5-氮雜-2’-脫氧胞苷對苯并[a]芘致海馬神經(jīng)元毒性的保護(hù)作用

魏智超 馮婧宇 聶繼盛 魏建宏

1.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山西太原 030000；2.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西汾陽 032200

表觀遺傳學(xué)是指當(dāng)核苷酸序列不變時，基因表型改變的一門學(xué)科。DNA 甲基化是最重要的基因修飾途徑，是人類生命過程中的重要組成部分[1-2]，它可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育中的重要過程[3-5]。哺乳動物細(xì)胞中DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B 3 種酶具有DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）活性[4]。

苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，B[a]P）是多環(huán)芳烴的主要代表，在香煙煙霧、柴油廢氣及工業(yè)廢物中可以檢測到高濃度的B[a]P[6]。B[a]P 具有遺傳毒性、致畸性和神經(jīng)毒性等特點(diǎn)。由于其親脂性，B[a]P 能輕易通過血腦屏障，可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)功能損傷[7-9]。B[a]P 暴露后DNA 甲基化的變化可影響肺癌發(fā)展[10]。B[a]P 可引起精子DNA 異常甲基化，與胚胎、生殖系統(tǒng)發(fā)育和許多遺傳疾病有關(guān)[11]，還可影響小鼠血液和肝臟中的DNA 甲基化水平[12]。但是，目前關(guān)于DNA 甲基化在B[a]P 致神經(jīng)毒性中的作用研究較少。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-cdR）為DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑[13]。研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-cdR 可以通過氧化應(yīng)激來調(diào)節(jié)百草枯對PC12 細(xì)胞的毒性作用[14]。目前，5-Aza-cdR 對B[a]P所致的神經(jīng)毒性作用尚未見報道。本研究旨在構(gòu)建B[a]P 的體外染毒模型，利用5-Aza-cdR 進(jìn)行干預(yù)，探討5-Aza-cdR 對B[a]P 神經(jīng)毒性的保護(hù)作用，為深入探索B[a]P 的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

3 月齡SPF 級SD 大鼠20 只[山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK（晉）2019-0004），合格證號：SYXK（晉）2019-0007]。體重250～300 g，雌雄比例2∶1 合籠交配。飼養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃，濕度（55±5）%。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院動物倫理委員會審批通過（2018-021）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

B[a]P（B1760，sigma）；5-Aza-cdR（D9010，索萊寶）；無血清培養(yǎng)基（21103049，Thermo）；β-tubulinⅢ抗體（AB0043，abways）；兔抗DNMT1 抗體（YN2950，Immunoway）；兔抗DNMT3A 抗體（20954-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；兔抗 DNMT3B 抗體（26971-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；實(shí)時熒光定量試劑盒[FP215，天根生化科技（北京）有限公司]；凝膠成像分析儀（731BR03 442，Bio-Rad）；定量反轉(zhuǎn)錄PCR 儀（CFX96，Bio-Rad）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 雌鼠妊娠21 d 后，取24 h 內(nèi)新生SD大鼠10 只，斷頭，收集海馬組織于15 ml 離心管，添加DMEM 培養(yǎng)基，2 mg/ml 的木瓜酶37℃消化30 min，添加胎牛血清終止消化，去上清，加入10 μl DNA 酶，槍頭吹打10 次，移液槍吸取上清于新離心管，200 目篩過濾細(xì)胞懸液，重復(fù)3 次。離心機(jī)1 500 r/min 離心5 min（離心半徑9 cm），去上清，加入培養(yǎng)基重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以7×105個/ml 的接種密度均勻鋪板，每孔體積2 ml，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h 后更換無血清培養(yǎng)基，每隔2 d 半量換液。光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 免疫熒光法鑒定海馬神經(jīng)元 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第5 天，4%多聚甲醛固定1 h。加入0.1%TritonX-100 室溫孵育30 min，5%BSA 封閉30 min。添加β-tubulinⅢ抗體4℃過夜。熒光二抗避光孵育1 h。DAPI 染色15 min，以DAPI 和的β-tubulinⅢ陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比作為神經(jīng)元陽性率（陽性率＞95%為標(biāo)準(zhǔn)）。

1.3.3 細(xì)胞分組及處理 將海馬神經(jīng)元分為3 組，分別為對照組、B[a]P 組（20 μmol/L B[a]P）、B[a]P+5-Azacd R 組（20 μmol/L B[a]P+10 μmol/L 5-Aza-cdR）。待細(xì)胞生長至第5 天，海馬神經(jīng)元用5-Aza-cdR 處理24h，暴露于B[a]P 24 h。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4 CCK8 檢測細(xì)胞活力 細(xì)胞分組干預(yù)，每組設(shè)置4個復(fù)孔。每孔加入10 μl CCK8 檢測液，37℃孵育2 h。酶標(biāo)儀測定吸光度值。細(xì)胞活力（%）=[（實(shí)驗(yàn)孔-空白孔）/（對照孔-空白孔）]×100%

