香蕉枯萎病拮抗菌的篩選鑒定及其防病效果測(cè)定

楊迪 杜嬋娟 張晉 潘連富 葉云峰 付崗

摘要：【目的】從不同作物的根圍土壤中分離篩選香蕉枯萎病菌拮抗菌，對(duì)拮抗菌進(jìn)行鑒定并測(cè)定其防病效果，以期為香蕉枯萎病的生物防治提供新的菌種資源。【方法】以尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense 4，F(xiàn)oc4）Foc 1402菌株為對(duì)象，采用稀釋涂布法對(duì)不同作物根圍土壤中的細(xì)菌進(jìn)行分離，并使用平板對(duì)峙法和牛津杯法篩選其中的香蕉枯萎病拮抗菌。根據(jù)細(xì)菌菌落形態(tài)、生理生化特征結(jié)合16S rDNA序列分析對(duì)拮抗菌進(jìn)行分類鑒定。使用威廉斯B6香蕉杯苗測(cè)定拮抗菌對(duì)香蕉枯萎病的盆栽防治效果。【結(jié)果】從不同作物根圍分離獲得345株細(xì)菌，從中篩選獲得7株對(duì)香蕉枯萎病菌具有較強(qiáng)拮抗活性的菌株，抑菌率最高可達(dá)72.65%。依據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化反應(yīng)和16S rDNA序列分析結(jié)果，菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63被鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株Bc11被鑒定為洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia），菌株P(guān)t05被鑒定為土地類芽孢桿菌（Paenibacillus terrae）。盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，7株拮抗細(xì)菌對(duì)香蕉枯萎病的防治效果在20.00%～68.89%，其中以菌株Bc11的防治效果最好，為68.89%?！窘Y(jié)論】從不同作物的根圍土壤中篩選獲得7株對(duì)Foc具有較強(qiáng)拮抗活性的細(xì)菌，其中，土地類芽孢桿菌為香蕉枯萎病生防菌家族的新成員。篩選獲得的不同種類拮抗菌可作為研制香蕉枯萎病生防菌劑的候選菌株資源，在后續(xù)開發(fā)抗病復(fù)合菌劑方面具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：香蕉枯萎?。簧锓乐?；解淀粉芽孢桿菌；洋蔥伯克霍爾德氏菌；土地類芽孢桿菌

中圖分類號(hào)：S476? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）02-0414-10

Abstract：【Objective】This study was conducted to isolate and screen the antagonists against banana fusarium wilt from the rhizosphere soil of different crops， and then identify them and evaluate their control effects，to provide new bacteria resources forthe biological control of banana fusarium wilt. 【Method】Targeting the Foc 1402 strain of Fusarium oxysporum f. sp. cubense 4，F(xiàn)oc 4， the bacteria in rhizosphere soil of different crops were isolated by gradient dilution coating method， and the antagonistic bacteria of banana fusarium wilt were screened by the plate confrontation method and the Oxford cup assay. The isolates were identified by morphological， physiological， biochemical features and the analysis of 16S rDNA sequences. And the control effects of antagonistic bacteria on banana fusarium wilt were evaluated through pot experiments using banana seedlings of Williams B6. 【Result】A total of 345 bacterial strains were isolated from rhizosphere soil of different crops. Of these， 7 strains with strong antagonistic activity against banana fusarium wilt were screened， and the highest inhibition rate was 72.65%. According to the results of morphological， physiological and biochemical characteristics and 16s rDNA sequence analysis， strains Ba02， Ba310， Ba48， Ba62 and Ba63 were identified as Bacillus amyloliquefaciens， the strain Bc11 was identified as Burkholderia cepacia， and the strain Pt05 was identified as Paenibacillus terrae. Pot experiments revealed that the control effects of 7 antagonistic bacteria on banana fusarium wilt were 20.00%-68.89%， and the strain Bc11 was the most effective against banana fusarium wilt （68.89%）. 【Conclusion】In this study， 7 biocontrol bacteria withstrong control effects on banana fusarium wilt were screened from the rhizosphere soil of different crops. Among them， P. terrae is a new member of the biocontrol bacteria family of banana fusarium wilt. At the same time， the different kinds of antagonistic bacteria obtained can serve as candidate strain resources for the development of biocontrol agents against banana fusarium wilt， and have good application prospects in the subsequent development of disease resistant composite bacterial agents.

