分枝(瓜)列當(dāng)寄生煙草過程中轉(zhuǎn)移miRNA篩選及其功能預(yù)測(cè)

孫 暢,姚兆群,劉倩倩,卞鵬軒,張學(xué)坤,趙思峰

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 832003)

microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性長(zhǎng)度約為18～24 nt的非編碼單鏈RNA分子,已有大量文獻(xiàn)表明其在植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及脅迫響應(yīng)等方面都發(fā)揮著重要調(diào)控作用,甚至可以跨界調(diào)控其他物種基因的表達(dá)[1-4]。Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)棉花miR159和miR166在感染黃萎病菌后轉(zhuǎn)移至大麗輪枝菌(V.dahliaeKleb)中,通過結(jié)合和沉默與毒力相關(guān)的蛋白HIC-15(異毛菌素C-15羥化酶)和CLP-1(Ca2+半胱氨酸蛋白酶)增強(qiáng)棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性。Wang等[6]研究表明小麥條銹病菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)Pst-milR1在侵染時(shí)轉(zhuǎn)移至宿主體內(nèi),通過結(jié)合Pr2參與跨域RNA干擾從而降低宿主抗性。寄生性植物及其寄主之間通過吸器連接也存在miRNAs的交流,菟絲子(Cuscuta)作為全寄生性寄生植物,因其寄主范圍廣泛,其與寄主之間的miRNAs交流研究較多,菟絲子與擬南芥、煙草、番茄等寄主之間均發(fā)現(xiàn)存在miRNAs的相互轉(zhuǎn)移[7]。Shahid等[8]報(bào)道菟絲子miRNA能通過吸器轉(zhuǎn)移到與其聯(lián)接的寄主莖上并干擾寄主miRNA和phasiRNA表達(dá)。采用RNAi技術(shù)干擾分枝列當(dāng)與乙烯合成路徑相關(guān)基因PaACS、控制寄主向寄生物養(yǎng)分傳遞的基因Pam6PR和列當(dāng)感受早期侵染信號(hào)的基因PaPrx1基因沉默后,分枝列當(dāng)(PhelipancheaegyptiacaPers.)在番茄和煙草上形成的瘤節(jié)數(shù)量和生物量顯著降低[9],說明分枝列當(dāng)與寄主之間也存在RNAs轉(zhuǎn)移并可通過RNAi技術(shù)防治分枝列當(dāng)。分枝列當(dāng)可侵染甜瓜、西瓜、番茄、煙草等重要經(jīng)濟(jì)作物。目前防治列當(dāng)?shù)闹饕椒ㄓ屑訌?qiáng)檢疫、人工拔除、選育抗病品種等措施,因其具有種子庫龐大、種子微小及種子休眠時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn),導(dǎo)致感染列當(dāng)?shù)貕K根除不凈,連年噴施農(nóng)藥易使列當(dāng)產(chǎn)生抗藥性,生物防治很難在當(dāng)年對(duì)列當(dāng)產(chǎn)生效果,列當(dāng)易突變產(chǎn)生新小種使寄主原本的抗性品種抗性喪失等,防控難度極大[10]。RNAi技術(shù)能夠同時(shí)針對(duì)多個(gè)靶基因,有效防止單一位點(diǎn)突變導(dǎo)致的抗病抗性喪失,是十分有前景的抗病育種手段。在分枝列當(dāng)寄生寄主時(shí),是否與寄主存在miRNA相互交流及轉(zhuǎn)移miRNA的功能相關(guān)研究報(bào)道較少。煙草是常用的模式植物之一,其基因組庫已基本構(gòu)建完全,也是瓜列當(dāng)?shù)母吒屑闹髦?本研究以分枝列當(dāng)-普通煙(NicotianatabacumLinn.)作為研究體系,分別對(duì)寄生有分枝列當(dāng)?shù)臒煵莞?、寄生接觸點(diǎn)和列當(dāng)莖稈取樣進(jìn)行sRNA測(cè)序分析,以期明確分枝列當(dāng)在寄生煙草過程中是否存在miRNA轉(zhuǎn)移,同時(shí)篩選出轉(zhuǎn)移的miRNA并對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè),為揭示miRNA在列當(dāng)-寄主間互作中機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

煙草種子為寄生植物防控研究室自留種;分枝列當(dāng)植株及種子采集于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔城市163團(tuán)4連,經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒為分枝(瓜)列當(dāng)(P.aegyptiacaPers.)。

