鈣鎂葉面肥緩解妃子笑荔枝果肉退糖現(xiàn)象的呼吸機理

杜婧加 彭俊杰 陳甜甜 稅賢 廖海枝 林曉凱 周開兵

摘要：【目的】探討葉面噴施鈣鎂肥對妃子笑荔枝果肉糖酵解（EMP）—三羧酸循環(huán)（TCA）途徑呼吸速率的影響，為荔枝生產(chǎn)提供理論參考?！痉椒ā吭O(shè)置以樹冠噴布0.3% CaCl2水溶液（Ca）、0.3% MgCl2水溶液（Mg）、0.3% CaCl2+0.3% MgCl2水溶液（Ca+Mg）的3組處理，以樹冠噴布清水為對照（CK），測定、比較不同發(fā)育期荔枝果肉風(fēng)味品質(zhì)主要指標、EMP-TCA途徑呼吸速率及其關(guān)鍵酶活性的動態(tài)變化?！窘Y(jié)果】荔枝果肉可溶性糖含量在35～56 d呈上升趨勢，在花后63 d之后，除Ca+Mg處理的果肉可溶性糖含量未顯著下降（P>0.05，下同）而緩解退糖現(xiàn)象外，其他處理均出現(xiàn)退糖現(xiàn)象。所有處理的果肉可滴定酸含量在采收期前后均無顯著變化，且相互間無顯著差異；Ca處理和Ca+Mg處理的EMP途徑呼吸速率顯著低于Mg處理和CK（P<0.05，下同），而在TCA途徑呼吸速率上，Ca+Mg處理顯著低于Ca處理，故Ca+Mg處理通過抑制EMP-TCA途徑呼吸速率進而抑制果肉總呼吸速率；采收期前后，Ca+Mg處理的磷酸已糖異構(gòu)酶（GPI）、琥珀酸脫氫酶（SDH）和蘋果酸酶（NADP-ME）等活性均顯著低于CK；Ca處理對GPI活性具有抑制作用，對PDC活性呈現(xiàn)促進作用；Ca處理和Mg處理的NADP-ME活性顯著高于Ca+Mg處理和CK?！窘Y(jié)論】Ca+Mg處理通過抑制妃子笑荔枝果肉GPI、SDH和NADP-ME活性而分別抑制EMP和TCA途徑，進而降低EMP-TCA途徑有氧呼吸速率，減少果肉糖分呼吸損耗，從而減緩果肉退糖現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：妃子笑荔枝；鈣鎂葉面肥；糖酵解（EMP）；三羧酸循環(huán)（TCA）；呼吸速率；可溶性糖；可滴定酸

中圖分類號：S667.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2023）02-0356-09

Abstract：【Objective】The effects of spraying the calcium and magnesium foliar fertilizer on the respiration rate of Feizixiao litchi pulp glycolysis（EMP）-tricarboxylic acid cycle（TCA） pathway was explored to provide reference for litchi planting. 【Method】During the period of fruit development， crowns of Feizixiao plants were sprayed with 0.3% magnesium chloride（Mg），0.3% calcium chloride（Ca） and 0.3% CaCl2+0.3% MgCl2（Ca+Mg）， and water as control（CK），indicators of pulp flavor and quality at different developmental stages， the dynamic changes of EMP-TCA pathway respiration rate and key enzyme activities were detected and compared. 【Result】The soluble sugar content of litchi pulp showed an upward trend from 35 to 56 d. After 63 d after flowering， except for the soluble sugar content of pulp treated with Ca+Mg did not decrease significantly （P>0.05， the same below）， and sugar withdrawal occurred in all other treatments. The titrata-ble acid content of all treated pulp did not change significantly before and after the harvest period， and there was no significant difference between them. The respiration rate of EMP pathway of Ca treatment and Ca+Mg treatment was significantly lower than that of Mg treatment and CK（P<0.05， the same below），while the respiration rate of TCA pathway in Ca+Mg treatment was significantly lower than that of Ca treatment，so Ca+Mg treatment inhibited the total respiration rate of pulp by inhibiting EMP-TCA respiration rate. Around the harvest time， the activities of phosphate hexose isomera-se （GPI）， succinate dehydrogenase （SDH） and malic enzyme （NADP-ME） treated with Ca+Mg were significantly lower than those treated with CK. Ca treatment inhibited GPI activity and promoted PDC activity； the activity of NADP-ME in Ca treatment and Mg treatment was significantly higher than that in Ca+Mg treatment and CK. 【Conclusion】In conclusion， Ca+Mg treatment inhibits the EMP and TCA pathways by inhibiting the GPI， SDH and NADP-ME activities of the pulp of Feizixiao litchi， thereby reducing the aerobic respiration rate of EMP-TCA and reducing the respiration loss of sugar in the pulp， thereby alleviating the sugar-dropping of the pulp.

Key words： Feizixiao litchi； foliage spraying of calcium magnesium fertilixer； glycolysis pathway（EMP）； tricarboxylic acid circulation（TCA）； respiration rate； soluble sugar； titratable acid

Foundation items： National Natural Science Foundation of China（31960570）； Hainan University World Class Discipline Construction Fund Special Project（RZZX201906）； Hainan Graduate Innovation Project（Hys2019-90）