Key words： banana fusarium wilt； biological control； Bacillus amyloliquefaciens； Burkholderia cepacia； Paenibacillus terrae

Foundation items：National Natural Science Foundation of China （31960520）； Central Government-guided Local Science and Technology Development Fund （Guike ZY21195015）；Guangdong and Guangxi Joint Fund Project （2020B1515420006）； Project of Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests （22-035-31-22ST03）

0 引言

【研究意義】由尖孢鐮刀菌古巴?；停跢usa-rium oxysporum f. sp. cubense （Foc）］侵染引起的香蕉枯萎病是目前世界香蕉產(chǎn)業(yè)中發(fā)生最嚴(yán)重的毀滅性土傳病害（Ghag et al.，2015）。長(zhǎng)期以來，多種方法已被嘗試用于香蕉枯萎病的防治，如土壤熏蒸、輪作、土壤有機(jī)改良等，但該病仍未能得到有效控制（Saravanan et al.，2003；Ploetz，2015a；Dita et al.， 2018；李朝生等，2021；Ismaila et al.，2022）。利用生防微生物防治土傳病害可改善土壤微生態(tài)環(huán)境，豐富土壤微生物區(qū)系，避免病菌產(chǎn)生抗性，同時(shí)還可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)防御反應(yīng)，有助于持續(xù)抑制病害（Shen et al.，2015；Wan et al.，2018；常淑嫻等，2022；彭雯杰等，2022；Li et al.，2022）。因此，選擇拮抗微生物防治香蕉枯萎病是一條值得探究的有效防控途徑，而篩選獲得具有生防潛能的拮抗微生物是開展生物防治工作的重要基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，多種對(duì)香蕉枯萎病具有拮抗作用的生防菌被報(bào)道。木霉屬（Trichoderma spp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）、鏈霉菌屬（Streptomyces spp.）和叢枝菌根真菌是研究較多的香蕉枯萎病生防菌，其中鏈霉菌屬更多僅針對(duì)Foc的離體研究，較少進(jìn)行活體或大田試驗(yàn)（覃柳燕等，2017；Bubici et al.，2019；賴寶春等，2020；李樞妍等，2021；楊迪等，2021）。Napitupulu等（2019）通過對(duì)峙培養(yǎng)和揮發(fā)性有機(jī)物測(cè)試，評(píng)估了10株哈茨木霉（T. harzianum）對(duì)Foc的生防潛力，結(jié)果表明所有菌株對(duì)Foc均具有拮抗活性，并可產(chǎn)生抑制Foc菌絲生長(zhǎng)的揮發(fā)性有機(jī)物；Lin和Ho（2021）在平板試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蕈狀芽孢桿菌（B. mycoides）NP02和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）BaPD1均對(duì)Foc TR4具有拮抗作用，將2株菌株用于處理感染枯萎病的香蕉苗，通過比較植株生長(zhǎng)狀況和葉片養(yǎng)分發(fā)現(xiàn)，2株菌株處理均可減輕枯萎病的田間癥狀，還可增加染病植株葉片中氮含量以及鋅、鐵、鎳等金屬離子水平；Raja和Ebenezar（2021）采用平板對(duì)峙法測(cè)試了分離自14個(gè)香蕉種植區(qū)的綠色木霉（T. viride）、熒光假單胞菌（P. flourescens）和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）對(duì)Foc的抑制率，結(jié)果顯示綠色木霉對(duì)Foc的菌絲生長(zhǎng)抑制率在57.52%～72.55%；熒光假單胞菌表現(xiàn)出的菌絲生長(zhǎng)抑制率為67.17%～82.64%；枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出的菌絲生長(zhǎng)抑制率為59.69%。Cheng等（2022）以中蕉3號(hào)和中蕉4號(hào)香蕉苗為材料，研究了叢枝菌根真菌印度梨形孢（Serendipita indica）定殖對(duì)香蕉生長(zhǎng)和枯萎病抗性的影響，結(jié)果表明該菌的定殖顯著促進(jìn)了香蕉苗的生長(zhǎng)，還可提高香蕉苗中葉綠素和氮的含量，同時(shí)減輕香蕉幼苗上枯萎病癥狀。Shen等（2022）從香蕉根圍土壤中篩選出60株鐵載體菌株，以Foc TR4為病原體，篩選出3株拮抗菌，其中菌株Gxun-6的拮抗活性最高，為68.8%，經(jīng)菌落形態(tài)、生理生化分析和16S rRNA進(jìn)化分析將該菌株鑒定為暹羅芽孢桿菌（B. siamensis）；在盆栽條件下，該菌株對(duì)香蕉枯萎病的防治效果可達(dá)88.26%，同時(shí)可增加香蕉植株的鮮重。然而，由于生防菌本身的特性以及環(huán)境條件等因素的影響，能在田間擁有穩(wěn)定防治效果的生防菌株還較少（Hesran et al.，2019）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】生物防治是香蕉枯萎病防治的研究熱點(diǎn)之一，然而單一的拮抗菌在復(fù)雜的田間環(huán)境中很難發(fā)揮出理想的防治效果。篩選更多種類的生防菌資源，有助于后續(xù)抗病復(fù)合菌劑的開發(fā)，以利于生防菌劑在田間更好地發(fā)揮作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用平板對(duì)峙法和牛津杯法從不同作物的根圍土壤中分離篩選香蕉枯萎病拮抗菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定及16S rDNA序列分析對(duì)拮抗菌進(jìn)行鑒定，并通過盆栽試驗(yàn)測(cè)定拮抗菌的防病效果，以期為香蕉枯萎病的生物防治提供新的菌種資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試菌株：尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種（F. oxysporum f. sp. cubense 4，F(xiàn)oc4）Foc 1402菌株，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所香蕉病害研究團(tuán)隊(duì)分離保存。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1 L、pH自然。NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、水1 L、pH 7.0；不加瓊脂為NA液體培養(yǎng)基（方中達(dá)，2001）。

