基于低分子量PEI的不同疏水鏈修飾的梳狀低聚物基因載體

荀苗苗, 袁長(zhǎng)春*, 傅凱, 張海燕, 馬文兵, 王志強(qiáng), 李志春

(1.中北大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院, 太原 030051; 2.中北大學(xué)德州產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院, 德州 253034)

對(duì)于構(gòu)成人類健康威脅的癌癥,傳統(tǒng)的治療手段都有一定的缺陷[1-4]?；蛑委煘橐环N新型手段,將基因傳輸?shù)教囟?xì)胞,通過(guò)促進(jìn)或抑制目的蛋白表達(dá)而治療人類疾病[5-7]。在基因治療中,基因載體是其能否進(jìn)入臨床應(yīng)用的關(guān)鍵[8]。

基因載體分為病毒載體和非病毒載體,病毒載體存在著免疫原性和病毒重組等危險(xiǎn),而且基因組容量有限。與之相比,非病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率有限,但其無(wú)傳染性、化學(xué)結(jié)構(gòu)可調(diào)控以及可大量制備等優(yōu)點(diǎn),使其越來(lái)越受到研究者們的關(guān)注[9-10]。陽(yáng)離子聚合物是近年來(lái)非病毒基因載體領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),且聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)已成為研究多、發(fā)展快、非常有潛力的陽(yáng)離子聚合物之一[11]。PEI分子量為600 Da～1 600 kDa,低分子量PEI細(xì)胞毒性較低,但其轉(zhuǎn)染效率也低;高分子量PEI轉(zhuǎn)染效率高,但其細(xì)胞毒性也較高,從而影響了PEI作為基因載體的性能[12],這就需要對(duì)它們進(jìn)行不同修飾。

理想的基因載體需要使復(fù)合物到達(dá)目標(biāo)位的同時(shí)又能迅速降解,使其有效釋放基因而高效表達(dá)。因此,降解型聚合物是目前基因載體研究的熱點(diǎn)之一[13]。例如,Ghodke等[14]采用由聚乙二醇(PEG)和癸二酸(SA)組成的生物可降解線性脂肪族聚酯及β-環(huán)糊精(β-CD)制備的聚輪烷(PRTx+)作為陽(yáng)離子聚合載體,其具有生物安全性,且與商業(yè)轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine 3000相當(dāng)。Lin等[15]研究了利用生物可降解的帶電荷聚酯載體BCPVs傳遞siRNA。能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng),增強(qiáng)細(xì)胞凋亡作用,且未觀察到BCPV的顯著體內(nèi)毒性。

疏水性修飾可以提高復(fù)合物與膜的融合作用,從而增加細(xì)胞內(nèi)吞,進(jìn)而提高轉(zhuǎn)染效率。另外,疏水修飾還可以增加載體包裹DNA的能力。因此,疏水性修飾聚合物也是一個(gè)研究熱點(diǎn)。Chiper等[16]將疏水性水楊酰胺修飾PEI 1.8 kDa,得到的PEI-水楊酰胺能夠有效地包裹DNA和RNA,同時(shí)能使核酸進(jìn)入細(xì)胞后有效進(jìn)行釋放,結(jié)果表明,PEI-水楊酰胺可以作為很好的核酸載體。Zhang等[17]通過(guò)α-氨基酸N-羧酸酐(NCA)開(kāi)環(huán)聚合,合成了不同長(zhǎng)度的疏水聚(L-亮氨酸)鏈的兩親性多肽,這些材料與PEI 25 kDa相比具有良好的轉(zhuǎn)染效率,但其細(xì)胞毒性不顯著。

Xun等18]研究了一系列基于低分子量PEI的生物可降解脂質(zhì)體聚合物。為了達(dá)到與文獻(xiàn)[18]同樣或更好的效果,又為了避免文獻(xiàn)[18]中疏水橋連和生物可降解酯鍵橋連比例的篩選,以及它們最終聚合物中兩種橋連(疏水和酯鍵)比例的計(jì)算?，F(xiàn)使疏水基團(tuán)與酯鍵處于同一聚酯中,通過(guò)采用Michael加成反應(yīng)將低分子量PEI 600 Da接枝于此疏水性可降解聚酯上形成梳狀低聚物用于基因載體。在文中,通過(guò)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)來(lái)研究這些低聚物對(duì)DNA的包裹能力,并通過(guò)綠色熒光蛋白實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定部分低聚物/DNA復(fù)合物在不同細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)本研究,在分子量相近的情況下,探索出不同疏水鏈的鏈長(zhǎng)度對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率的影響。

