不同種群羅氏沼蝦幼體的腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能特征分析

施金谷,武 霞,黃光華,楊慧贊,梁 怡,呂 敏,曾 蘭,胡大勝,黃立斌,王 瑞

( 1.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院,廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530021; 2.廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣站,廣西 南寧 530022; 3.廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廣西 桂林 541006 )

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii),又稱金錢蝦、馬來大蝦或長腳大蝦,屬節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱十足目長臂蝦科沼蝦屬[1],是世界上個(gè)體最大的淡水蝦。羅氏沼蝦肉質(zhì)鮮嫩,具有食性雜、養(yǎng)殖周期短、生長快、病害少等特點(diǎn),是一種優(yōu)良的淡水養(yǎng)殖品種。近年來,羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛,但在養(yǎng)殖過程中,溶解氧、溫度、飼料等均可影響羅氏沼蝦的免疫機(jī)能[2-3],免疫機(jī)能的下降會(huì)引起蝦的疾病和死亡,從而影響上市蝦的產(chǎn)量和規(guī)格,影響?zhàn)B殖戶的收益。研究表明,在基礎(chǔ)飼料中添加益生菌能顯著增強(qiáng)腸道免疫機(jī)能[4-6]以及腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的生長[7-8],提升機(jī)體的抗病能力[2,9-10]。腸道菌群失調(diào)會(huì)引起全身性的炎癥,健康的腸道菌群由固定的菌群組成[11-12]。所以,腸道菌群的結(jié)構(gòu)和豐度影響著宿主的生長與健康。

腸道微生物群是生活在動(dòng)物腸道部位的生物集合,細(xì)菌是腸道中的主要定殖者,其他為真菌、古生菌、原生動(dòng)物、真核寄生生物以及病毒等[13]。在長期的進(jìn)化中,腸道微生物除了可以引起疾病的暴發(fā),還可以與宿主互利共生,對(duì)宿主的營養(yǎng)代謝、吸收和生長等產(chǎn)生重要影響[14]。腸道微生物群結(jié)構(gòu)的分析研究方法主要有傳統(tǒng)純培養(yǎng)法、ERIC-PCR分子雜交技術(shù)、基于16S rRNA的分子技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)以及宏基因組學(xué)研究方法等[15]。近幾年,16S rRNA高通量測(cè)序是分析腸道微生物的主要技術(shù),可以準(zhǔn)確定位到分類學(xué)屬水平。韓娜等[16]研究出一種新的定量16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序方法,采用隨機(jī)標(biāo)簽和內(nèi)參法相結(jié)合,能降低試驗(yàn)因素的影響,有效提高腸道微生物群結(jié)構(gòu)檢測(cè)的精準(zhǔn)性。16S rRNA測(cè)序技術(shù)已應(yīng)用到畜牧學(xué)[17-19]、醫(yī)學(xué)[20-21]、農(nóng)學(xué)[22]和水產(chǎn)學(xué)[23-25]等多種學(xué)科專業(yè)?；?6S rRNA技術(shù),鄧祥宜等[26]研究了克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)的腸道菌群多樣性,表明核心菌群在消化利用腸道中的蛋白質(zhì)上起重要作用。目前,國內(nèi)學(xué)者主要研究報(bào)道了凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[27-28]、克氏原螯蝦[13,29]、日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)[30]等蝦類的腸道菌群結(jié)構(gòu)與特征,而關(guān)于羅氏沼蝦的腸道菌群研究報(bào)道較少,主要集中在飼料中添加微生態(tài)制劑[2]、發(fā)酵豆粕[31]等對(duì)羅氏沼蝦腸道菌群的影響及不同養(yǎng)殖條件對(duì)羅氏沼蝦腸道菌群的影響[32]方面。筆者利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù),探究羅氏沼蝦的腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能,分析不同種群羅氏沼蝦幼體間的腸道菌群差異,以豐富和擴(kuò)展羅氏沼蝦腸道菌群的基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用緬甸種群、斯里蘭卡種群、越南種群、孟加拉種群和自有品種1種群等5個(gè)不同種群的羅氏沼蝦幼體,試驗(yàn)材料采自廣西南寧國家級(jí)羅氏沼蝦良種場(chǎng)。育苗用水為濃縮海水加入淡水配制,鹽度10～12,水溫28～29 ℃,pH 7.5～8.0,溶解氧質(zhì)量濃度≥5 mg/L。早晚各投喂鹵蟲(Artemia)無節(jié)幼體1次,中間投喂蒸蛋微粒2次。所有樣品為同一批孵化且孵化20 d的幼蝦。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集