0 引言

【研究意義】荔枝（Litchi chinensis Sonn.）產(chǎn)業(yè)是我國熱帶南亞熱帶果業(yè)主要支柱產(chǎn)業(yè)，其中，妃子笑荔枝是我國的主栽品種之一，也是海南產(chǎn)區(qū)栽培面積最大的品種，研究其果實品質(zhì)發(fā)育問題有益于促進荔枝產(chǎn)業(yè)和華南區(qū)經(jīng)濟發(fā)展（倪耀媛和吳素芬，1990）。妃子笑荔枝以果實風(fēng)味見長，但存在果皮果肉發(fā)育不同步的現(xiàn)象，即果肉含糖量最高時果皮著色不良，而果皮完全轉(zhuǎn)紅著色時，果肉衰老導(dǎo)致糖類物質(zhì)氧化分解，糖分下降，果味發(fā)澀，出現(xiàn)果肉退糖（果皮滯綠）現(xiàn)象，該問題影響了妃子笑荔枝的市場競爭力和經(jīng)濟價值（張銳等，2014；呂潤等，2021）。課題組前期的實驗結(jié)果表明，在果實生長發(fā)育期間，噴施鈣鎂混合液可減緩妃子笑荔枝果肉的退糖現(xiàn)象（周曉超等，2015），但關(guān)于其減緩?fù)颂堑拇x生理機制問題研究報道較少。因此，通過深入研究鈣鎂單一和混合葉面營養(yǎng)對妃子笑荔枝果肉呼吸作用的影響，可有助于了解果肉退糖現(xiàn)象發(fā)生時可溶性糖的去向和減緩?fù)颂菚r的呼吸代謝生理機制，可豐富和發(fā)展妃子笑荔枝果實生長發(fā)育理論，為果實著色不良的荔枝品種遺傳改良和栽培技術(shù)優(yōu)化打下理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】植物的呼吸代謝是一種復(fù)雜且強大的反應(yīng)體系，能氧化不同的碳底物，不僅能產(chǎn)生能量，還可生成碳骨架支撐蛋白質(zhì)等物質(zhì)合成（Vanlerberghe et al.，2020）。植物的呼吸途徑主要包括糖酵解（EMP）、三羧酸循環(huán)（TCA）、磷酸戊糖（PPP）和電子傳遞鏈，其中，機體能量主要由糖酵解—三羧酸循環(huán)（EMP-TCA）途徑提供（Analin et al.，2020）。在有氧條件下，EMP途徑的最終產(chǎn)物丙酮酸進入線粒體進行TCA途徑，該途徑是糖類、蛋白質(zhì)和脂肪的共同氧化途徑，同時也是與其他代謝途徑連接的樞紐，對植物體的代謝調(diào)控具有重大意義。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，油菜素內(nèi)酯（BRs）和1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）可明顯減低楊桃呼吸速率，延緩其成熟衰老（陳宇新，2017）；低鈣處理顯著抑制芒果果實的呼吸速率，提高其果實貯藏性（姚智等，2017）施用氮素可提高甜菜根部呼吸速率從而促進塊根增長（于超，2021）。課題組前期研究結(jié)果表明，鈣鎂元素是影響妃子笑荔枝糖酸含量的主要元素（蘇陽等，2015），而有機酸的積累對妃子笑荔枝果肉呼吸具有負反饋調(diào)節(jié)作用（廖海枝等，2021）。糖分是果肉內(nèi)在營養(yǎng)風(fēng)味品質(zhì)的基本構(gòu)成物質(zhì)，其在體內(nèi)的主要分解代謝方式受供氧情況的影響而存在差異，主要包括無氧氧化（EMP）、有氧氧化（TCA）、磷酸戊糖途徑（PPP）及糖原分解等，糖類物質(zhì)經(jīng)呼吸作用使果肉積累中間產(chǎn)物有機酸和釋放CO2而損耗（翁雪成和袁紅，2007）。因此，果肉糖類物質(zhì)的積累可能受呼吸作用調(diào)控影響?！颈狙芯壳腥朦c】噴施鈣鎂混合液可減緩妃子笑荔枝果肉的退糖現(xiàn)象，但是其糖分積累與呼吸代謝生理生化機理尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】在前期研究基礎(chǔ)上，通過觀測荔枝果肉可溶性糖、可滴定酸含量，EMP和TCA途徑的呼吸作用相關(guān)指標等變化，比較不同施肥處理和對照間差異，分析確定葉面鈣鎂營養(yǎng)對妃子笑荔枝果肉呼吸作用的影響特點，進一步探析鈣鎂營養(yǎng)減緩果肉退糖現(xiàn)象的生理生化機理。

1 材料與方法

1. 1 試驗地概況

采樣地點為海南省臨高縣金牌農(nóng)場五隊荔枝園（東經(jīng)109°48′，北緯19°54′），位于海南省西北部，該果園所在產(chǎn)區(qū)位于熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，其氣候特點是高溫多雨，光照充足，年平均溫23～24 ℃，年平均日照時數(shù)2175 h，年平均降水量1100～1800 mm，且雨熱同季；土壤為肥沃磚紅壤。妃子笑荔枝在該產(chǎn)地主要物候期：花期為2—3月，生理落果期為4月初開始，4月下旬進入果實膨大期，5月中旬進入果實成熟期。

1. 2 試驗設(shè)計

于2021年4月18日選擇生長勢一致且無任何不良表現(xiàn)的16年生妃子笑荔枝樹20株，分為4組，單株小區(qū)，重復(fù)5次。3個處理分別是：噴施0.3% CaCl2水溶液、0.3% MgCl2水溶液、0.3% CaCl2+0.3% MgCl2水溶液，分別簡記為Ca處理、Mg處理、Ca+Mg處理；以噴施清水為對照（CK）。假種皮包滿種子且果蒂出現(xiàn)紅色標志著荔枝果實生理落果期結(jié)束，此時開始田間葉面噴肥處理，即4月下旬開始葉面噴肥。噴肥時間為2021年4月18日（花后35 d）、4月25日（花后42 d）和5月2日（花后49 d）的上午8：00—9：00。標準參照果的選?。河?月18日分別在每株樣樹樹冠外圍間隔大約70°（以樹干為圓心）的5個位置，隨機選取生長一致且中庸的5個果實作為取樣參照果，掛牌標記。此后取樣時以標準果的平均縱徑、平均橫徑和著色狀態(tài)為參照，在樹冠外圍以相同方法選取類似大小和著色狀態(tài)的果實作為樣品果。從穩(wěn)果開始至果皮全紅時為止，即在花后35 d（4月18日）、42 d（4月25日）、49 d（5月2日）、56 d（5月9日）、63 d（5月16日）、70 d（5月23日）取果樣，每次取果25～30個，在田間放入液氮罐速凍并帶回實驗室，儲存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1. 3 測定指標及方法

