基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討狼毒大戟治療肺癌的作用機制

孫悅 封佳欣 何旭 陳美華 臧皓 金莉莉

(1.延邊大學(xué) 藥學(xué)院,吉林 延吉 133002;2.通化師范學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院,吉林 通化 134002)

0 引言

肺癌(lung cancer)是常見的癌癥之一.目前,肺癌主要分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩類[1].近年來一些學(xué)者對狼毒大戟(Euphorbiafischeriana)進行了研究,發(fā)現(xiàn)其含有二萜、三萜、黃酮、香豆素、類固醇、酚酸等241種成分[2-4],其中二萜類成分對治療乳腺癌[5-6]、前列腺癌[7-8]、肝癌[9]以及肺癌[10-13]等具有很好的療效.2008年,Yan等[14]研究發(fā)現(xiàn),狼毒大戟中的成分17-acetoxyjolkinolide B(結(jié)構(gòu)式見圖1)可有效抑制NF-κB 信號通路;2009年,Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn),狼毒大戟中的成分ingenol 3-myristinate 和ingenol 3-palmitate(結(jié)構(gòu)式見圖1)對肺癌A549細胞具有明顯的抑制作用,同時發(fā)現(xiàn)17-hydroxyjolkinolide B(結(jié)構(gòu)式見圖1)可通過抑制STAT3 信號通路治療肺癌.為了進一步探討狼毒大戟治療肺癌的療效及其作用機制,本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對狼毒大戟治療肺癌的作用機制進行了探討,以期為利用狼毒大戟治療肺癌提供理論依據(jù)和研究方向.

1 研究流程

1.1 潛在活性成分的篩選及其靶點預(yù)測

為了得到狼毒大戟抗肺癌的潛在活性成分及其靶點,本文首先利用Chemdraw 畫出其2D結(jié)構(gòu);然后將得到的2D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissADME(http://www.swissadme.ch/)中,并以胃腸道吸收為“high”和類藥性中至少有2個“yes”為標(biāo)準(zhǔn)對狼毒大戟的化學(xué)成分進行篩選,以此得到具有類藥性高和能夠被胃腸道吸收的潛在活性成分;最后利用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫對上述狼毒大戟的潛在活性成分進行靶點預(yù)測,并在預(yù)測結(jié)果中選取可能性≥0.1的靶點作為狼毒大戟的潛在活性成分靶點.

1.2 肺癌疾病靶點的收集

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、Therapeutic Target Database(TTD)藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(https://db.idrblab.net/ttd/)和Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)中的藥物數(shù)據(jù)和藥物目標(biāo)信息對肺癌疾病靶點進行預(yù)測.預(yù)測時首先以“l(fā)ung cancer”為關(guān)鍵詞進行檢索,然后將檢索得到的肺癌疾病靶點進行合并和去除重復(fù)項,由此即得肺癌疾病靶點.

1.3 潛在活性成分靶點與肺癌疾病靶點的交集靶點的預(yù)測

將狼毒大戟的潛在活性成分靶點和肺癌疾病靶點輸入到Venny2.1.0 在線平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)中,由此可得到兩者的韋恩圖.在韋恩圖中,潛在活性成分靶點與肺癌疾病靶點的相交部分即為潛在活性成分與肺癌疾病的交集靶點,這些交集靶點即可認(rèn)為是狼毒大戟治療肺癌的潛在靶點.

1.4 “藥物-潛在活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心活性成分的篩選

首先用狼毒大戟的潛在活性成分和交集靶點建立兩者的“網(wǎng)絡(luò)”和“類型”文件,然后將所得的文件導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件中構(gòu)建狼毒大戟治療肺癌的“藥物-潛在活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò),最后對該網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)鋵W(xué)分析即可得到狼毒大戟治療肺癌的潛在活性成分.將所得結(jié)果按自由度值進行大小排序,并將排名前10的潛在活性成分作為狼毒大戟治療肺癌的核心活性成分[16].

1.5 蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和核心靶點的篩選

構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的方法:將潛在活性成分與肺癌疾病的交集靶點導(dǎo)入到STRING v11.5數(shù)據(jù)平臺(https://cn.string-db.org/)中后,通過檢索即可得到PPI網(wǎng)絡(luò).檢索條件為:以“智人”為限定物種,置信度分?jǐn)?shù)為0.4,其他參數(shù)為默認(rèn)值.

核心靶點的篩選方法:首先將構(gòu)建好的PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入到Cytoscape中;然后利用CytoNCA插件計算PPI網(wǎng)絡(luò)的自由度、接近中心性(closeness centrality)和介度中心性(betweeness centrality),并同時篩選出大于其各自平均值的靶點;最后按自由度值的大小進行排序,并將排名前10的靶點作為狼毒大戟治療肺癌的核心靶點[17].