從育苗車間采集孵化20 d的5個(gè)不同種群的羅氏沼蝦幼體,每個(gè)種群的幼體樣本各2份,每份含羅氏沼蝦幼體約3 g。樣品采集后用無菌水沖洗5次,使用15 mL離心管存放,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌的16S rRNA基因V3～V4區(qū)測(cè)序

于-80 ℃取出羅氏沼蝦幼體樣品,冰上融化后,按照HiPure Stool DNA Kit說明書方法提取腸道微生物的總DNA。采用PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3和V4區(qū),擴(kuò)增引物為341F(CCTACGG GNGGCWGCAG)和806R(GGACTACHVGGGT ATCTAAT)。反應(yīng)體系(50 μL)為:10×Buffer KOD 5 μL、2 mmol/L dNTPs 5 μL、25 mmol/L MgSO43 μL、正向引物 (10 μmol/L) 和反向引物 (10 μmol/L)各1.5 μL、KOD 聚合酶 1 μL、模板 DNA 100 ng、超純水補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 94 ℃ 預(yù)變性2 min,98 ℃ 變性10 s,62 ℃ 退火30 s,68 ℃ 延伸30 s,30個(gè)循環(huán);68 ℃終延伸 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒按照說明書方法進(jìn)行回收,采用ABI StepOnePlus 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行定量后在Illumina平臺(tái)進(jìn)行PE250測(cè)序,測(cè)序工作由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

對(duì)羅氏沼蝦幼體腸道菌群16S rRNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,主要分析步驟包括:(1)原始測(cè)序序列的拼接和質(zhì)控:使用FASTP軟件過濾低質(zhì)量Reads,然后利用FLASH將雙端Reads拼接為Tags,再過濾低質(zhì)量的Tags,最后使用Usearch軟件的UPARSE算法對(duì)運(yùn)算分類單元進(jìn)行聚類分析,相似度大于97%的序列聚為一類,計(jì)算每個(gè)運(yùn)算分類單元在各個(gè)樣品中的Tags絕對(duì)豐度和相對(duì)信息。(2)采用RDP Classifier的Na?ve Bayesian assignment算法,與GreenGene 數(shù)據(jù)庫(設(shè)定置信度的閾值為0.8～1.0)對(duì)代表性運(yùn)算分類單元進(jìn)行物種注釋;計(jì)算Alpha多樣性;在生物學(xué)分類的門水平和科水平進(jìn)行細(xì)微生物群落結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度分析,繪制群落Circro圖和堆疊圖,根據(jù)物種、樣本間豐度相似性進(jìn)行聚類,分析樣本細(xì)微生物群落門、科水平組成的相似情況以及主要差異。(3)根據(jù)運(yùn)算分類單元的物種注釋和豐度信息,使用PICRUSt軟件進(jìn)行微生物群KEGG通路功能注釋。(4)使用SPSS 26.0、WPS軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)圖形化處理。

2 結(jié) 果

2.1 運(yùn)算分類單元分析

腸道菌群通過16S rRNA高通量測(cè)序及處理,5組樣品共獲得有效序列966 423條,按97%的相似度共劃分出8185個(gè)運(yùn)算分類單元。緬甸種群、斯里蘭卡種群、越南種群、孟加拉種群和自有品種1種群羅氏沼蝦組共有的運(yùn)算分類單元為256個(gè),每組獨(dú)有的運(yùn)算分類單元分別為131、247、231、144、184個(gè)(圖1)。樣本運(yùn)算分類單元數(shù)量依次為越南種群>孟加拉種群>緬甸種群>斯里蘭卡種群>自有品種1種群(圖2),這說明5個(gè)種群的羅氏沼蝦樣品均含有較豐富的菌群種類,且核心菌群較相似。

