)間是建庫(kù)至2021年6月1日。

1.2 方法

1.2.1 獲取基因芯片及RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)

檢索Gene Expression Omnibus 數(shù)據(jù)庫(kù)、Sequence Read Archive 數(shù)據(jù)庫(kù)和ArrayExpress 數(shù)據(jù)庫(kù)， 獲取RPCC mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)集。 檢索式為：“papillary renal cell carcinoma”or“PRCC”。

選擇標(biāo)準(zhǔn)：①數(shù)據(jù)集來(lái)源物種是智人；②mRNA測(cè)序； ③同時(shí)具有癌樣本和對(duì)照樣本， 癌樣本為PRCC 組織， 對(duì)照樣本為癌旁組織或正常腎組織，癌樣本、對(duì)照樣本數(shù)目均≥3。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①數(shù)據(jù)集來(lái)源是細(xì)胞系；②經(jīng)過(guò)基因敲除或藥物處理的樣本。

此外，通過(guò)R 包TCGAbiolinks 獲取TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中PRCC 經(jīng)RNA 測(cè)序的計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)集（時(shí)間截至2021年7月12日）。 最后，對(duì)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)集進(jìn)行l(wèi)og2（x+1）歸一化處理，得到6 個(gè)數(shù)據(jù)集用于后續(xù)分析。

1.2.2 組織芯片

通過(guò)免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemical staining，IHC）來(lái)檢測(cè)CLDN8 蛋白在PRCC 的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)使用的組織芯片購(gòu)買自桂林泛譜生物技術(shù)有限公司（中國(guó)），包括15 例PRCC 樣本和16 例非腫瘤樣本。IHC 實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行綜合評(píng)定[9]。 每個(gè)樣本取5 個(gè)高倍鏡視野。

判斷標(biāo)準(zhǔn)如下： ①染色強(qiáng)度記為0、1、2、3 分，分別表示陰性、弱、中、強(qiáng)；②陽(yáng)性細(xì)胞比例為0 記0 分，1%～25%記1 分，26%～50%記2 分，51%～75%記3 分，76%～100%記4 分； ③染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分?jǐn)?shù)值的乘積即為對(duì)應(yīng)視野的最終得分，最后平均5 個(gè)視野的評(píng)分作為該樣本的最終得分。匯總31 個(gè)樣本的最終得分作為第7 個(gè)數(shù)據(jù)集用于下一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 分析方法

通過(guò)GraphPad Prism v8.0.2 軟件（GraphPad Prism version 8.0.2 for Windows，GraphPad Software，San Diego，California USA。www.graphpad.com）進(jìn)行非配對(duì)兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)， 分析CLDN8 在PRCC 組織與非PRCC 組織的表達(dá)差異，繪制散點(diǎn)圖和受試者工作特性（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線獲得真陽(yáng)性數(shù)（true positive，TP）、真陰性數(shù)（true negative，TN）、 假陽(yáng)性數(shù) （false positive，F(xiàn)P）、 假陰性數(shù)（false negative，F(xiàn)N）。

Q 檢驗(yàn)和I2可分別定性、定量進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，若Q 檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.10），表明研究存在統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性；I2≤40%時(shí)異質(zhì)性可忽略不計(jì)；30%≤I2≤60%表明存在一定程度的異質(zhì)性；I2≥50%異質(zhì)性較明顯。 當(dāng)Q 檢驗(yàn)P＜0.10 且I2＞50%時(shí)，合并效應(yīng)量SMD 選用隨機(jī)效應(yīng)模型， 否則采用固定效應(yīng)模型。

通過(guò)Stata v12.0 軟件（StataCorp. 2011. Stata Statistical Software:Release 12）合并標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差（standardized mean difference，SMD）效應(yīng)量，計(jì)算靈敏度、特異度、似然比，繪制匯總受試者工作特性（summary receiver operating characteristic，SROC）曲線及發(fā)表偏倚檢驗(yàn)漏斗圖。 SMD 用于反映CLDN8 在各數(shù)據(jù)集的總體表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片和RNA-seq 數(shù)據(jù)集

最終從公共數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出6 個(gè)數(shù)據(jù)集，包括5 個(gè)基因測(cè)序數(shù)據(jù)集（E-MTAB-1805、GSE7023、GSE11151、GSE15641、GSE26574）和1 個(gè)RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)集（TCGA-KIRP）。 流程見(jiàn)圖1。

圖1 mRNA 數(shù)據(jù)集篩選流程圖Fig.1 Flow chart of mRNA dataset screening

2.2 CLDN8 在乳頭狀腎細(xì)胞癌表達(dá)

根據(jù)非配對(duì)兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)結(jié)果，CLDN8 mRNA 表達(dá)水平在PRCC 組織較非PRCC 組織低（表1）。免疫組織化學(xué)染色后， 在光學(xué)顯微鏡下觀察可見(jiàn)，CLDN8 蛋白定位于細(xì)胞漿， 在PRCC 呈弱陽(yáng)性表達(dá)（圖2）。 CLDN8 蛋白表達(dá)差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。

表1 各數(shù)據(jù)集的病例數(shù)、TP、FP、FN、TNTab.1 Number of cases,TP,FP,FN and TN of each data set

2.3 數(shù)據(jù)異質(zhì)性檢驗(yàn)

Q 檢驗(yàn)結(jié)果顯示P＜0.01，I2為95.4%， 統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性顯著，森林圖采用隨機(jī)效應(yīng)模型。