1 結(jié)果與討論

1.1 目標(biāo)脂質(zhì)體聚合物的合成與表征

如圖1所示,將反丁烯二酸與疏水橋聯(lián)化合物1按物質(zhì)的量之比為1∶1混合于無(wú)水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中,以TBAS(癸二酸雙(四正丁基)胺)[19]為催化劑,在100 ℃下通過(guò)環(huán)氧開(kāi)環(huán)反應(yīng)72 h生成疏水聚酯2。而對(duì)于目標(biāo)聚合物的合成,則是在45 ℃條件下,疏水聚酯2與PEI 600 Da以物質(zhì)的量之比為1∶1在無(wú)水二氯甲烷中回流72 h得到聚合物3。粗產(chǎn)物以甲醇為良溶劑,無(wú)水乙醚為不良溶劑沉淀3次來(lái)確保聚合物的分散度。采用凝膠滲透色譜(GPC)對(duì)聚合物3進(jìn)行了分子量的測(cè)定,結(jié)果如表1所示,可以清楚地看到,這些聚合物的分子量都不高,只能稱為低聚物,這可能是由于疏水鏈的空間位阻太大引起的。作者準(zhǔn)備在后續(xù)研究中先選定三種不同鏈長(zhǎng)的低聚物,研究其與DNA復(fù)合物在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染情況。

表1 聚合物3的分子量

圖1 脂質(zhì)體聚合物3的合成路線Fig.1 Synthetic route of liposome polymer 3

1.2 脂質(zhì)體低聚物3的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

作為陽(yáng)離子基因載體,首先必須能與DNA靜電相互作用形成納米復(fù)合物。為了研究所合成的脂質(zhì)體低聚物與DNA的靜電相互作用,首先采用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究,結(jié)果如圖2所示,相比于對(duì)照組PEI 600 Da/DNA復(fù)合物[圖2(a)]在二者質(zhì)量比大于3.2時(shí)才能完全抑制質(zhì)粒DNA的遷移來(lái)說(shuō),脂質(zhì)體低聚物3[圖2(b)～圖2(j)]在質(zhì)量比大于1.6時(shí)就能夠完全包裹質(zhì)粒DNA,說(shuō)明所合成的脂質(zhì)體低聚物能更好地包裹DNA,從而更加有利于復(fù)合物與細(xì)胞膜的靜電相互作用而被細(xì)胞內(nèi)吞。

1.3 脂質(zhì)體低聚物3/DNA復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

為了能直觀地觀察表達(dá)了的pEGFP-Nl報(bào)告基因的細(xì)胞,采用熒光顯微鏡觀察了低聚物(L6-PEI,L12-PEI,L-oleoyl-PEI)/DNA復(fù)合物在HEK 293和7402細(xì)胞中的綠色熒光蛋白表達(dá),其中“黃金標(biāo)準(zhǔn)”的PEI 25 kDa(質(zhì)量比為1.4,氮磷比為10)作為平行對(duì)照。結(jié)果如圖3所示,無(wú)論是在HEK 293細(xì)胞還是7402細(xì)胞,(L6-PEI和L12-PEI)/DNA復(fù)合物都觀察不到轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,L-oleoyl-PEI/DNA復(fù)合物在HEK 293細(xì)胞中,只有質(zhì)量比為6.4[圖3(b)]時(shí)有少量轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,但轉(zhuǎn)染細(xì)胞的密度遠(yuǎn)少于標(biāo)準(zhǔn)PEI 25 kDa。L-oleoyl-PEI/DNA復(fù)合物在7402細(xì)胞中有轉(zhuǎn)染,且在質(zhì)量比為6.4[圖3(e)]時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞密度與PEI 25 kDa相當(dāng),然而本實(shí)驗(yàn)使用材料為低聚物且含有可降解酯鍵,會(huì)比標(biāo)準(zhǔn)PEI 25 kDa細(xì)胞毒性低。因此,推測(cè)此類油酸修飾后的脂質(zhì)體低聚物有可能作為非病毒基因載體。

圖3 L-oleoyl-PEI/DNA復(fù)合物在HEK 293和7402細(xì)胞中的無(wú)血清綠色熒光蛋白表達(dá)Fig.3 Fluorescence microscope images of pEGFP-transfected for L-oleoyl-PEI/DNA complex in HEK 293 and 7402 cells in the absence of 10% serum