果肉可溶性糖含量測定參考Wang等（2006）的方法，稍作修改：稱取0.5 g果肉，微波爐殺酶30 s，加入乙醇研磨、離心，上清液蒸干、定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后待測。將果糖、葡萄糖與蔗糖含量之和作為可溶性總糖含量，使用Waters2695高效液相色譜儀測定糖分含量。采用糖酸儀進行可滴定酸含量測定，測定時果汁稀釋至50倍，以檸檬酸作為計算標準進行檢測。

果肉EMP-TCA途徑呼吸速率使用便攜式O2/CO2頂空分析儀（Dansensor CheckPoint3）進行測定（Sivakumar and Korsten， 2010），單位為mL CO2/（kg·h）（Wang et al.，2010）；使用10 mmol/L氟化鈉作為EMP途徑專一性抑制劑，使用50 mmol/L丙二酸作為TCA途徑專一性抑制劑。測定時間均在上午10：00左右，環(huán)境溫度維持在28 ℃左右，每次先測得樣品總呼吸速率，真空滲入抑制劑后測定各途徑的剩余呼吸速率，由總呼吸速率減去各途徑剩余呼吸速率得出單一途徑呼吸速率觀測值（史青純，2009；宋叢叢，2021）。

磷酸己糖異構(gòu)酶（GPI）和丙酮酸激酶（PK）酶液提取參考何亞輝（2007）、史青純（2009）的方法，略作修改。稱取果肉2 g，冰浴環(huán)境下加入Tris-HCl緩沖液，研磨、離心，取上清液，用酶標儀在520 nm波長下測定吸光度（OD值）。以果糖為標準物通過標準曲線計算樣品酶活性。

琥珀酸脫氫酶（SDH）和丙酮酸脫氫酶（PDC）參考Zhang等（2008）、宋叢叢（2021）的方法制備酶液。稱取2 g荔枝果肉，加入含有0.005 mol/L EDTA、0.5 mol/L蔗糖、1 mg/mL牛血清蛋白、0.05 mol/L PBS緩沖液的提取介質(zhì)，冰浴后研磨。測定酶活性前酶液與反應(yīng)液1∶1混勻，在30 ℃環(huán)境下保溫10 min，在600 nm測定吸光度的變化。通過標準曲線計算樣品中各酶活性。

蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）和蘋果酸酶（NADP-ME）等活性測定參考羅安才等（2003）、史青純（2009）的方法。稱取2 g荔枝果肉，加入Tris-HCl緩沖液，冰浴研磨后離心取上清液備用；上清液加入由0.2 mol/L Tris-HCl、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚、5 mol/L抗壞血酸合成的反應(yīng)液，定容至5 mL。參考Sadka等（2000）的方法測定酶活，略有改動。用酶標儀在340 nm波長下測定各酶吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中各酶活性（Sadka et al.，2000；羅安才等，2003）。

1. 4 統(tǒng)計分析

采用SAS 9.1.3對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用ANOVA過程作方差分析，DUNCAN法作多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 妃子笑荔枝果肉可溶性糖和可滴定酸含量變化

2. 1. 1 可溶性糖 如圖1所示，所有處理的荔枝果肉可溶性糖含量均在前期呈上升趨勢，后期則存在一定差異。其中，Ca處理上升至49 d后無明顯變化，Mg處理和CK在花后56 d達峰值；除Ca+Mg處理，CK和Mg處理均出現(xiàn)退糖現(xiàn)象。花后42 d，Ca+Mg處理顯著最高（P<0.05，下同），而Mg處理顯著最低；花后56 d，Ca處理顯著最低；至花后70 d，Ca+Mg處理顯著最高，而其他處理較56 d時均呈現(xiàn)下降或平緩趨勢。綜上，Ca+Mg處理具有促進可溶性糖積累的效果，且在花后56 d之后未出現(xiàn)退糖現(xiàn)象，其他處理均出現(xiàn)退糖現(xiàn)象。

2. 1. 2 可滴定酸 如圖2所示，各處理的荔枝果肉可滴定酸含量動態(tài)變化均呈L形，即花后35～56 d急劇下降，花后56 d之后無明顯變化?；ê?2 d，Ca+Mg處理的果肉可滴定酸含量顯著低于其他處理；花后49 d，Ca處理顯著最高；其余時間各處理間無顯著差異。由此可見，各處理在試驗前期果肉可滴定酸積累量均呈降低趨勢，Ca處理積累量相對較高，在后期則各處理間的果肉可滴定酸含量無顯著差異（P>0.05，下同），說明妃子笑荔枝果實成熟時果肉風(fēng)味品質(zhì)主要決定于果肉可溶性糖含量。

2. 2 妃子笑荔枝果肉不同途徑呼吸速率變化

2. 2. 1 總呼吸速率 如圖3所示，各處理的荔枝果肉總呼吸速率均在花后56 d之前上升，之后Ca處理和Ca+Mg處理一直下降，Mg處理和CK均在63 d上升至最高值后下降?；ê?5 d，各處理間差異不顯著；花后42 d，Mg處理和Ca處理顯著高于CK和Ca+Mg處理，前二者之間和后二者之間無顯著差異；花后49 d，Mg處理顯著最高，其余處理間無顯著差異；花后63 d，各施肥處理的總呼吸速率排序依次為Mg>Ca>Ca+Mg，CK與Mg處理和Ca處理間差異不顯著；花后70 d，Mg處理顯著高于其余處理，Ca+Mg處理顯著最低，Ca處理與CK間無顯著差異。綜上，Mg處理對總呼吸速率表現(xiàn)出一定的促進作用，而Ca+Mg處理呈現(xiàn)抑制作用。