圖1 運(yùn)算分類單元韋恩圖Fig.1 Veen diagrams of OTUs

圖2 各組運(yùn)算分類單元數(shù)量Fig.2 Column diagram of OTUs in different groups

2.2 Alpha多樣性分析

5組羅氏沼蝦幼體腸道菌群的Alpha多樣性指數(shù)見表1。組間平均覆蓋率為99.67%～99.72%,表明試驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)能夠真實(shí)反映樣品中菌群的組成,測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣本中所有的物種,存在新物種的可能性很小。孟加拉種的Chao指數(shù)和Ace指數(shù)均高于其他4組,表明孟加拉種群幼蝦的腸道菌群物種豐富度最高。各組樣品的香農(nóng)指數(shù)依次為越南種群>斯里蘭卡種群>緬甸種群>孟加拉種群>自有品種1種群,表明羅氏沼蝦越南種群幼蝦的腸道菌群多樣性最高,與運(yùn)算分類單元的檢測(cè)結(jié)果相符。各組樣品的辛普森指數(shù)依次為斯里蘭卡種群>越南種群>緬甸種群>孟加拉種群>自有品種1種群,表明羅氏沼蝦斯里蘭卡種群幼蝦的腸道菌群種數(shù)最多,且各種個(gè)體分配更均勻,物種多樣性程度高。

表1 各組樣品的Alpha多樣性指數(shù)Tab.1 Alpha-diversity index of the samples in different groups

2.3 腸道菌群整體結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 腸道菌群在門水平上的結(jié)構(gòu)分析

在生物分類學(xué)門水平上,5組樣品的腸道菌群共注釋到13個(gè)門,平均相對(duì)豐度大于1%的門有5個(gè),分別為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、藍(lán)藻菌門和浮霉菌門。緬甸種群、越南種群、孟加拉種群和自有品種1種群的平均相對(duì)豐度排名前3的菌門一致,由大到小依次為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門,只有細(xì)菌豐度比例存在一定的差異:緬甸種群為64.43%、32.89%和1.94%;越南種群為77.34%、18.64%和1.80%;孟加拉種群為68.15%、28.56%和1.76%;自有品種1種群的為84.73%、12.65%和0.66%。這4個(gè)組的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門和擬桿菌門。而斯里蘭卡種群中厚壁菌門的豐度相對(duì)較高,其優(yōu)勢(shì)菌門依次為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門,占比分別為85.32%、7.97%和4.46%(圖3)。

圖3 各組樣品門水平上的菌群群落Circos圖Fig.3 Circro diagram of microbial community on phylum level in different groups

2.3.2 腸道菌群在科水平上的結(jié)構(gòu)分析

在生物分類學(xué)科水平上,羅氏沼蝦不同種群幼蝦的腸道菌群結(jié)構(gòu)分析見圖4。各組樣品檢測(cè)到的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌科均為腸桿菌科,其他優(yōu)勢(shì)菌科(相對(duì)豐度大于1%且排名前4)在各組樣品的分布具有明顯差異。緬甸種群以腸桿菌科(51.05%)、螺旋體科(23.77%)、黃桿菌科(10.42%)和Stappiaceae(7.38%)為優(yōu)勢(shì)菌科;斯里蘭卡種群以腸桿菌科(60.07%)、弧菌科(21.53%)、煙桿菌科(97.23%)和希瓦氏菌科(4.9%)為優(yōu)勢(shì)菌科;越南種群以腸桿菌科(48.31%)、黃桿菌科(15.49%)、弧菌科(10.5%)和Cellvibrionaceae(7.41%)為優(yōu)勢(shì)菌科;孟加拉種群以腸桿菌科(59.37%)、黃桿菌科(26%)、螺旋體科(4.11%)和希瓦氏菌科(3.68%)為優(yōu)勢(shì)菌科;自有品種1種群以腸桿菌科(81.31%)、黃桿菌科(6.01%)、Stappiaceae(4.16%)和螺旋體科(3.8%)為優(yōu)勢(shì)菌科。

圖4 各組樣品科水平上的菌群群落結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度Fig.4 The community structure and relative abundance on family level in different groups

2.4 細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)