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)所用試劑及來(lái)源見(jiàn)表2。

表2 所用試劑的名稱及來(lái)源

核磁:Bruker AV 400 MHz核磁共振波譜儀(1H:400 MHz,0.5% TMS為內(nèi)標(biāo));溶劑殘余峰校準(zhǔn)化學(xué)位移:CDCl3:1H NMR=7.26;氫譜分析縮略詞:s表示單峰;d表示雙峰;t表示三重峰;m表示多重峰;耦合常數(shù)(J)單位為赫茲(Hz);瓊脂糖凝膠水平電泳儀:美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn);全自動(dòng)凝膠成像分析儀:美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn);恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,超凈工作臺(tái):美國(guó)Thermo公司生產(chǎn);恒溫?fù)u床:上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司生產(chǎn);倒置熒光顯微鏡:Nikon Eclipse TE 2000E型儀器。

2.2 疏水聚酯2的制備

反丁烯二酸(2.0 mmol)與疏水環(huán)氧橋連化合物[18](2.0 mmol)混合于無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,加(0.012 mmol)TBAS[19]作為催化劑,在100 ℃下通過(guò)環(huán)氧開(kāi)環(huán)反應(yīng)72 h生成疏水聚酯2的粗產(chǎn)物,用氯仿做良溶劑,甲醇做不良溶劑沉淀3次,干燥后得到目標(biāo)聚酯。

2a(產(chǎn)率23.93%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.94～6.71 (m, 2H, — O2CCHCHCO2), 4.34～4.11 (m, 2H), 4.02 (s, 1H), 3.87～3.78 (m, 1H), 3.69～3.46 (m, 15H), 3.32 (m, 1H), 2.42～2.22(m, 2H, R—H), 1.67～1.53(m, 2H, R—H),1.36～1.23 (m, 4H, R—H), 0.90～0.87 (m, 3H, R—H)。

2b(產(chǎn)率19.26%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.99～6.66 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 4.31～4.13 (m, 2H), 4.02 (s, 1H), 3.81 (s, 1H), 3.70～3.45 (m, 15H), 3.35～3.24 (m, 1H), 2.37～2.25 (m, 2H, R—H), 1.65～1.49 (m, 2H, R—H), 1.36～1.17 (m, 8H, R—H), 0.92～0.85 (m, 3H, R—H)。

2c(產(chǎn)率23.14%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.96～6.59 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 4.37～4.10 (m, 2H), 4.02 (s, 1H), 3.81 (s, 1H), 3.67～3.40 (m, 15H), 3.36～3.23 (m, 1H), 2.37～2.24 (m, 2H, R—H), 1.58 (s, 2H, R—H),1.33～1.20 (m, 12H, R—H), 0.88～0.85 (m, 3H, R—H)。

2d(產(chǎn)率23.20%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.95～6.62 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 4.39～4.12 (m,2H), 4.03 (s, 1H), 3.87～3.78 (m, 1H), 3.68～3.42 (m, 15H), 3.35～3.25 (m, 1H), 2.38～2.25 (m, 2H, R—H), 1.59 (s, 2H, R—H), 1.35～1.18 (m, 16H, R—H), 0.88～0.85 (m, 3H, R—H)。

2e(產(chǎn)率22.97%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.96～6.69 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 4.32～4.15 (m, 2H), 4.04 (s, 1H), 3.81 (s, 1H), 3.70～3.43 (m, 15H), 3.36～3.26 (m, 1H), 2.37～2.25 (m, 2H, R—H), 1.58(s, 2H, R—H), 1.32～1.20 (m, 20H, R—H), 0.88～0.85 (m, 3H, R—H)。

2f(產(chǎn)率23.27%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.97～6.62 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 4.42～4.13 (m, 2H), 4.04 (s, 1H), 3.89～3.76 (m, 1H), 3.77～3.44 (m, 15H), 3.37～3.27 (m, 1H), 2.32 (s, 2H, R—H), 1.59 (s, 2H, R—H), 1.32～1.22 (m, 24H, R—H), 0.89～0.86 (m, 3H, R—H)。

2g(產(chǎn)率23.42%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.98～6.70 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 4.33～4.17 (m, 2H), 4.04 (s, 1H), 3.88～3.80 (m, 1H), 3.69～3.45 (m, 15H), 3.39～3.31 (m, 1H), 2.33 (s, 2H, R—H), 1.59 (s, 2H, R—H), 1.36～1.19 (m, 28H, R—H), 0.89～0.86 (m, 3H, R—H)。

2h(產(chǎn)率23.17%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.95～6.69 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 5.40～5.30 (m, 2H, R—H), 4.31～4.15 (d,J=17.5 Hz, 2H), 4.03 (s, 1H), 3.83 (s, 1H), 3.66～3.49 (m, 15H), 3.38～3.27 (m, 1H), 2.39～2.25 (s, 2H, R—H), 2.08～1.91 (m, 4H, R—H), 1.58 (s, 2H, R—H), 1.36～1.17 (m, 20H, R—H), 0.88～0.85 (m, 3H, R—H)。