2. 2. 2 MEP途徑呼吸速率 如圖4所示，各處理的荔枝果肉EMP途徑呼吸速率動態(tài)變化趨勢存在明顯差異。其中，CK的果肉呼吸速率呈上升—下降—上升的變化趨勢；Ca處理的果肉呼吸速率在前期上升，至花后49 d之后下降，后無明顯變化；Mg處理和Ca+Mg處理的果肉呼吸速率上升至花后42 d之后下降，但前者至花后63 d上升，后者至花后49 d之后上升?；ê?9～56 d、花后70 d，CK均高于施肥處理；花后49 d，Mg處理與Ca處理間差異不顯著，且顯著高于Ca+Mg處理；花后56和70 d，Ca處理與Ca+Mg處理間差異不顯著，且顯著低于Mg處理；花后63 d，Ca處理和Ca+Mg處理顯著低于CK和Mg處理，前兩者和后兩者之間無顯著差異。綜上，施鈣鎂肥處理對EMP途徑的呼吸速率均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，且Ca+Mg處理抑制作用最明顯，Ca處理的抑制作用次之。

2. 2. 3 TCA途徑呼吸速率 如圖5所示，各處理的荔枝果肉TCA途徑呼吸速率動態(tài)變化特點不同。其中，CK的TCA途徑呼吸速率呈現(xiàn)2次上升—下降的交替變化趨勢，在花后70 d上升；Ca處理和Ca+Mg處理均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢；Mg處理在前期上升，至花后56 d后小幅下降，至末期回升。花后42 d，4個處理按照CK、Ca+Mg處理、Mg處理、Ca處理依次遞減；花后49 d以后，Ca處理顯著高于其他處理；Ca+Mg處理的TCA途徑呼吸速率在花后49 d和63 d呈現(xiàn)次高；花后49～56 d，Mg處理顯著低于Ca+Mg處理，花后56 d顯著最低；花后63 d，CK顯著最低，且Mg處理與Ca+Mg處理間無顯著差異；花后70 d，Ca+Mg處理的TCA途徑呼吸速率較低，Ca處理和Mg處理顯著高于Ca+Mg處理，CK與Ca+Mg處理間差異不顯著。綜上所述，不同處理對TCA途徑呼吸速率的影響不同；Ca處理和Mg處理在前期對TCA途徑呼吸速率表現(xiàn)出抑制作用，前者和后者分別在中后期和末期表現(xiàn)出一定的促進作用；在花后56 d前后，Ca+Mg處理對TCA途徑呈現(xiàn)抑制作用。說明Ca+Mg處理在成熟期前后抑制TCA途徑是其減緩?fù)颂乾F(xiàn)象的原因之一，Ca處理和Mg處理仍然呈退糖現(xiàn)象原因之一可能是TCA途徑在后期增強。

2. 3 妃子笑荔枝果肉呼吸作用相關(guān)酶活性變化

2. 3. 1 GPI活性 如圖6所示，Ca+Mg處理的GPI活性呈現(xiàn)上升—下降—平緩趨勢；Ca處理呈現(xiàn)上升—下降的交替變化趨勢。其中，花后42 d，Ca+Mg處理與Ca處理差異不顯著，Mg處理與CK差異不顯著，前二者顯著高于后二者；花后49 d，Ca+Mg處理顯著高于CK和Ca處理，并與Mg處理差異不顯著，Ca處理與CK差異不顯著；花后56 d，Ca處理與CK差異不顯著，Mg處理與Ca+Mg處理差異不顯著，前二者顯著高于后二者；花后63 d，施鈣鎂肥處理均顯著低于CK，且3個處理間差異不顯著；花后70 d，Mg處理顯著最高，其余處理間差異不顯著。綜上所述，Ca處理和Ca+Mg處理在前期促進GPI活性，在后期Ca+Mg處理呈現(xiàn)抑制酶活性作用；Mg處理則在花后49和70 d起促進酶活性作用，在其他時間也抑制酶活性。說明Ca+Mg處理在完全成熟期抑制EMP途徑是通過抑制GPI活性而達到。

2. 3. 2 PK活性 如圖7所示，Mg處理、Ca+Mg處理和CK的荔枝果肉PK活性均呈現(xiàn)上升—下降的交替變化趨勢，Ca處理在后期有所上升。其中，花后42 d，各處理按照Mg處理、Ca處理、Ca+Mg處理、CK依次遞減；花后56 d，Ca處理的PK活性顯著最高，其他處理相互間差異不顯著；花后63 d，Ca處理的PK活性顯著最低，其余處理間差異不顯著；花后70 d，Ca+Mg處理的PK活性顯著高于其他處理，其他處理相互間差異不顯著?？傊?，花后49 d之前，施鈣鎂肥處理均促進了PK活性；Ca處理呈現(xiàn)在中期促進和在末期抑制PK活性的趨勢，Ca+Mg處理在采收前后則有一定的促進作用。說明PK不是Ca+Mg處理抑制TCA途徑的關(guān)鍵酶。