2.4 CLDN8 表達(dá)水平合并效應(yīng)量SMD

7 個(gè)數(shù)據(jù)集中CLDN8 表達(dá)水平合并效應(yīng)量SMD為－ 6.80，95 % CI － 8.97 ～－ 4.63。 說(shuō)明CLDN8 在PRCC 有顯著低表達(dá)趨勢(shì)（圖3）。

圖3 CLDN8 在PRCC 低表達(dá)的合并標(biāo)SMDFig.3 Pooled SMD of CLDN8 low expression in PRCC

2.5 數(shù)據(jù)偏倚分析和效能分析

Deeks’漏斗圖（P = 0.15，圖4A）和Egger’s 漏斗圖（P=0.231，圖4B）提示發(fā)表偏倚不顯著。 SROC 曲線下面積（area unde curve，AUC）趨近于1.00（95%CI 0.99 ～1.00）， 表明CLDN8 對(duì)于PRCC 具有較高的判斷效能，靈敏度為0.99（95%CI 0.93 ～1.00），特異度為0.99（95%CI 0.83 ～1.00），陽(yáng)性似然比為103.39（95 % CI 5.16 ～2 069.90），陰性似然比為0.01（95%CI 0.00 ～0.08）（圖5、6）。 CLDN8 的表達(dá)量與患者的臨床病理特征無(wú)明顯關(guān)聯(lián)（表2）。

表2 CLDN8 mRNA 表達(dá)水平與PRCC 臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between CLDN8 mRNA status and PRCC clinical pathologic features

圖4 CLDN8 數(shù)據(jù)集Deeks’ 漏斗圖（A）和Egger’s 漏斗圖（B）發(fā)表偏倚檢驗(yàn)Fig.4 Funnel plots of Deeks’(A)and Egger’s(B)publication bias tests for CLDN8 dataset

圖5 CLDN8 的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)Fig.5 Diagrams of diagnostic test evaluation of CLDN8

3 討論

PRCC 發(fā)病率僅次于ccRCC[2，10]。 隨著二代測(cè)序技術(shù)和分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展， 越來(lái)越多的研究投入到生物學(xué)標(biāo)志物和分子靶向治療中， 以提高臨床診治疾病的效率。 特別地，腎癌是一組具有不同組織學(xué)類型、分子和基因突變的高異質(zhì)性腫瘤，因此為臨床個(gè)體化治療尋找有效的生物學(xué)標(biāo)志物是迫切需要的， 也符合精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展方向[1，11]。 Claudins 是一種參與構(gòu)成緊密連接的跨膜蛋白[5]，具有柵欄、分子信號(hào)傳導(dǎo)和屏障功能。 近年來(lái)，有研究報(bào)道Claudins 蛋白可通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)參與腫瘤發(fā)生過(guò)程，也與炎癥應(yīng)答、細(xì)胞惡性增生、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[12]。CLDN8 作為Claudins 蛋白家族的一員，也以相似的途徑參與著惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，但其在PRCC 中的作用并未闡明。筆者通過(guò)收集大樣本測(cè)序數(shù)據(jù)集和開(kāi)展免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)，分別從轉(zhuǎn)錄組水平和蛋白質(zhì)水平分析了CLDN8 在PRCC 中的表達(dá)水平， 得出了CLDN8 在PRCC 顯著低表達(dá)的結(jié)論。

共485 例PRCC 樣本和95 例對(duì)照樣本的mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)用于檢測(cè)CLDN8 在轉(zhuǎn)錄組水平的表達(dá)差異，15 例PRCC 樣本與16 例對(duì)照樣本用于CLDN8蛋白表達(dá)驗(yàn)證。mRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)集和組織芯片的結(jié)果均表明CLDN8 在PRCC 具有極顯著下調(diào)趨勢(shì) （P＜0.000 1）。 SROC 曲線提示CLDN8 具有較高的判斷效能，發(fā)表偏倚不顯著。 在筆者研究中，CLDN8 低表達(dá)與患者性別、年齡、種族、腫瘤分期均無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。 由此提出CLDN8 在PRCC 異常下調(diào)現(xiàn)象， 并有可能在PRCC 的發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮一定的促進(jìn)作用。

已有研究證明CLDN8 異常表達(dá)與多種惡性腫瘤相關(guān)，CLDN8 在ccRCC 中為低表達(dá)， 可通過(guò)EMT 和PKB 通路抑制ccRCC 細(xì)胞進(jìn)行增殖、 遷移和侵襲[6]。在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，miR-361-5p 通過(guò)靶向抑制CLDN8 的表達(dá)可起視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制作用[7]，在乳腺癌中CLDN8 也為低表達(dá)且與雄激素受體表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系[8]。另外，CLDN8 很有可能是KMT2C 在前列腺癌發(fā)揮致癌作用的下游基因[13]。 筆者研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組水平和蛋白水平證實(shí)了CLDN8 在PRCC 也呈現(xiàn)異常低表達(dá)的趨勢(shì)，其具體機(jī)制未知。筆者提出，CLDN8下調(diào)可能與PRCC 的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

當(dāng)然， 筆者研究也存在一定的局限性， 如納入mRNA 數(shù)據(jù)集和臨床病理樣本數(shù)不多、異質(zhì)性來(lái)源不清楚、 沒(méi)有明確揭示CLDN8 參與PRCC 的機(jī)制。 因此， 還有賴于更多的研究來(lái)揭示CLDN8 在PRCC 異常低表達(dá)的分子機(jī)制。

（致謝： 感謝廣西醫(yī)學(xué)病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供計(jì)算病理學(xué)及臨床病理學(xué)技術(shù)支持）