1.2 方法

1.2.1 樣品準(zhǔn)備 將煙草種子均勻播撒在被水浸透的蛭石和營養(yǎng)土(體積比1∶1)基質(zhì)中,置于溫室中培養(yǎng)(溫度28 ℃,光照度為10 000 lx,光照時(shí)長(zhǎng)16 h/d,黑暗8 h/d),待煙草幼苗長(zhǎng)出一片真葉時(shí)移栽至拌入完全成熟的分枝列當(dāng)種子0.02 g混有蛭石和沙子(體積比1∶1)基質(zhì)的花盆(口徑:16 cm,高度:12.5 cm)中,每盆一棵,用水浸透,10次重復(fù),以10盆未拌分枝列當(dāng)種子處理作為對(duì)照。將播種好的各處理盆栽隨機(jī)擺放,置于溫室中培養(yǎng)(溫度28 ℃,光照度為10 000 lx,光照時(shí)長(zhǎng)16 h/d,黑暗8h/d),正常澆水管理。

1.2.2 sRNA測(cè)序 利用Small RNA Sample Pre Kit試劑盒(武漢錦奧生物科技有限公司)構(gòu)建文庫,通過Qubit 2.0進(jìn)行初步定量分析,將構(gòu)建的文庫稀釋至1 ng/μL,再利用高靈敏Agilent 2100對(duì)文庫的insert size進(jìn)行檢測(cè),質(zhì)檢后使用qRT-PCR方法對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度>2 nmol/L),以保證文庫質(zhì)量,庫檢合格后,把不同文庫按照有效濃度>2 nmol/L及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求集中后進(jìn)Illumina SE50測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 使用Illumina Casava 1.8檢查數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率,堿基位置的測(cè)序錯(cuò)誤率低于 0.5%視為合格。利用Cutadapt 1.9.1(https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html)去除原始數(shù)據(jù)中含polyA/T/G/C、質(zhì)量值sQ≤20、未知堿基N的比例大于10%的低質(zhì)量reads及接頭(5′端接頭5′-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC-3′;3′端接頭5′-AGATACGGAAGAGCACACGTCT-3′)序列,并對(duì)過濾后的clean reads進(jìn)行18～22 nt的長(zhǎng)度篩選。采用bowtie 1.3.0(http://bowtie-bio.sourceforge.net/manual.shtml)將長(zhǎng)度篩選后的miRNA定位到煙草基因組數(shù)據(jù)庫(Nitabv1.0 Chr Edwards 2017)中進(jìn)行比對(duì),獲取已知miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),各樣本中miRNA的序列、長(zhǎng)度及表達(dá)量等信息。利用mirDeep2 2.0.0.2(https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2.git mirdeep2.0.0.2)根據(jù)前體序列預(yù)測(cè)新miRNA并獲取其二級(jí)結(jié)構(gòu)等信息。

1.2.4 轉(zhuǎn)移miRNA篩選 將寄生煙草根(NR)、寄生部位(NC)、列當(dāng)莖稈(NP)及未寄生煙草根(NK)樣品的測(cè)序基因信息在煙草基因組(Nitabv1.0 Chr Edwards 2017)中比對(duì),從中篩選表達(dá)量>10的miRNA,利用bowtie2 2.3.4.1(http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml)將其映射至列當(dāng)基因組(本課題組前期測(cè)序,未發(fā)表)中,從中篩選unmapping的miRNA,即煙草轉(zhuǎn)移至列當(dāng)?shù)膍iRNA。同時(shí)將寄生煙草根(NR)、寄生部位(NC)及列當(dāng)莖稈(NP)樣品測(cè)序基因在列當(dāng)基因組中比對(duì),從中篩選表達(dá)量>10的miRNA,利用bowtie2將其映射至煙草基因組(Nitabv1.0 Chr Edwards 2017)中,從中篩選unmapping的miRNA,即煙草轉(zhuǎn)移至列當(dāng)?shù)膍iRNA。