2. 3. 3 PDC活性 如圖8所示，不同處理的荔枝果肉PDC活性動態(tài)變化趨勢差異明顯。其中，CK和Ca處理呈2次下降—上升的交替變化趨勢；Ca+Mg處理在花后42 d后上升，至56 d后下降；Mg處理呈上升—下降—上升的變化趨勢，且全程顯著最高；花后42～63 d，Ca、Ca+Mg、CK相互間差異不顯著，Mg處理顯著最高；花后70 d，Ca處理和Mg處理顯著高于CK和Ca+Mg處理，前二者和后二者分別差異不顯著。綜上，Mg處理對PDC活性呈促進作用，Ca處理只在末期對PDC活性具有促進作用，Ca+Mg處理未表現(xiàn)出明顯抑制作用。說明PDC酶活性并非是是Ca+Mg處理抑制TCA途徑的主要原因。

2. 3. 4 SDH活性 如圖9所示，各處理的荔枝果肉SDH活性具有不同的動態(tài)變化趨勢。其中，CK呈上升—下降—上升的趨勢；Ca處理呈2次上升—下降的交替過程；Mg處理在前期無明顯變化，后期呈上升趨勢；Ca+Mg處理呈現(xiàn)上升—下降的趨勢?；ê?2 d，Ca處理顯著高于其他處理，其他處理間無顯著差異；花后49 d，施鈣鎂肥處理均顯著低于CK，且按照CK、Ca、Ca+Mg和Mg處理依次遞減；花后56 d，Ca處理的酶活性顯著最高，Mg處理顯著最低，Ca+Mg處理和CK位于中間且差異不顯著；花后63 d，Ca+Mg處理與Mg處理差異不顯著，Ca處理與CK差異不顯著，前二者顯著高于后二者；花后70 d，Ca+Mg處理顯著低于其他處理，其他處理相互間差異不顯著。總之，Ca處理在花后35～56 d呈促進酶活趨勢；Mg處理在中期抑制酶活性，自花后63 d表現(xiàn)出促進作用；Ca+Mg處理在采收期活性降低則可能是Ca+Mg處理抑制TCA途徑的原因之一。

2. 3. 5 NAD-MDH活性 如圖10所示，各處理的荔枝果肉NAD-MDH活性動態(tài)變化趨勢存在明顯差異。其中，CK和Ca+Mg處理呈2次下降—上升交替過程；Ca處理呈近似L形的下降趨勢；Mg處理呈下降—上升—下降的趨勢。花后42 d，Ca處理的果肉NAD-MDH活性顯著最高，Ca處理和Mg處理顯著高于CK和Ca+Mg處理，后二者間差異不顯著；花后49 d，Ca處理的果肉NAD-MDH活性顯著最低，其余2個施肥處理與CK間差異不顯著；花后56 d，Mg處理和Ca+Mg處理顯著高于CK和Ca處理，前二者和后二者間分別差異不顯著；花后63 d，CK的果肉NAD-MDH活性顯著最低，3個施肥處理間差異不顯著；花后70 d，Ca+Mg處理顯著高于其他處理，CK又顯著高于Ca處理和Mg處理，Ca處理與Mg處理間則差異不顯著。綜上所述，Ca處理在前期對NAD-MDH酶活性有促進作用，后期呈現(xiàn)抑制作用；Ca+Mg處理在中、后期呈現(xiàn)出促進酶活性的作用。說明NAD-MDH在Ca+Mg處理抑制TCA途徑中不是關(guān)鍵酶。

2. 3. 6 NADP-ME活性 如圖11所示，各處理的荔枝果肉NADP-ME活性動態(tài)變化趨勢明顯不同。其中，Ca處理和CK呈2次上升—下降的交替變化趨勢；Mg處理前期呈下降趨勢，至花后56 d上升，在末期下降?；ê?2 d，Ca處理的果肉NADP-ME活性顯著最高，Ca+Mg處理顯著低于其他處理，Mg處理與CK差異不顯著；花后49 d，Ca+Mg處理顯著最高，CK次之，Ca處理與Mg處理差異不顯著；花后56 d，Ca處理顯著最高，Mg處理次之，Ca+Mg處理和CK最低且兩者間差異不顯著；花后63 d，各處理間差異顯著，且按照Mg處理、Ca處理、CK和Ca+Mg處理的順序遞減；花后70 d，Mg處理顯著最高，Ca+Mg處理與Ca處理和CK差異不顯著，Ca處理與CK差異顯著。總之，Mg處理前期抑制但后期促進酶活性，Ca處理整體促進酶活，Ca+Mg處理在56～63 d抑制酶活。說明Ca+Mg處理在采收期前抑制NADP-ME活性是其抑制TCA途徑呼吸速率原因之一。

3 討論

本研究結(jié)果表明，Ca+Mg處理減緩了妃子笑荔枝果肉的退糖現(xiàn)象，而Ca處理和Mg處理則與CK一樣仍然出現(xiàn)退糖現(xiàn)象，該結(jié)果與本課題組之前在不同試驗點和不同年份所取得的試驗結(jié)果（張銳等，2014；周曉超等，2015；王展等，2017）一致。說明葉面噴施鈣鎂混合肥可減緩妃子笑荔枝果肉退糖現(xiàn)象，因而可作為改良的施肥技術(shù)在生產(chǎn)實踐中加以應(yīng)用。