2i(產(chǎn)率22.91%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.94～6.68 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 5.40～5.28 (m, 4H, R—H), 4.33～4.15 (m, 3H), 4.04 (s, 1H), 3.86～3.80 (m, 1H), 3.69～3.40 (m, 15H), 3.35～3.25 (m, 1H), 2.78～2.74 (m, 2H, R—H), 2.37～2.26 (s, 2H, R—H), 2.06～2.01 (m, 4H, R—H), 1.59 (s, 2H, R—H), 1.34～1.26 (m, 14H, R—H), 0.90～0.86 (m, 3H, R—H)。

2.3 目標(biāo)脂質(zhì)體聚合物3的制備

PEI 600(0.38 mmol)和疏水聚酯2(0.38 mmol)溶解在1.0 mL無(wú)水二氯甲烷中,在N2氛圍下,45 ℃下反應(yīng)72 h。反應(yīng)完成后,粗產(chǎn)物溶于少量無(wú)水甲醇,用無(wú)水乙醚沉淀三次得到目標(biāo)聚合物3,所收集到的產(chǎn)品經(jīng)干燥后得無(wú)色黏稠液體。聚合物的分子量由凝膠滲透色譜(GPC)測(cè)量得到。

L6-PEI(產(chǎn)率13.20%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.85～3,78 (m, 2H), 3.68～3.40 (m, 19H), 2.88～2.41 (m, 56H, PEI600—H), 2.35～2.30 (m, 2H, R—H), 1.65～1.56 (m, 2H, R—H),1.37～1.26 (m, 4H, R—H), 0.89 (t,J=6.9 Hz, 3H, R—H)。

L8-PEI(產(chǎn)率 10.14%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.79 (s, 2H), 3.61～3.50 (m, 19H), 2.79～2.56 (m, 40H, PEI600—H), 2.34～2.27 (m, 2H, R—H), 1.60～1.57 (s, 2H, R—H), 1.36～1.18 (m, 8H, R—H), 0.88～0.84 (m, 3H, R—H)。

L10-PEI(產(chǎn)率11.81%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.89～3.79 (m, 2H), 3.71～3.46 (m, 19H), 2.82～2.51 (m, 40H, PEI600—H), 2.37～2.30 (m, 2H, R—H), 1.67～1.56 (m, 2H, R—H),1.34～1.24 (m, 12H, R—H), 0.89 (t,J=6.8 Hz, 3H, R—H)。

L12-PEI(產(chǎn)率12.25%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.81 (s, 2H), 3.75～3.52 (m, 19H), 2.90～2.45 (m, 39H, PEI600—H), 2.34～2.31 (m, 2H, R—H), 1.66～1.54 (m, 2H, R—H), 1.37～1.22 (m, 16H, R—H), 0.89 (t,J=6.8 Hz, 3H, R—H)。

L14-PEI(產(chǎn)率12.33%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.79 (s, 2H), 3.67～3.45 (m, 19H), 2.85～2.44 (m, 44H, PEI600—H), 2.33～2.28 (m, 2H, R—H), 1.63～1.54 (m, 2H, R—H), 1.31～1.20 (m, 20H, R—H), 0.87 (t,J=6.8 Hz, 3H, R—H)。

L16-PEI(產(chǎn)率11.96%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.83～3.75 (m, 2H), 3.63～3.44 (m, 19H), 2.89～2.43 (m, 33H, PEI600—H), 2.33～2.27 (m, 2H, R—H), 1.64～1.52 (m, 2H, R—H),1.34～1.18 (m, 24H, R—H), 0.87 (t,J=6.8 Hz, 3H, R—H)。

L18-PEI(產(chǎn)率12.45%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.80 (s, 2H), 3.66～3.39 (m, 19H), 2.91～2.45 (m, 53H, PEI600—H), 2.33～2.27 (m, 2H, R—H), 1.63～1.51 (m, 2H, R—H), 1.34～1.20 (m, 28H, R—H), 0.86 (t,J=6.7 Hz, 3H, R—H)。

L-oleoyl-PEI(產(chǎn)率13.08%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.39～5.29 (m, 2H, R—H), 3.79 (d,J=4.9 Hz, 2H), 3.65～3.52 (m, 19H), 2.86～2.45 (m, 41H, PEI600—H), 2.33～2.29 (m, 2H, R—H), 2.06～2.01 (m, 4H, R—H), 1.64～1.52 (m, 2H, R—H), 1.37～1.18 (m, 20H, R—H), 0.88 (t,J=6.8 Hz, 3H, R—H)。