1.3.5 免疫印跡法檢測DNMTs 蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞加入80 μl 裂解液，收集蛋白裂解液，BCA 法測定蛋白濃度。電泳、電轉(zhuǎn)、封閉，孵育一抗DNMT1（1∶1 000）、DNMT3A（1∶4 000）、DNMT3B（1∶3 000）和β-actin（1∶10000）。4℃孵育過夜，加入二抗（1∶5000）室溫孵育2h。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的條帶灰度值比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.6 定量反轉(zhuǎn)錄PCR 測定DNMTs 基因表達(dá) Trizol提取細(xì)胞RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cD-NA，-20℃保存，取少量cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系共20μl：MasterMix10 μl，cDNA 1 μl，正向引物0.6 μl，反向引物0.6μl，ddH2O7.8μl。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

表1 DNMTs 引物序列

1.3.7 5-mC 免疫熒光法檢測總甲基化水平 多聚甲醛固定，山羊血清封閉。每孔加入50 μl 5-mC 抗體4℃過夜。加入熒光二抗，熒光顯微鏡下觀察。平均熒光強(qiáng)度=熒光強(qiáng)度總和/總面積。

1.3.8 細(xì)胞凋亡檢測 多聚甲醛固定20 min，滴加50 μl Hoechst33342 工作液，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較釆用LSD-t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定結(jié)果

剛接種的海馬神經(jīng)元呈圓形或多角形，透光性好，分布較均勻。1 d 后細(xì)胞突起生長快，數(shù)目增加。4～5 d后神經(jīng)元突起增長，相互連接成神經(jīng)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，見圖1。神經(jīng)元陽性率＞95%，見圖2。

圖1 海馬神經(jīng)元形態(tài)

圖2 神經(jīng)元鑒定結(jié)果

2.2 各組細(xì)胞形態(tài)和活力的變化

對照組神經(jīng)元形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整。B[a]P 組可見細(xì)胞數(shù)量較少，突起皺縮，突起間連接斷裂；B[a]P+5-Aza-cdR 組可見少量萎縮細(xì)胞。與對照組比較，B[a]P組細(xì)胞活力降低（P＜0.05）。與B[a]P 組比較，細(xì)胞活力在B[a]P+5-Aza-cdR 組升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 海馬神經(jīng)元形態(tài)和活力變化

2.3 各組細(xì)胞DNMTs 蛋白表達(dá)結(jié)果

與對照組比較，B[a]P 組DNMT3A、DNMT3B 蛋白的表達(dá)增高（P＜0.05），DNMT1 表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與B[a]P 組比較，B[a]P+5-AzacdR 組DNMTs 的蛋白表達(dá)水平表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞DNMTs 蛋白表達(dá)

2.4 各組細(xì)胞DNMTs 基因表達(dá)結(jié)果

與對照組比較，B[a]P 組DNMT1、DNMT3A 基因表達(dá)水平升高（P＜0.05）。DNMT3B 表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與B[a]P 組比較，B[a]P+5-Aza-cdR 組DNMTs 基因表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞DNMTs 基因表達(dá)

2.5 各組細(xì)胞總甲基化水平表達(dá)結(jié)果

與對照組比較，B[a]P 組的熒光信度變強(qiáng)，總甲基化水平升高（P＜0.05）。與B[a]P 組比較，B[a]P+5-Aza-cdR組總甲基化水平降低（P＜0.01）。見圖6。

圖6 各組細(xì)胞總甲基化水平表達(dá)結(jié)果

2.6 各組細(xì)胞凋亡結(jié)果

與對照組比較，B[a]P 組可以觀察到核濃染，核破碎現(xiàn)象，凋亡細(xì)胞增多，凋亡率升高（P＜0.05）。與B[a]P 組比較，B[a]P+5-Aza-cdR 組可以觀察到少量凋亡細(xì)胞，海馬神經(jīng)元的凋亡率明顯降低（P＜0.01）。見圖7。

圖7 各組細(xì)胞凋亡結(jié)果

3 討論

B[a]P 神經(jīng)毒性的作用機(jī)制主要有以下4 種：一是改變神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)受體誘發(fā)神經(jīng)毒性；二是干擾基因的表達(dá)誘發(fā)神經(jīng)毒性；三是改變氧化應(yīng)激而引起神經(jīng)毒性[15-17]；四是從表觀遺傳學(xué)方面引起神經(jīng)毒性[18]。研究表明，細(xì)胞內(nèi)鋅缺乏可能會改變甲基化相關(guān)蛋白及基因的表達(dá)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷[19]。隨著B[a]P染毒劑量的增加，DNMTs 表達(dá)量顯著增加，提示DNMTs 在B[a]P 誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能損害中起著重要作用[20]。5-Aza-cdR 對小鼠海馬PP1γ 的表達(dá)具有抑制作用，與小鼠學(xué)習(xí)記憶和突觸可塑性有關(guān)[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-cdR 能抑制DNMTs 等基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生長和凋亡[23]，還可以顯著降低DNA甲基化水平，同時大鼠的學(xué)習(xí)能力也明顯提升[24]。5-Aza-cdR 可抑制DNA 甲基化而改善七氟醚誘導(dǎo)的記憶基因表達(dá)下降[25]。

本研究結(jié)果顯示，5-Aza-cdR 對B[a]P 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元毒性有保護(hù)作用?？赡艿臋C(jī)制是5-Aza-cdR可降低DNMTs 基因和蛋白的表達(dá)水平，降低細(xì)胞的總甲基化水平。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將進(jìn)一步從表觀遺傳學(xué)方面深入探討5-Aza-cdR 對B[a]P 誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元毒性的作用，為B[a]P 神經(jīng)毒性的防治提供了一定的作用靶點(diǎn)。