植物的呼吸代謝途徑有多種方式，EMP作為完全有氧呼吸的第一步，是將葡萄糖和糖原降解為丙酮酸并伴隨ATP產(chǎn)生的一系列反應(yīng)（何亞輝，2007），呼吸作用消耗糖分的多少主要取決于EMP呼吸速率的高低。本研究結(jié)果表明Ca+Mg處理和Ca處理在果實采前均抑制EMP呼吸速率，這為二者減緩果肉退糖現(xiàn)象出現(xiàn)提供了可能性。GPI催化6-磷酸葡萄糖的異構(gòu)化反應(yīng)，催化其轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸果糖，是EMP途徑的關(guān)鍵酶，PK催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，是EMP途徑的最后一步不可逆反應(yīng)，這2種酶普遍被認為是EMP途徑的限速酶（李立梅等，2018），植物呼吸中的EMP途徑主要受GPI和NaF的調(diào)節(jié)（鄭集和陳鈞輝，2003）。本研究結(jié)果表明，在果實成熟前后，Ca+Mg處理抑制了荔枝果肉GPI活性，Ca處理次之，從而導(dǎo)致二者在花后63 d之后EMP途徑呼吸速率降低。在EMP酶系中，PK通過將ADP和PEP轉(zhuǎn)化為ATP和丙酮酸以催化糖酵解途徑的末端反應(yīng)，在糖酵解的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用（宋叢叢，2021）。同時，Ca處理具有在中期促進和后期抑制PK酶活性的趨勢，Ca+Mg處理在末期則呈現(xiàn)一定的促進作用，說明影響EMP途徑的最關(guān)鍵限速酶是GPI。綜上所述，Ca+Mg處理和Ca處理通過在果實采前抑制GPI活性而抑制EMP呼吸速率。

呼吸作用的第二大途徑就是TCA途徑，是需氧生物體內(nèi)普遍存在的呼吸代謝途徑，在有氧條件下，利用糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸，在丙酮酸脫氫酶酶系的催化下氧化脫羧，進行徹底的氧化分解。該途徑是三大營養(yǎng)素（糖類、脂質(zhì)、氨基酸）的最終代謝通路和共同氧化途徑，在上述過程中產(chǎn)生的部分中間產(chǎn)物，是合成其他許多重要物質(zhì)的前體，并起著與其他代謝途徑相互聯(lián)系、相互轉(zhuǎn)變的紐帶作用（李冬彪，2017）。TCA途徑的第1個酶是線粒體PDC，其將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。SDH是參與TCA呼吸通路和線粒體電子傳輸鏈的唯一酶，先后催化琥珀酸氧化為富馬酸，將泛醌（Q）還原為泛醇（QH2）（Chumyam et al.， 2016）。NAD-MDH也是TCA中的關(guān)鍵酶，NAD-MDH催化蘋果酸仲醇基脫氫氧化成羰基，生成草酰乙酸。本研究結(jié)果表明，Ca+Mg處理在采收期抑制SDH和NADP-ME活性；Ca處理和Mg處理則在末期促進PDC和NADP-ME活性，抑制NAD-MDH酶活性，說明本文影響TCA途徑最關(guān)鍵的限速酶可能是SDH和NADP-ME。Ca+Mg處理通過抑制SDH和NADP-ME等活性而抑制TCA途徑，引起該途徑呼吸速率降低，這與前人的研究結(jié)果（李霞，2004；李宏博，2005）基本一致。相關(guān)研究也表明，NO與SDH發(fā)生作用，通過抑制琥珀硫激酶和琥珀酸脫氫酶活性控制TCA途徑（馬春媚，2013）。有研究表明，PDC活性會直接影響進入TCA途徑物質(zhì)的多少，進而控制CO2釋放量，最終影響呼吸速率（李熙萌等，2016）。Ca處理可能通過增強PDC活性而促進TCA途徑，存在促使呼吸速率升高的現(xiàn)象。綜上，Ca+Mg處理通過抑制果肉SDH和NADP-ME酶活性而抑制果肉TCA途徑呼吸速率，Ca處理通過在果肉成熟期促進SDH和NADP-ME酶活性，并在采收期促進PDC活性進而提高果肉呼吸速率，使得該途徑呼吸速率顯著高于Ca+Mg處理。

由于植物呼吸作用主要以EMP-TCA途徑為主，其決定總呼吸速率的高低（張強，2020）?；谏鲜鲇懻摽芍?，Ca+Mg處理通過抑制果肉GPI及SDH和NADP-ME等活性，分別抑制果肉EMP和TCA途徑，進而抑制EMP-TCA途徑完全有氧呼吸作用，因此出現(xiàn)本研究中Ca+Mg處理果肉總呼吸速率降低的結(jié)果，因而減少了果肉糖分的損耗而減緩果肉退糖現(xiàn)象；Ca處理雖然在果實采前抑制EMP，但其同時促進了TCA途徑，因而與Mg處理和CK均未降低總呼吸速率，從而引起果肉退糖現(xiàn)象。

4 結(jié)論

妃子笑荔枝葉面噴施0.3%的鈣鎂混合肥可減緩其果肉退糖現(xiàn)象，原理是Ca+Mg混合葉面處理通過抑制果肉主要呼吸途徑的呼吸速率進而減少果肉糖分消耗，從而減緩?fù)颂乾F(xiàn)象。生產(chǎn)中鈣鎂混合肥可作為妃子笑荔枝果實品質(zhì)發(fā)育調(diào)節(jié)的改良施肥技術(shù)加以采用。

參考文獻：

陳宇新. 2017. 油菜素內(nèi)酯延緩楊桃品質(zhì)劣變的效果及其對呼吸代謝和內(nèi)源激素變化的影響［D］. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué). ［Chen Y X. 2017. Exogenous application of BRs to delay carambola fruit quality deterioration and its effects on respiratory metabolism and endogenous hormone changes［J］. Guangzhou： South China Agricultural University.］

何亞輝. 2007. 丙酮酸脫氫酶系測活方法的比較研究與創(chuàng)新［D］. 武漢：華中師范大學(xué). ［He Y H. 2007. Comparision and development of measuring methods for Pyruvate Dehydrogenase complex［D］. Wuhan：Central China Normal University.］

李冬彪. 2017. 網(wǎng)紋甜瓜幼苗光合作用和根呼吸代謝對根際高CO2脅迫后恢復(fù)的響應(yīng)［D］. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué). ［Li D B. 2017. Responses of photosynthesis and root respiratory metabolism of netted muskmelon to root-zone high CO2 concentration restoration after stress［D］. Shenyang： Shenyang Agricultural University.］