1.2.5 qRT-PCR驗(yàn)證 樣品總RNA經(jīng) DNase I處理后,利用RransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒(全式金公司)合成cDNA,20 μL反應(yīng)體系:Total RNA(75 ng/μL)2 μL;TransScript miRNA RT Enzyme Mix 1 μL;2×TS miRNA Reaction Mix 10 μL;RNase-free Water 7 μL。反應(yīng)條件:37 ℃孵育 1 h,85 ℃處理5 s。隨機(jī)選取差異miRNA,通過Primer 5.5.0(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/)軟件設(shè)計(jì)引物,引物詳情(表1),通過ABI Prism7500定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR,20 μL反應(yīng)體系:cDNA 2 μL;2×PerfectStartTM Green qPCR SuperMix 10 μL;特異性上游引物(10μmol/L)0.4 μL;Universal miRNA qPCR Primer(10 μmol/L)0.4 μL;Passive Reference Dye(50×)0.4 μL;Nuclease-free Water 6.8 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃擴(kuò)增5 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸10 s,40個(gè)循環(huán);95 ℃變性15 s,55 ℃復(fù)性15 s。以U6(LOC 103502534)基因?yàn)閮?nèi)參[11],每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),采用2-△△Ct法[12]計(jì)算各樣品中目標(biāo)miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 sRNA測(cè)序結(jié)果與分析

經(jīng)Illumina SE50平臺(tái)測(cè)序共構(gòu)建12個(gè)煙草sRNA文庫,獲得151 216 698條raw reads,經(jīng)質(zhì)控后共獲得了148 353 885條的clean reads,各樣本的Q20>99%,Q30>96%,鳥嘌呤和胞嘧啶(GC)含量范圍為49.63%～54.07%,測(cè)序錯(cuò)誤率占比0.01%,低質(zhì)量讀數(shù)平均占比0.18%。長(zhǎng)度篩選后各文庫sRNA數(shù)量占比77.12%,平均序列長(zhǎng)度為22 nt(圖1)。對(duì)sRNA進(jìn)行信息注釋共獲得495 255條已知miRNA和13 370條新miRNA,總miRNA的占比8.2%,仍有22.01%的sRNA在煙草基因組中未注釋,表明有很多sRNA有待挖掘(表2)。

圖1 樣品sRNA長(zhǎng)度分布頻率

表2 sRNA注釋數(shù)量統(tǒng)計(jì)及占比結(jié)果

2.2 miRNA注釋分析

為了明確測(cè)得的miRNA的具體功能,對(duì)miRNA進(jìn)行注釋分析,注釋長(zhǎng)度結(jié)果顯示,12個(gè)文庫中已知miRNA數(shù)量均高于新miRNA(圖2-A),有待研究注釋的miRNA仍有很多。本研究共注釋到312個(gè)miRNA,這些miRNA隸屬于20個(gè)miRNA家族,內(nèi)部成員包含1～5個(gè)不等,其中以MIR159和MIR6025家族成員最多(圖2-C),MIR159家族主要與花粉發(fā)育有關(guān)[13],且能夠在植物體內(nèi)負(fù)調(diào)控免疫防御反應(yīng)[14],MIR6025則是茄科植物特有的一類miRNA[15],這種特有miRNA被認(rèn)為是一種特異型的抗病進(jìn)化特征[16]。同時(shí)對(duì)miRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和miRNA的堿基偏好性進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析,miRNA前體具有莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)、其3′端有2 nt的懸垂(圖2-B),且堿基1位對(duì)U有強(qiáng)偏好,10位對(duì)A有較強(qiáng)偏好(圖2-D),符合miRNA的堿基偏好性規(guī)律,表明測(cè)序得到的miRNA質(zhì)量及可信度較高,可用于后續(xù)試驗(yàn)的分析。

A.不同樣品已知及新miRNA數(shù)量;B.miRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖,整個(gè)序列是miRNA前體,紅色突出部分為成熟體序列;C.樣品中miRNA家族成員及其成員數(shù);D.miRNA堿基偏好性示意圖

2.3 差異miRNA及靶基因富集分析

植物在遭受生物脅迫時(shí)會(huì)啟動(dòng)自身的免疫防御系統(tǒng),通過對(duì)病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein,PR蛋白)、和抗病相關(guān)基因(resistance gene,R基因)的調(diào)控阻止有害生物帶來的負(fù)面影響[17]。通過高通量測(cè)序篩選生物脅迫中產(chǎn)生的差異基因,并對(duì)其靶基因進(jìn)行注釋和分析,可以快速預(yù)測(cè)差異基因的生物學(xué)功能,從而進(jìn)一步了解植物的抗生物脅迫的分子過程。對(duì)NR和NK的miRNA差異表達(dá)分析結(jié)果表明,與NK相比,NR共產(chǎn)生了49個(gè)差異miRNA,包括17個(gè)已知miRNA和32個(gè)新預(yù)測(cè)的miRNA,30個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá),靶mRNA主要參與植物根系的生長(zhǎng)和水楊酸的合成;19個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)(圖3),靶mRNA主要參與礦質(zhì)元素吸收和積累及脫落酸(ABA)的表達(dá)相關(guān)。表明寄主可能通過這些差異miRNA介導(dǎo)寄主產(chǎn)生防御相關(guān)激素和限制營養(yǎng)物質(zhì)供給抵御列當(dāng)寄生。