1.6 GO 富集 和KEGG 富集分析

Metascape數(shù)據(jù)庫是一個數(shù)據(jù)豐富且可對基因功能進行注釋的數(shù)據(jù)庫,因此本研究利用其對交集靶點進行GO(gene ontology)和KEGG(kyoto encylopaedia of genes and genomes)富集分析,以此獲取交集靶點的生物信息以及分析狼毒大戟治療肺癌的潛在作用通路.為了便于對富集分析的結(jié)果進行分析,本文對富集分析的結(jié)果進行了可視化,即利用微生信(bioinformatics)在線作圖平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)對P值最小的10個富集分析結(jié)果進行了作圖.

1.7 狼毒大戟對肺癌相關(guān)靶點的分子對接驗證

首先,在PPI網(wǎng)絡(luò)中將自由度值排名前5的核心靶點TP53(5o1f)、TNF(7jra)、EGFR(5ug9)、STAT3(6njs)和MAPK3(6ges)作為分子對接的受體;然后,在藥物-潛在活性成分-交集靶點中將自由度值排名前5 的核心活性成分[araucarone(LD11,d=35)、ent-13S-hydroxy-16-atisene-3,14-dione(LD14,d=33)、ent-3β-(13S)-dihydroxyatis-16-en-14-one(LD8,d=31)、ent-(13S)-13-hydroxyatis-16-ene-3,14-dione(LD18,d=31)、caudicifolin(LD12,d=30)]和4個已被證明具有抗肺癌活性的化學(xué)成分[17-acetoxyjolkinolide B(LD6,d=25)、ingenol 3-myristinate(LD36)、ingenol3-palmitate(LD37)和17-hydroxyjolkinolide B(LD39)]作為分子對接的配體;最后,將上述得到的潛在活性成分的2D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到Chem3D 中進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,由此得到能量最小的3D 結(jié)構(gòu).本文利用AutoDockVina1.1.2軟件對配體和受體進行分子對接.在進行分子對接操作時,首先在AutoDockTool中對配體和受體進行去水和加氫等操作,然后設(shè)置對接grid參數(shù)(LD6-TP53(centerx=115.577,centery=87.131,centerz=-30.174;sizex=74.0,sizey=62.0,sizez=52.0);LD36-EGFR(centerx=-2.109,centery=18.808,centerz=-25.616;sizex=44.0,sizey=50.0,sizez=60.0);LD37-EGFR(centerx=-2.109,centery=18.808,centerz=-25.616;sizex=44.0,sizey=50.0,sizez=60.0);LD39-MAPK3(centerx=46.391,centery=4.48,centerz=-8.116;sizex=87.0,sizey=68.0,sizez=102.0);對接次數(shù)為10次),最后運行Vina進行分子對接.為了更直觀地展示配體和受體的結(jié)合情況,本文采用Pymol軟件將對接結(jié)果進行了可視化(以3D 圖的形式).

1.8 操作流程

本研究的具體操作流程見圖2.

圖2 研究狼毒大戟治療肺癌作用機制的流程圖

2 結(jié)果與分析

2.1 潛在活性成分的篩選和靶點的預(yù)測結(jié)果

利用SwissADME數(shù)據(jù)庫對已分離出的狼毒大戟中的化學(xué)成分進行篩選后得到38個潛在活性成分,見表1.利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫對狼毒大戟的潛在活性成分靶點進行預(yù)測,由此共得到1493個靶點.

表1 狼毒大戟的潛在活性成分

2.2 肺癌疾病靶點的收集結(jié)果

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫、TTD 藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫和Drugbank數(shù)據(jù)庫檢索肺癌疾病靶點,對所得的靶點進行去重后共得到1561個靶點.

2.3 交集靶點的預(yù)測結(jié)果

將去重后的419 個潛在活性成分靶點與1561 個肺癌疾病靶點進行韋恩分析后獲得了139個交集靶點(占潛在活性成分靶點和疾病靶點總數(shù)的7.6%),如圖3所示.

圖3 狼毒大戟的潛在活性成分靶點與肺癌疾病靶點的韋恩圖

2.4 “藥物-潛在活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

利用Cytoscape,以139個肺癌靶基因(作為抗癌靶點)和38個狼毒大戟的潛在活性成分(作為狼毒大戟抗肺癌的潛在活性成分)構(gòu)建“藥物-潛在活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果如圖4所示.圖4中:綠色代表狼毒大戟,粉色代表狼毒大戟的潛在活性成分,紫色代表交集靶點;節(jié)點體積越大,表示自由度值越大,即其在治療肺癌中的作用越大.由圖4 可見,圖中共有176 個節(jié)點,576條相互作用的邊.由該網(wǎng)絡(luò)可知,狼毒大戟治療肺癌的核心活性成分為LD11(d=35)、LD14(d=33)、LD18(d=31)、LD8(d=31)、LD12(d=30)、LD10(d=27)、LD16(d=26)、LD20(d=26)、LD6(d=25)和LD9(d=25).