供試香蕉苗：長(zhǎng)勢(shì)一致的5葉齡威廉斯B6健康香蕉杯苗，購(gòu)自南寧香潔農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1. 2 拮抗細(xì)菌分離篩選

1. 2. 1 土壤微生物分離 采用五點(diǎn)取樣法采集不同作物根圍距離地表3～10 cm處土壤，參照付崗等（2007）的方法制備土壤懸浮液，并進(jìn)行10倍梯度稀釋。分別取100 ?L稀釋倍數(shù)為10-4、10-5和10-6的土壤懸浮液在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，28 ℃恒溫培養(yǎng)，24 h后挑取形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行純化后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 Foc拮抗菌初篩 將Foc 1402在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3 d后，用直徑為5 mm的滅菌打孔器沿菌落邊緣打取菌餅。將菌餅置于PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃下培養(yǎng)24 h后，將待測(cè)細(xì)菌在距菌餅2 cm處劃線，繼續(xù)置于28 ℃培養(yǎng)，4 d后選取有3 mm以上抑菌帶的菌株進(jìn)行下一步篩選。

1. 2. 3 Foc拮抗菌復(fù)篩 參照楊迪等（2021）的方法，制備拮抗菌發(fā)酵液和病原菌分生孢子懸浮液，采用牛津杯法測(cè)定各拮抗菌株發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑，并計(jì)算抑菌率。以無菌水為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。選取抑菌率高的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

抑菌率（%）＝（處理抑菌圈直徑－對(duì)照抑菌圈直徑）/處理抑菌圈直徑×100

1. 3 拮抗菌株鑒定

1. 3. 1 形態(tài)學(xué)觀察 將篩選獲得的拮抗菌株在NA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)48 h，定期觀察記錄菌落形狀、透明度及菌落顏色等菌落特征，并在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1. 3. 2 生理生化反應(yīng)測(cè)試 參照杭州微生物試劑有限公司葡萄球菌生化鑒定管和腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管說明書進(jìn)行生理生化反應(yīng)測(cè)試。反應(yīng)結(jié)果判定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（Bergey，2001）。

1. 3. 3 分子鑒定 將拮抗菌株接種于NA液體培養(yǎng)基，28 ℃下120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，取1 mL菌液，12000 r/min離心1 min收集菌體。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取菌株基因組DNA。使用通用引物27F/1492R（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/5'-GGTTACC TTGTACGACTT-3'）擴(kuò)增拮抗菌株的16S rDNA序列。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，使用MEGA X采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 4 拮抗菌盆栽防治效果測(cè)定