橫坐標(biāo)表示煙草被瓜列當(dāng)寄生后的miRNA表達(dá)倍數(shù)變化(log2 fold change,P<0.05);縱坐標(biāo)表示表達(dá)差異的顯著性水平(lg P-value,P<0.05)

為了明確差異基因的調(diào)控機(jī)制,對(duì)列當(dāng)-煙草寄生系統(tǒng)中的差異基因的靶基因進(jìn)行GO富集,結(jié)果顯示這些靶基因參與了2 697個(gè)生物學(xué)功能條目,包括343個(gè)細(xì)胞組分條目、1 579個(gè)生物學(xué)過程條目和775個(gè)分子功能條目,其中有1個(gè)生物學(xué)過程條目—蛋氨酸代謝過程(methionine metabolic process)和包括有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合(orgamic cyclic compound binding)、雜環(huán)化合物結(jié)合(hetero cyclic compound binding)、離子結(jié)合(ion binding)、小分子結(jié)合(small molecule binding)和碳水化合物衍生物結(jié)合(carbohydrate derivative binding)在內(nèi)的18個(gè)分子功能條目顯著富集,其中有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合和雜環(huán)化合物結(jié)合條目富集靶基因最多,高達(dá)655個(gè)靶基因(圖4),表明煙草在被分枝列當(dāng)寄生后可能通過分子功能中相關(guān)化合物基因的表達(dá)啟動(dòng)植物免疫反應(yīng)調(diào)控通路。

1.蛋氨酸代謝;2.甘氨酸結(jié)合;3.陰離子結(jié)合;4.碳水化合物衍生物結(jié)合;5.腺苷酸核氨酸結(jié)合;6.腺苷酸結(jié)合;7.嘌呤核苷結(jié)合; 8.核糖核苷結(jié)合;9.嘌呤核糖核苷結(jié)合;10.ATP結(jié)合;11.核苷磷酸結(jié)合;12.小分子結(jié)合;13.離子結(jié)合;14.嘌呤核糖核苷三磷酸結(jié)合;15.5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-半胱氨酸 S-甲基轉(zhuǎn)移酶;16.5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-L-谷氨酸-伴甲基轉(zhuǎn)移酶;17.有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合;18.雜環(huán)化合物結(jié)合

為了進(jìn)一步明確差異基因的功能,對(duì)差異基因的靶基因進(jìn)行KEGG富集,相關(guān)靶基因在硒化合物代謝(selenocompound metabolism)、托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成(tropane, piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis)、硫代葡萄糖苷的生物合成(glucosinolate biosynthesis)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝(cysteine and methionine metabolism)、丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)、肌醇磷酸代謝(inositol phosphate metabolism)和氰基氨基酸代謝(cyanoamino acid metabolism)通路中顯著富集(圖5)。

橫坐標(biāo)代表差異基因中與該Term相關(guān)的基因數(shù)與整個(gè)差異基因總數(shù)的比值,縱坐標(biāo)為KEGG注釋通路,圓點(diǎn)大小代表該通路基因數(shù)量,P-value≤0.05

硒作為植物生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)重要的微量元素之一,低濃度(<8.0 mg/kg)時(shí)能夠提高植物體內(nèi)活性氧防御反應(yīng),高濃度硒(>16 mg/kg)則會(huì)抑制活性氧防御反應(yīng),導(dǎo)致SOD酶與POD酶含量下降[18]。而硫代葡萄糖苷的生成不僅可以影響植物體內(nèi)包括吲哚乙酸(IAA)在內(nèi)的多種生長(zhǎng)素的變化[19],還被證明參與了植物抗病反應(yīng)[20]。另外,植物在被病原物入侵時(shí),其細(xì)胞呼吸也會(huì)受到病原物的刺激并通過合成丙酮酸脫羧酶(PDC),將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛和CO2從而產(chǎn)生能量用來抵御病原物的入侵[21]。這些證據(jù)表明這些差異表達(dá)miRNA在煙草抵御列當(dāng)入侵中發(fā)揮重要作用。