圖4 “藥物-潛在活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果

首先將139個交集靶點導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù)庫中,以此獲取肺癌疾病的蛋白互作信息和構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖.為了更直觀地展示PPI網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果,本文利用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)圖進行了篩選和優(yōu)化,并將蛋白按自由度值從大到小進行了排序(見圖5).由圖5可見,PPI網(wǎng)絡(luò)圖中含有139個相互作用的節(jié)點,2074條相互作用的邊,平均節(jié)點度為29.8.由圖5得出的核心靶點見表2.

表2 核心靶點的名稱及其相關(guān)信息

圖5 按自由度值大小排列的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO 富集和KEGG 富集的分析結(jié)果

GO 富集包括生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3部分.對潛在活性成分與肺癌疾病的交集靶點進行GO 富集分析顯示:BP共有1684個條目(P<0.05),主要涉及蛋白磷酸化、對激素反應(yīng)、細胞遷移的正調(diào)節(jié)等;CC共有78個條目(P<0.05),主要涉及薄膜筏、膜微區(qū)部分等;MF共有161個條目(P<0.05),主要涉及蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性等.圖6為對狼毒大戟進行GO 富集分析得到的三合一柱狀圖.由圖6可以看出,狼毒大戟可通過調(diào)控多種生物學(xué)過程來發(fā)揮其治療肺癌的作用.對潛在活性成分與肺癌疾病的交集靶點進行KEGG 富集分析顯示,其共有182條KEGG 條目(P<0.05).圖7為對狼毒大戟進行KEGG 富集分析得到的氣泡圖(圖中的圓點越大,表示在通路上富集的靶點越多;圖中的圓點越紅,表示P值越小).由圖7可知,交集靶點主要富集在癌癥通路、AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路以及癌細胞的蛋白聚糖的表達上.

圖6 GO 富集分析的三合一柱狀圖

圖7 KEGG 富集分析的氣泡圖

2.7 肺癌相關(guān)靶點的分子對接結(jié)果的驗證

研究[18-19]表明,結(jié)合能越低表明配體-受體的結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定.圖8為核心活性成分與靶點分子對接的結(jié)合能圖(圖中的顏色塊越紅,表示結(jié)合能的值越小,即結(jié)合效果越好).由圖8可以看出,根據(jù)分子對接所選取的核心活性成分與核心靶點的結(jié)合能均小于-5.0kJ/mol,由此說明這些成分與靶點形成了良好的對接.

圖8 核心活性成分與靶點分子對接的結(jié)合能圖

由圖9 可以看出,LD12-TP53 中的LD12與TP53中的MET793和CYS797,LD39-TP53中的LD39 與TP53 中 的THR-256、ARG267、SER99,LD39-MAPK3中的LD39與MAPK3中的ALA369和PRO315,LD39-STAT3中的LD39與STAT3中的ALA241和ASN485,LD39-EGFR中 的LD39 與EGFR 中 的ALA722、ASN842、ARG841,LD39-TNF 中 的LD39 與TNF 中 的PRO176、GLU192都各形成了1條氫鍵.由此進一步表明,狼毒大戟的核心活性成分與核心靶點形成了良好的對接.

圖9 肺癌靶點分子對接的3D 圖(A 為LD12-EGFR;B為LD39-TP53;C 為LD39-TNF;D 為LD39-EGFR;E為LD39-STAT3;F為LD39-MAPK3)

研究表明:TP53為抑癌基因[20-21],且其高表達對癌基因BIRC5 具有明顯的抑制作用[22];TNF-α可促進Th9細胞的生長(Th9具有抗腫瘤的作用)[23-24];EGFR 可通過IL-6/STAT3信號通路對肺癌細胞的增殖和凋亡產(chǎn)生影響[25-26];STAT3對肺癌具有明顯的抑制作用[27-28].在圖8中,由于LD12與EGFR 的結(jié)合能最低(為-36.8 kJ/mol),因此可推測狼毒大戟極有可能通過影響IL-6/STAT3信號通路發(fā)揮其抗肺癌活性.

3 結(jié)論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討了狼毒大戟治療肺癌的作用機制,研究結(jié)果表明:狼毒大戟的抗癌作用主要是通過其araucarone、ent-13S-hydroxy-16-atisene-3,14-dione、ent-3β-(13S)-dihydroxyatis-16-en-14-one、ent-(13S)-13-hydroxyatis-16-ene-3,14-dione和caudicifolin等核心活性成分與TP53、TNF、EGFR、STAT3、MAPK3等靶點共同作用(通過調(diào)節(jié)癌癥通路、AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路以及抑制癌細胞的蛋白聚糖的表達)來實現(xiàn)的.本研究可為后續(xù)深入研究狼毒大戟在肺癌治療中的應(yīng)用提供良好參考.但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)存在一定的局限性,所以在今后的研究中我們將通過實驗對其作用機制做進一步探討.