PICRUSt分析表明,羅氏沼蝦腸道菌群所預(yù)測(cè)到的功能基因可注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中6條1級(jí)通路以及33條2級(jí)通路(平均相對(duì)豐度>1%)。1級(jí)通路結(jié)果表明,基因主要富集在新陳代謝、遺傳信息處理、細(xì)胞進(jìn)程、環(huán)境信息處理、生物系統(tǒng)、人類疾病通路中。在5個(gè)組中,新陳代謝類通路富集的功能基因均占所有通路富集到的功能基因的約80%(圖5),表明羅氏沼蝦幼蝦腸道菌群的主要功能是參與腸道內(nèi)各種物質(zhì)的消化與代謝。2級(jí)通路結(jié)果表明,基因主要富集在新陳代謝通路中的碳水化合物代謝、氨基酸代謝、維生素代謝、萜類和聚酮類化合物代謝、其他氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、外源生物降解和代謝、能量代謝和糖基生物合成與代謝等,遺傳信息處理類通路中的復(fù)制與修復(fù)、折疊、分類和降解,細(xì)胞進(jìn)程類通路中的細(xì)胞運(yùn)動(dòng),以及環(huán)境信息處理類通路中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖5 各組樣品1級(jí)通路功能占比Fig.5 Functional proportion of primary pathway in different groups

3 討 論

3.1 羅氏沼蝦幼體腸道菌群結(jié)構(gòu)特征分析

羅氏沼蝦幼體的腸道非常細(xì)小,不易分離取出,研究表明,腸道菌群約占個(gè)體全部菌群的78%～80%[33-34],而外部使用消毒殺菌的溶劑沖洗,可以成功沖洗掉附著于幼體外表面的細(xì)菌[35-36];醫(yī)學(xué)試驗(yàn)證明,無菌水的沖洗同樣可以有效清除幼體表面附著的微生物[37-39],故筆者通過使用無菌水的多次沖洗和漂洗,去除羅氏沼蝦幼體表面的微生物,提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性,以提取到的羅氏沼蝦幼體總菌群DNA來代替腸道菌群。

水生生物的優(yōu)勢(shì)菌群多以變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門等為主[27-30]。通過16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)羅氏沼蝦不同種群幼體的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦緬甸種群、斯里蘭卡種群、越南種群、孟加拉種群和自有品種1種群幼體的腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌門前3位均為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門,是羅氏沼蝦幼體的核心菌群。變形菌門內(nèi)細(xì)菌種類豐富,涵蓋了極為廣泛的生理代謝類型[40],其中弧菌科細(xì)菌的代謝產(chǎn)物會(huì)引發(fā)細(xì)胞衰亡和慢性炎癥,是引起慢性腸道疾病的主要因素[41],腸桿菌科的細(xì)菌可以將非必需氨基酸轉(zhuǎn)化為必需氨基酸或蛋白質(zhì)[42],但在蝦患病時(shí),其豐度的升高會(huì)造成健康蝦類中丁酸的豐度降低,從而造成抵抗力下降[43]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,5個(gè)種群的腸道菌群中變形菌門均為最優(yōu)勢(shì)菌(豐度均大于60%),對(duì)宿主蝦的生長快慢和健康與否起決定性作用。擬桿菌門中的黃桿菌科細(xì)菌可以分解復(fù)雜的高分子物質(zhì)[36],腸擬桿菌(Bacteroidesintestinalis)和卵擬桿菌(B.ovatus)等可以降解木聚糖[44-45]、阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)和果膠等植物多糖[46]。厚壁菌門則更傾向于分解多糖和多脂類物質(zhì)[47]。本試驗(yàn)結(jié)果中,只有斯里蘭卡種群的厚壁菌門豐度大于擬桿菌門,表明斯里蘭卡種群對(duì)飼料中的多脂類物質(zhì)分解更加充分,宿主蝦也更容易吸收脂類物質(zhì)。由此可知,核心菌群主要參與生產(chǎn)生命活動(dòng)必需物質(zhì)以及分解腸道中最難分解的高分子物質(zhì),筆者認(rèn)為,在羅氏沼蝦幼體階段可以通過改變其飼料中蛋白質(zhì)、多糖等高分子物質(zhì)的成分比例,來改變蝦腸道核心菌群的種類和豐度,這可為研究羅氏沼蝦腸道菌群和宿主免疫以及宿主食性之間的聯(lián)系提供前期資料。