2.4 轉(zhuǎn)移miRNA的篩選結(jié)果

通過對(duì)轉(zhuǎn)移miRNA的篩選,鑒定到3個(gè)從煙草轉(zhuǎn)移至列當(dāng)?shù)膍iRNA和2個(gè)從列當(dāng)轉(zhuǎn)移至煙草的已知miRNA。其中3個(gè)從煙草轉(zhuǎn)移至列當(dāng)?shù)膍iRNA分別為nta-miR319a、nta-miR398和novel_6,靶基因功能主要參與植物細(xì)胞有絲分裂、植物抗逆和過敏反應(yīng)(HR);2個(gè)從列當(dāng)轉(zhuǎn)移至煙草的miRNA分別為sly-miR396a-5p和sly-miR396b,靶基因功能主要參與涉及水楊酸(SA)的產(chǎn)生和植物根系生長(zhǎng)有關(guān)。從這些預(yù)測(cè)到的轉(zhuǎn)移miRNA的功能推測(cè),由煙草轉(zhuǎn)移至分枝列當(dāng)?shù)膍iRNA可能通過植物過敏性壞死反應(yīng)和限制寄主根系生長(zhǎng)來抑制列當(dāng)?shù)募纳?而分枝列當(dāng)轉(zhuǎn)移至煙草的miRNA則可能通過調(diào)節(jié)植物激素來擾亂煙草免疫防御反應(yīng)。由于miRNA調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,因此本研究篩選到的轉(zhuǎn)移miRNA的主要靶基因信息見表3。

表3 轉(zhuǎn)移miRNA及靶基因注釋信息

2.5 差異基因及轉(zhuǎn)移miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

選取了12個(gè)差異基因及轉(zhuǎn)移miRNA對(duì)其相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示所選取的基因的qRT-PCR結(jié)果與sRNA測(cè)序含量盡管存在差異,但其在各樣品中的表達(dá)趨勢(shì)具有一致性(圖6),說明sRNA測(cè)序結(jié)果可靠,轉(zhuǎn)移miRNA的篩選結(jié)果可信。

圖6 差異miRNA相對(duì)表達(dá)量qRT-PCR驗(yàn)證

3 討 論

已有大量文獻(xiàn)證實(shí)寄主和寄生物之間存在復(fù)雜的物質(zhì)轉(zhuǎn)移。Jiang等[22]研究表明菟絲子通過從過表達(dá)磷脂酶乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)基因的轉(zhuǎn)基因宿主獲得對(duì)草甘膦的瞬時(shí)抗性,而大豆蚜蟲(Aphisglycines)取食寄生大豆的菟絲子后誘導(dǎo)了寄主大豆的系統(tǒng)防御反應(yīng),從而增強(qiáng)了大豆植株對(duì)斜紋夜蛾(Spodopteralitura)和大豆蚜蟲抗性[23]。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn)N系統(tǒng)信號(hào)可以通過菟絲子在缺N植株和N充足植株間雙向轉(zhuǎn)運(yùn),從而導(dǎo)致N充足植株對(duì)N的吸收增加,這些N系統(tǒng)信號(hào)還誘導(dǎo)了油菜和寄主之間的許多遠(yuǎn)距離移動(dòng)的mRNA轉(zhuǎn)移。列當(dāng)作為寄生在寄主根部的全寄生性植物,同樣存在著大量轉(zhuǎn)移物質(zhì),Kado等[25]研究檢測(cè)了列當(dāng)科的5種寄生植物,在Orobancheminor和Aeginetiaindica中共檢測(cè)到106個(gè)水平基因轉(zhuǎn)移(HGT),HGT基因分別約占編碼基因的0.1%和0.2%。Aly等[26]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因番茄植株被分枝列當(dāng)寄生時(shí),大量的GFP從寄主韌皮部轉(zhuǎn)移到列當(dāng)韌皮部,并在列當(dāng)根瘤和莖稈中積累。另外黃瓜花葉病毒(CMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)和黃曲葉病毒(TYLCV)也被證明可從受侵染的寄主植物轉(zhuǎn)移到分枝列當(dāng)上[27]。這些證據(jù)表明在寄生植物和寄主間雙向交流的大分子物質(zhì)在其寄生體系中具有重要作用,但目前對(duì)列當(dāng)與寄主間其他物質(zhì)轉(zhuǎn)移仍有待研究。