L-linoleoyl-PEI(產(chǎn)率12.67%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.40～5.29 (m, 4H, R—H), 3.85～3.75 (m, 2H), 3.63～3.35 (m, 19H), 2.79～2.45 (m, 28H, PEI600—H), 2.33～2.29 (m, 2H, R—H), 2.06～2.01 (m, 4H, R—H), 1.64～1.53 (m, 2H, R—H), 1.34～1.20 (m, 14H, R—H),0.88 (t,J=6.7 Hz, 3H, R—H)。

2.4 脂質(zhì)體聚合物3的分子量測(cè)定

聚合物溶解在磷酸鹽(PBS)緩沖溶液中。相對(duì)分子質(zhì)量由凝膠滲透色譜(GPC)測(cè)量得到:Waters 515型儀器,柱溫為25 ℃,流動(dòng)相為含有體積分?jǐn)?shù)為20%乙腈的0.2 mol/L HOAc-NaAc緩沖溶液,流速為0.5 mL/min,標(biāo)樣是窄分布的聚乙二醇,平均分子量為900～80 000。

2.5 脂質(zhì)體低聚物3/DNA復(fù)合物的制備

為了能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物,采取等體積復(fù)合制備法。先將稱量好的低聚物3溶于1 mL去離子水中(做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí),用0.22 μm的濾膜提前過(guò)濾除菌),再用去離子水稀釋成不同濃度的低聚物溶液,取一定量的低聚物溶液加入等體積(5 μL)的質(zhì)粒DNA溶液中,室溫條件下復(fù)合30 min即可得到不同質(zhì)量比的低聚物3/DNA復(fù)合物溶液。

2.6 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

按照2.5節(jié)中復(fù)合物的制備方法,制備不同質(zhì)量比(0.1～6.4)的脂質(zhì)體低聚物3/DNA的復(fù)合物,其中每個(gè)樣品中pUC19 DNA的量均為0.125 μg。所制備的復(fù)合物用PBS稀釋到總體積為15 μL,37 ℃孵化30 min后,加入30%(體積比)10×的Loading Buffer混勻。隨后將混合液加入已制備好的1%(質(zhì)量/體積)瓊脂糖凝膠孔里,在TBE緩沖溶液中進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn),電壓為150 V。30 min后,在凝膠電泳成像儀下通過(guò)紫外光照射觀察DNA條帶。其中,DNA染色劑為Gelred。

2.7 細(xì)胞培養(yǎng)

人胚胎腎上皮細(xì)胞(HEK 293)采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。人類肝癌細(xì)胞(Bel-7402)采用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清(FBS),體積分?jǐn)?shù)為1%的雙抗(青霉素:100 kU/L;鏈霉素:100 kU/L),細(xì)胞在37 ℃,體積分?jǐn)?shù)分別為5% CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.8 體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

選取三個(gè)低聚物(L6-PEI,L12-PEI,L-oleoyl-PEI)/DNA復(fù)合物在HEK 293細(xì)胞和7402細(xì)胞中進(jìn)行綠色熒光蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞接種于24孔板中,密度分別為9.5× 104/孔(HEK 293細(xì)胞),12× 104/孔(7402細(xì)胞),每孔中加入500 μL培養(yǎng)基培養(yǎng)。置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞密度為80%～90%即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

按照2.5節(jié)中的制備方法,制備不同質(zhì)量比的脂質(zhì)體低聚物(L6-PEI,L12-PEI和L-oleoyl-PEI)/DNA復(fù)合物,即將一定量的低聚物溶液和0.8 μg pEGFP-N1復(fù)合,用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至100 μL,室溫下混勻并靜置30 min。進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前,小心地將24孔板內(nèi)的培養(yǎng)基吸掉,并加入400 μL新鮮無(wú)血清的培養(yǎng)基,再將100 μL復(fù)合物溶液加入24孔板中。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 h后,再次移去培養(yǎng)基,換成500 μL的新鮮10%血清培養(yǎng)基,CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),24 h后,在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況并進(jìn)行拍照。另外,PEI 25 kDa在體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)染效率均很高,所以將它作為聚合物對(duì)照。

3 結(jié)論

(1)成功合成了以低分子量PEI 600 Da為基準(zhǔn),采用Michael加成反應(yīng)將其接枝于含有疏水鏈的生物可降解聚酯上的梳狀低聚物。

(2)這些低聚物對(duì)DNA有較好的包裹能力;且油酸修飾后的脂質(zhì)體低聚物有作為非病毒基因載體的潛力。