參照1.2.3方法制備拮抗菌發(fā)酵液和病原菌分生孢子懸浮液。將長(zhǎng)勢(shì)一致的5葉齡香蕉苗移栽至以蛭石為基質(zhì)的塑料盆內(nèi)，室溫定植10 d后，用小刀沿香蕉根圍進(jìn)行傷根處理。每株蕉苗接種孢子濃度為1×106個(gè)/mL的病原菌分生孢子懸浮液40 mL，同時(shí)淋入100 mL濃度為1×108 CFU/mL的拮抗菌發(fā)酵懸浮液，7 d后再次淋入等量相同濃度的拮抗菌發(fā)酵懸浮液，以無菌水為對(duì)照。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)6株蕉苗。接種21 d后，參照杜嬋娟等（2020）的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)蕉苗球莖縱剖面褐變面積占比確定病級(jí)，調(diào)查發(fā)病情況，并計(jì)算各處理病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)發(fā)病株數(shù)×該級(jí)代表值）/（總株數(shù)×最高級(jí)代表值）×100

防治效果（%）=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算處理，并使用SPSS 18.0的Duncans新復(fù)極差法分析各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 微生物分離與拮抗菌篩選結(jié)果

采用梯度稀釋涂布法從采自不同作物的根圍土壤樣品中分離得到345株細(xì)菌，經(jīng)平板對(duì)峙法初篩，從中篩選得到48株對(duì)香蕉枯萎病菌具有拮抗活性的細(xì)菌，其中以香蕉根圍土壤的拮抗菌分離率最高，為27.3%（表1）。

采用牛津杯法復(fù)篩后，得到7株抑菌率較高的拮抗菌（圖1），其中抑菌率最高的為菌株Ba63，抑菌圈直徑為33.35 mm，抑菌率高達(dá)72.65%；抑菌能力較弱的是Pt05，抑菌率為37.27%（表2）。

2. 2 拮抗菌鑒定結(jié)果

2. 2. 1 拮抗菌形態(tài)學(xué)鑒定 28 ℃條件下，菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后形成稍透明的乳白色圓形菌落，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，易挑起，在顯微鏡下可觀察到菌體呈桿狀（圖2-A～圖2-J）；在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌株Bc11形成白色圓形單菌落，中間隆起，邊緣光滑，易挑起，顯微鏡下菌體呈桿狀（圖2-K和圖2-L）；菌株P(guān)t05形成圓形米白色單菌落，中部低凸，表面粗糙不透明、難挑起，顯微鏡下菌體呈桿狀（圖2-M和圖2-N）。

2. 2. 2 拮抗菌生理生化測(cè)定 對(duì)拮抗菌株的生理生化測(cè)定結(jié)果（表3）顯示，菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63可水解淀粉，能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和甘露糖，不能分解麥芽糖、乳糖和甘露醇；革蘭氏染色、鳥氨酸、尿素、V-P試驗(yàn)和硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性；硫化氫和甲基紅反應(yīng)呈陰性。該5株菌株的生理生化特征與解淀粉芽孢桿菌（Wang et al.， 2012）基本一致。

菌株Bc11能利用葡萄糖、蔗糖、果糖和木糖，不能利用麥芽糖、乳糖、甘露糖和甘露醇，不能水解淀粉；鳥氨酸、尿素試驗(yàn)和硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性；革蘭氏染色、硫化氫、甲基紅和V-P試驗(yàn)呈陰性。該菌株的主要生理生化特征與洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacian）（Zhao et al.，2014）基本一致。

菌株P(guān)t05可分解葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖和甘露糖，能水解淀粉，不能分解木糖和甘露醇；革蘭氏染色、硫化氫、硝酸鹽還原反應(yīng)、鳥氨酸、尿素和V-P試驗(yàn)為陰性；甲基紅反應(yīng)呈陽性。該菌株的主要生理生化特征與土地類芽孢桿菌（Paenibacillus terrae）（Yoon et al.，2003）基本一致。