miRNA可以通過宿主轉(zhuǎn)移至寄生性生物體內(nèi),通過RNA干擾(RNAi)提高寄主對(duì)寄生生物的抗性[5]。Shahid等[8]研究表明菟絲子在寄生擬南芥和本氏煙時(shí)積累了大量新的miRNA,這些miRNAs作為寄主基因表達(dá)的跨物種調(diào)節(jié)因子,在寄生過程中可能發(fā)揮毒力因子的作用。但分枝列當(dāng)在寄生普通煙的過程中是否以miRNA復(fù)合體進(jìn)行長(zhǎng)距離移動(dòng)尚有待研究[28]。本研究通過對(duì)煙草與列當(dāng)?shù)幕蚪M數(shù)據(jù)庫的篩選,篩選出了3個(gè)從煙草轉(zhuǎn)移至列當(dāng)?shù)膍iRNA和2個(gè)從列當(dāng)轉(zhuǎn)移至煙草的已知miRNA。其中MiR319a能夠通過抑制TCP(Teosinte Branch 1/CycloidEA/PCF)家族基因的表達(dá)來控制植物葉片細(xì)胞分裂停滯[29],在被菌核病侵染時(shí),油菜體內(nèi)的miR319含量顯著上升,并參與影響植物對(duì)菌核病菌引起的莖腐病的抗性[30]。在被列當(dāng)寄生時(shí),miR319的含量同樣顯著升高,推測(cè)miR319不僅在煙草體內(nèi)參與了植物抗病反應(yīng),且通過轉(zhuǎn)移至列當(dāng)體內(nèi),影響列當(dāng)細(xì)胞的有絲分裂,使其擴(kuò)展受阻,抑制其生長(zhǎng)。而miR398a主要參與活性氧清除酶Cu/Zn超氧化物歧化酶基因的負(fù)調(diào)控,寄生體毒性與致病力越強(qiáng),miR398a上調(diào)幅度越大,最終導(dǎo)致被寄生處宿主的細(xì)胞因ROS過多而死亡[31],煙草在被列當(dāng)寄生后導(dǎo)致根部miR398a的顯著表達(dá),這與Fujibayashi等[31]的研究結(jié)果一致,miR698a或通過抑制寄生根部細(xì)胞ROS酶的活性,增加了寄生部位細(xì)胞ROS含量,最終導(dǎo)致被寄生細(xì)胞因死亡限制列當(dāng)?shù)募纳?miR398a的轉(zhuǎn)移也能夠通過使列當(dāng)細(xì)胞的壞死來限制列當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)。

有些miRNAs作為寄主基因表達(dá)的跨物種調(diào)節(jié)因子,在寄生過程中能夠發(fā)揮毒力因子的作用[32]。有研究表明轉(zhuǎn)基因番茄中miR396a-5p和miR396a-3p的增加增強(qiáng)了番茄對(duì)致病疫霉(Phytophthorainfestans)和灰霉菌(Botrytiscinerea)的敏感性,并且抑制了植物體內(nèi)水楊酸(SA)和茉莉酸的產(chǎn)生(JA)[6, 8]。列當(dāng)sly-miR396a-5p的轉(zhuǎn)移,與煙草水楊酸生成相關(guān)基因的顯著下調(diào)或存在潛在關(guān)聯(lián);miR396b則主要通過靶向生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子(GRF)基因來調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[33],因此推測(cè)分枝列當(dāng)可能通過轉(zhuǎn)移miRNA減弱煙草的免疫防御相關(guān)反應(yīng)、調(diào)節(jié)煙草根部生長(zhǎng)來提高自身發(fā)育、增強(qiáng)自身侵染力。

4 結(jié) 論

瓜列當(dāng)在寄生煙草時(shí)存在miRNA相互轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象,轉(zhuǎn)移miRNA靶基因注釋結(jié)果表明,煙草作為寄主可能通過miRNA的轉(zhuǎn)移來抑制或限制列當(dāng)?shù)募纳?列當(dāng)作為全寄生植物也可能會(huì)利用miRNA的轉(zhuǎn)移來抑制寄主防御反應(yīng)的信號(hào)應(yīng)答。