李宏博. 2005. GA對變溫層積條件下解除遼東楤木種子休眠的作用及其機制研究［D］. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué). ［Li H B. 2005. The research on the effect of GA on breaking dormancy of Aralia elate seed and the mechanism of that under altering temperature stratification［D］. Shenyang： Shenyang Agricultural University.］

李立梅，李鑫，趙秀香，毛赫，孫景花，吳元華. 2018. 西瓜感染黃瓜綠斑駁花葉病毒后糖分代謝與倒瓤的關(guān)系［J］. 植物保護學(xué)報，45（3）：447-454. ［Li L M， Li X， Zhao X X， Mao H， Sun J H， Wu Y H. 2018. The relationships between sugar metabolism and blood-flesh of watermelon infected with cucumber green mottle mosaic virus［J］. Journal of Plant Protection， 45（3）：447-454.］doi：10. 13802/j.cnki.zwbhxb.2018.2016208.

李熙萌，楊瓊，李征珍，劉海鷗，馮金朝. 2016. 胡楊（Populus euphratica）葉片呼吸作用對地下水埋深的響應(yīng)［J］. 生態(tài)科學(xué)，35（3）：29-36. ［Li X M， Yang Q， Li Z Z， Liu H O， Fen J Z. 2016. Response of foliage respiratory cha-racteristics of Populus euphratica to underground water table［J］. Ecological Sciene，35（3）：29-36.］ doi：10.14108/j.cnki.1008-8873.2016.03.005.

李霞. 2004. 呼吸代謝對甜櫻桃自然休眠的調(diào)控及破眠技術(shù)研究［D］. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué). ［Li X. 2004. Control of respiratory metabolism on sweat cherry dormancy and studies on technical of dormancy release［D］. Taian： Shan-dong Agricultural University.］

廖海枝，林曉凱，楊成坤，杜婧加，彭俊杰，周開兵. 2021. 鈣鎂葉面肥對‘妃子笑荔枝果肉檸檬酸積累的影響［J］. 熱帶作物學(xué)報，42（12）：3537-3544. ［Liao H Z，Lin X K，Yang C K，Du J J，Peng J J，Zhou K B. 2021. Effects of foliar calcium and magnesium fertilizer on citric acid accumulation of ‘Feizixiao litchi fruit［J］. Chinese Journal of Tropical Crops，42（12）：3537-3544.］ doi：10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.021.

羅安才，楊曉紅，鄧英毅，李純凡，向可術(shù)，李道高. 2003. 柑橘果實發(fā)育過程中有機酸含量及相關(guān)代謝酶活性的變化［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，36（8）：941-944. ［Luo A C， Yang X H， Deng Y Y， Li C F， Xiang K S， Li D G. 2003. Organic acid concentrations and the relative enzymatic changes during the development of citrus fruits［J］. Scientia Agricultura Sinica，36（8）：941-944.］

呂潤，梁彩紅，鄒海平，李偉光，白蕤. 2021. 海南妃子笑荔枝精細化農(nóng)業(yè)氣候區(qū)劃研究［J］. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，41（12）：117-122. ［Lü R， Liang C H， Zou H P， Li W G， Bai R. 2021. Precise agricultural climate regional planning of litchi Feizixiao in Hainan［J］. Chinese Journal of Tropical Agriculture， 41（12）：117-122.］ doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2021.12.018.

馬春媚. 2013. 一氧化氮對桃果實三羧酸循環(huán)相關(guān)酶活性及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響［D］. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué). ［Ma C M. 2013. Effect of nitric oxide on activities and structure of enzymes in tricarboxylic acid cycle［D］. Taian：Shandong Agricultural University.］

倪耀媛，吳素芬. 1990. 荔枝栽培［M］. 北京：農(nóng)業(yè)出版社：8-9. ［Ni Y Y， Wu S F.1990. Litchi cultivation［M］. Beijing： China Agriculture Press： 8-9.］

史青純. 2009. 外源水楊酸處理對采后黃冠梨果實呼吸途徑的影響［D］. 保定： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué). ［Shi Q C. 2009. Effects of salicylic acid on respiration pathway of postharvest Huang-guan pear（Pyrus bretschneideri Rehd.）［D］.Baoding：Agricultural University of Hebei.］

宋叢叢. 2021. NO處理對不同肉質(zhì)桃果實冷藏過程中呼吸作用的影響［D］. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院. ［Song C C. 2021. Effects of NO treatment on the respiration of different fleshy peach fruit during cold storage［D］. Beijing： Chinese Academy of Agriculture Scienses.］ doi：10.27630/d.cnki.gznky.2021.000557.

蘇陽，周曉超，高丹，周開兵. 2015. ‘妃子笑荔枝果肉中主要風(fēng)味物質(zhì)與鉀鈣鎂含量的關(guān)系［J］. 熱帶作物學(xué)報，36（6）：1131-1135. ［Su Y，Zhou X C，Gao D，Zhou K B. 2015. Studies on the relationship between the main flavor components and the contents of K，Ca and Mg in flesh of Feizixiao litchi（Litchi chinensis Sonn. cv Feizi-xiao）［J］. Chinese Journal of Tropical Crops，36（6）：1131-1135.］ doi：10.3969/j.issn.1000-2561.2015.06.019.

王展，李世軍，袁孟玲，周開兵. 2017. 葉面噴施鎂肥對妃子笑荔枝果皮著色及鉀鈣鎂含量的影響［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報， 48（5）：854-860. ［Wang Z， Li S J， Yuan M L， Zhou K B. 2017. Effects of magnesium foliar application on pericarp coloring of Litchi chinensis Sonn. cv. Feizixiao and contents of potassium， calcium and magnesium in pericarp［J］. Journal of Southern Agriculture，48（5）：854-860.］ doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2017.05.016.