與本研究結(jié)果類似:Zhang等[29]發(fā)現(xiàn),克氏原螯蝦腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門;曾晨爔等[30]發(fā)現(xiàn)日本囊對(duì)蝦的腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和梭桿菌門。金若晨[27]研究表明,健康和患病的凡納濱對(duì)蝦腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌門均為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門,與本試驗(yàn)研究結(jié)果存在差異的是菌門的豐度大小不同,這可能是由于試驗(yàn)蝦的種類不同所致。洪斌等[48]在對(duì)比研究凡納濱對(duì)蝦和羅氏沼蝦的腸道微生物的過程中發(fā)現(xiàn),羅氏沼蝦腸道中的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門。董學(xué)興等[32]研究不同養(yǎng)殖條件下羅氏沼蝦的腸道菌群,發(fā)現(xiàn)其不同養(yǎng)殖條件下的優(yōu)勢(shì)菌門相類似,單養(yǎng)羅氏沼蝦的優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門和厚壁菌門。這與本試驗(yàn)結(jié)果差異較大,可能是因?yàn)轲B(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖時(shí)間等的不同,或因試驗(yàn)所用羅氏沼蝦所處的成長階段有很大差別。以上研究結(jié)果表明,正常健康蝦類的腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門,不同種類蝦以及同種蝦不同種群間的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在一定的共性,但物種豐度存在差異,同時(shí)也證明了筆者采用羅氏沼蝦幼體直接進(jìn)行16S rRNA測(cè)序開展腸道菌群研究的可信度與可行性。

3.2 羅氏沼蝦幼體腸道菌群功能預(yù)測(cè)分析

本研究中PICRUSt功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,羅氏沼蝦腸道菌群的基因功能主要與新陳代謝類功能有關(guān),包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝等,表明腸道菌群積極參與了羅氏沼蝦的基礎(chǔ)生理代謝過程。有研究表明,腸道菌群參與控制能量代謝[49]與氨基酸代謝[50],向宿主提供營養(yǎng),與宿主建立共生關(guān)系,與宿主的免疫系統(tǒng)相互作用[51]。這主要是由優(yōu)勢(shì)菌門基因功能決定的。變形菌門內(nèi)的一些細(xì)菌會(huì)進(jìn)行氨基酸代謝為宿主提供生存的必要條件[43];擬桿菌門和厚壁菌門是魚蝦等水生動(dòng)物體內(nèi)的益生菌[52];厚壁菌門與擬桿菌門的比值降低,可以降低脂肪沉積,改善肌肉的風(fēng)味[53]。故筆者推測(cè),本研究中羅氏沼蝦腸道中厚壁菌門與擬桿菌門的比值同樣會(huì)影響蝦肉的風(fēng)味,兩菌門比值在斯里蘭卡種群中大于1,在其他4個(gè)種群中小于1,猜測(cè)斯里蘭卡種群的肉質(zhì)會(huì)比其他種群含脂質(zhì)多,相關(guān)驗(yàn)證還需后期對(duì)各種群蝦的肌肉營養(yǎng)成分進(jìn)行檢測(cè)。筆者認(rèn)為,在之后的生產(chǎn)中,可以因此改變腸道菌群的種類和豐度,生產(chǎn)出符合市場(chǎng)口味的羅氏沼蝦。

4 結(jié) 論

羅氏沼蝦的腸道菌群結(jié)構(gòu),不同種群之間存在共性,其優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門,同時(shí)又存在一定的差異。不同種群羅氏沼蝦幼體腸道菌群研究,可為進(jìn)一步研究不同種群羅氏沼蝦的生長發(fā)育機(jī)制打下基礎(chǔ)。另外,腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌門在羅氏沼蝦的碳水化合物代謝、氨基酸代謝和能量代謝活動(dòng)中發(fā)揮了主要作用,也可為開發(fā)羅氏沼蝦幼體孵育益生菌提供參考。