2. 2. 3 拮抗菌株分子鑒定 分別將7株拮抗菌株的16S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST對(duì)比，結(jié)果顯示，菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63與解淀粉芽孢桿菌的同源性最高，最高均達(dá)100%；菌株Bc11與洋蔥伯克霍爾德氏菌的同源性最高，最高達(dá)99.85%。菌株P(guān)t05與土地類芽孢桿菌的同源性最高，最高達(dá)99.61%。

基于菌株的16S rDNA，采用鄰接法分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63與3株解淀粉芽孢桿菌（MK182997、MG264882和KU363819）以95%的自展支持率聚于同一分支，與芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）其他種可明顯區(qū)分（圖3-A）；菌株Bc11以90%的自展支持率與2株洋蔥伯克霍爾德氏菌（AB051408和JX081590）聚于同一分支，與其他15株伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia spp.）參比種可明顯區(qū)分（圖3-B）；拮抗菌Pt05與2株土地類芽孢桿菌（MT634584和LC127093）聚于同一分支，自展支持率為100%，與其他類芽孢桿菌屬（Paenibacillus spp.）可明顯區(qū)分（圖3-C）。結(jié)合菌株形態(tài)特征及生理生化特征，將拮抗菌Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63鑒定為解淀粉芽孢桿菌；菌株Bc11鑒定為洋蔥伯克霍爾德氏菌；菌株P(guān)t05鑒定為土地類芽孢桿菌。

2. 3 拮抗菌的盆栽防治效果

蕉苗處理21 d后，接種病原菌的對(duì)照組葉片變黃，而拮抗菌發(fā)酵懸浮液處理的蕉苗大多仍保持綠色（圖4-B）。對(duì)照組病情指數(shù)為71.43，各拮抗菌發(fā)酵懸浮液處理的病情指數(shù)在22.22～57.14，顯著低于對(duì)照組（P<0.05），表明7株拮抗菌對(duì)香蕉枯萎病均有顯著的抑制作用。從防治效果看，各菌株的防效在20.00%～68.89%，其中，菌株Bc11、Ba62和Ba02對(duì)香蕉枯萎病的防治效果較好，防效均在60.00%以上（圖4-A）。

3 討論

香蕉枯萎病是一種典型的土傳病害，在世界多數(shù)香蕉主產(chǎn)國(guó)均有發(fā)生，目前尚無有效的單一防治方法（Ploetz，2015b）。近年來，以生物防治為主的綜合防控措施受到越來越多學(xué)者的關(guān)注（Thangavelu and Mustaffa，2012）。而篩選出具有良好生防潛能和不同種類的拮抗菌是香蕉枯萎病生物防治成功的前提，對(duì)后續(xù)田間應(yīng)用的防治效果具有決定性作用。本研究在篩選香蕉枯萎病生防菌的過程中發(fā)現(xiàn)，盡管在不同作物的根圍土壤中均能分離出Foc拮抗菌，但拮抗菌分離率存在差異，其中以香蕉園土壤的Foc拮抗菌分離率最高。其原因可能是在發(fā)生枯萎病的香蕉園內(nèi)，在病原菌的選擇壓力下，健康植株的根圍由于募集有更多的Foc生防菌從而表現(xiàn)相對(duì)抗?。℉aas and Defago， 2005）。因此，在香蕉根圍更容易分離到Foc的拮抗菌。另外，在香蕉根圍分離出的拮抗菌也勢(shì)必更適應(yīng)香蕉根圍環(huán)境，將更容易在蕉園生態(tài)系統(tǒng)定殖和發(fā)揮作用（Pliego et al.， 2011）。這意味著在生防菌的篩選策略上，用于分離生防菌的樣品最好來源于發(fā)生目標(biāo)病害種植園中的健康植株周圍。