翁雪成，袁紅. 2007. 蒽酮—硫酸法測定荔枝核中可溶性多糖含量［J］. 杭州師范學(xué)院學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），27（2）：107-108. ［Weng X C， Yuan H. 2007. Determination of soluble polysaccharide content in litchi kernel by anthrone-sulfuric acid method［J］. Journal of Hangzhou Teachers College （Medical Edition），27（2）：107-108.］

姚智，李華東，白亭玉，康專苗，王藝蓉，仇海威，林電. 2017. 葉施鈣肥對芒果果實呼吸、乙烯釋放及礦質(zhì)元素含量的影響［J］. 中國土壤與肥料，（2）：95-101. ［Yao Z， Li H D， Bai T Y， Kang Z M， Wang Y R， Qiu H W， Lin D. 2017. Effect of foliar application of calcium fertilizer on respiration，ethylene release and mineral contents of mango fruit［J］. Soil and Fertilizer Sciences in China，（2）：95-101.］ doi：10. 11838/sfsc.20170215.

于超. 2021. 呼吸代謝對甜菜塊根生長的作用機理研究［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué). ［Yu C. 2021. Effects me-chanism of respiratory metabolism on taproot growth in sugar beet（Beta vulgaris L.）［D］. Hohhot： Inner Mongolia Agricultural University.］ doi：10.27229/d.cnki.gnmnu. 2021.000023.

張強. 2020. 鈣與1-MCP調(diào)控甜瓜后熟軟化機理及近冰溫貯藏技術(shù)研究［D］. 烏魯木齊：新疆大學(xué). ［Zhang Q. 2020. Mechanism of calcium and 1-MCP regulating post-ripe-ning softening and near freezing temperature storage technology of melon［D］. Urumqi： Xinjiang University.］ doi：10.27429/d.cnki.gxjdu.2020.001434.

張銳，韓麗婷，王娟，周開兵. 2014. 兩個荔枝品種果皮著色和果肉糖酸積累特點的比較［J］. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），43（4）：374-378. ［Zhang R， Han L T，Wang J，Zhou K B. 2014.The comparison of the differences in pericarp colouring and accumulations of sugar and acid in flesh between two litich cultivars［J］. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University（Natural Science Edition），43（4）：374-378.］ doi：10.13323/j.cnki.j.fafu（nat.sci.）.2014.04.010.

鄭集，陳鈞輝. 2003. 普通生物化學(xué)［M］. 第3版. 北京： 高等教育出版社. ［Zheng J， Chen J H. 2003. General biochemistry［M］. The 3rd Edition. Beijing： Higher Education Press.］

周曉超，蘇陽，張銳，周開兵. 2015. 葉面噴布鉀、鈣和鎂肥對妃子笑荔枝果皮著色的調(diào)節(jié)效果［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，28（4）：1713-1718. ［Zhou X C，Su Y，Zhang R，Zhou K B. 2015. Effects of K，Ca and Mg applied in foliar nutrients on pericarps coloring of Litchi chinensis Sonn. cv. Feizi-xiao［J］. Southwest China Journal of Agriculture Sciences，28（4）：1713-1718.］ doi：10.16213/j.cnki.scjas.2015.04.056.

Analin B， Mohanan A， Bakka K， Challabathula D. 2020. Cytochrome oxidase and alternative oxidase pathways of mitochondrial electron transport chain are important for the photosynthetic performance of pea plants under salinity stress conditions［J］. Plant Physiology and Biochemistry，154：248-259. doi：10.1016/j.plaphy.2020.05.022.

Chumyam A， Shank L， Uthaibutra J， Saengnil K. 2016. Effects of chlorine dioxide on mitochondrial energy level and redox status of ‘Daw longan pericarp during storage［J］. Postharvest Biology and Technology，116：26-35. doi：10.1016/j.postharvbio.2016.01.002.

Sadka A， Dahan E， Cohen L， Marsh K B. 2000. Aconitase activity and expression during the development of lemon fruit［J］. Physiologia Plantarum，108（3）：255-262. doi：10.1034/j.1399-3054.2000.108003255.x.

Sivakumar D， Korsten L. 2010. Fruit quality and physiological responses of litchi cultivar McLeans Red to 1-methylcyclopropene pre-treatment and controlled atmosphere storage conditions［J］. LWT-Food Science and Technology，43（6）：942-948. doi：10.1016/j.lwt.2010.02.001.

Vanlerberghe G C，Dahal K，Alber N? A，Chadee A. 2020. Photosynthesis，respiration and growth：A carbon andenergy balancing act for alternative oxidase［J］. Mitochond-rion， 52：197-211. doi：10.1016/j.mito.2020.04.001.

Wang H C， Huang H B， Huang X M，Hu Z Q. 2006. Sugar and acid compositions in the arils of Litchi chinensis Sonn.：Cultivar differences and evidence for the absence of succinic acid［J］. Journal of Horticultural Science & Biotechnology，81（1）：57-62. doi：10.1080/14620316.2006. 11512029.

Wang Y F， Wang P， Xia J D， Yu T， Lou B G， Wang J，Zheng X D. 2010. Effect of water activity on stress tole-rance and biocontrol activity in antagonistic yeast Rhodosporidium paludigenum［J］. International Journal of Food Microbiology， 143（3）： 103-108. doi：10.1016/j.ijfoodmicro.2010.07.035.

Zhang Y H， Wang Z M， Huang Q，Shu W. 2008. Phosphoenolpyruvate carboxylase activity in ear organs is related to protein concentration in grains of winter wheat［J］. Journal of Cereal Science，47（12）：386-391. doi：10.1016/j.jcs.2007.04.011.

（責(zé)任編輯 鄧慧靈）