本研究從不同作物的根圍土壤中分離出7株對(duì)Foc具有較強(qiáng)拮抗活性的細(xì)菌，通過形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化測(cè)定及16S rDNA序列分析，將分離得到的7株拮抗菌鑒定為3個(gè)種，其中菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63被鑒定為解淀粉芽孢桿菌，菌株Bc11被鑒定為洋蔥伯克霍爾德氏菌，菌株P(guān)t05被鑒定為土地類芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌具有產(chǎn)生抗真菌脂肽、誘導(dǎo)植物抗性、促進(jìn)作物生長(zhǎng)等功能，已有較多用于防治香蕉枯萎病的報(bào)道（Xue et al.，2015； Wang et al.，2016）。洋蔥伯克霍爾德氏菌用于防治香蕉枯萎病的報(bào)道較少見。Pan等（1997）曾探討過洋蔥伯克霍爾德氏菌在香蕉根圍的定殖情況，認(rèn)為該菌具有防治香蕉枯萎病的潛力，但并未明確其防病效果。漆艷香等（2017）在溫室條件下測(cè)試了洋蔥伯克霍爾德氏菌菌株TY對(duì)香蕉枯萎病的防治效果，結(jié)果表明該菌株的防治效果低于20%。而本研究篩選出的洋蔥伯克霍爾德氏菌菌株Bc11對(duì)Foc 1402具有明顯的拮抗作用，盆栽防治效果達(dá)68.89%。有研究表明，土地類芽孢桿菌作為生防菌，在盆栽條件下可降低番茄灰霉病的發(fā)生率，并有促生作用（Kim et al.，2017），對(duì)稻瘟病也有良好的防治效果（Yu et al.，2019），但尚未見用于防治香蕉枯萎病的報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)土地類芽孢桿菌也可用于香蕉枯萎病的防治。本研究獲得的這些生防菌，為香蕉枯萎病的生物防治提供了新的菌種資源。

本研究還發(fā)現(xiàn)，拮抗菌在平皿中對(duì)Foc的拮抗活性強(qiáng)弱與其在盆栽試驗(yàn)中的防病效果高低并不完全一致。如，在平皿中抑菌率較高的菌株Ba63（抑菌率72.65%）在盆栽試驗(yàn)中的防治效果僅為43.33%，遠(yuǎn)低于菌株Bc11的防治效果（68.89%）；同為解淀粉芽孢桿菌，菌株Ba63在平皿中抑菌率顯著高于菌株Ba02（51.32%），而在盆栽試驗(yàn)中則表現(xiàn)為菌株Ba02的防治效果（60.00%）高于Ba63（43.33%）。這一結(jié)果表明僅依靠平板對(duì)峙篩選拮抗菌存在一定的缺陷，可能無法篩選到通過誘導(dǎo)寄主抗性等機(jī)制發(fā)揮作用的微生物，而錯(cuò)失一些具有生防潛能的優(yōu)良菌株（Knudsen et al.， 1997；Daayf et al.， 2003）。因此，采取多種篩選方法相結(jié)合的手段將是獲得不同生防機(jī)制抗病微生物的有效策略。此外，這一結(jié)果也暗示了本研究篩選出的7株生防菌除產(chǎn)生抑菌物質(zhì)外可能存在其他的防病機(jī)制。有研究表明，不同種類生防菌的防病機(jī)制不同，拮抗菌在平皿上表現(xiàn)出的拮抗活性主要體現(xiàn)了菌株分泌抑菌物質(zhì)的活性與能力，然而在盆栽防治試驗(yàn)中，防病效果不僅與抑菌物質(zhì)相關(guān)，還與菌株的定殖能力、生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)力及誘導(dǎo)宿主抗病性等能力相關(guān)（Singh， 2014）。而多種防病機(jī)制不同的生防菌聯(lián)合應(yīng)用可能具有更好的防病效果（Parnell et al.， 2016）。本研究篩選出的7株生防菌的防病機(jī)制可能存在差異，具有復(fù)配增效和增加菌劑防效穩(wěn)定性的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

本研究從不同作物的根圍土壤中分離篩選出7株對(duì)Foc具有較強(qiáng)拮抗活性的細(xì)菌，通過形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化測(cè)定及16S rDNA序列分析，7株拮抗Foc細(xì)菌分別鑒定為解淀粉芽孢桿菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌和土地類芽孢桿菌。其中，土地類芽孢桿菌為香蕉枯萎病生防菌家族的新成員，為香蕉枯萎病的防治提供了新的生防菌資源。同時(shí)，分屬于3個(gè)種屬的拮抗菌株可作為研制香蕉枯萎病生防菌劑的候選菌株資源，在后續(xù)開發(fā)抗病復(fù)合菌劑方面具有良好的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）