白藜蘆醇通過鐵死亡途徑逆轉(zhuǎn)食管癌細胞Eca109/DDP化療耐藥

王陳等,馬柏強,易弼順

王陳等,馬柏強,易弼順,麗水市人民醫(yī)院胃腸與疝外科、減重代謝外科、急診創(chuàng)傷外科 浙江省麗水市 323000

王陳等,住院醫(yī)師,主要從事普通外科與腹壁外科方面相關(guān)的研究.

0 引言

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示,食管癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中排第六位,而死亡率居第四位[1];其中約90%的食管癌屬于食管鱗癌,由于早期癥狀不明顯,很多患者均存在診斷晚、治療效果差的現(xiàn)象.輔助化療在食管癌的治療中仍有著不可替代的作用,獲得性耐藥的產(chǎn)生則成為影響化療效果及患者長期生存的主要因素[2,3].腫瘤細胞獲得性耐藥的發(fā)生機制以及逆轉(zhuǎn)耐藥的新型藥物研發(fā)依舊是目前的研究熱點和重點[3];大量的臨床實踐表明中藥在改善化療藥物的多藥耐藥現(xiàn)象,緩解化療所致的不良反應(yīng),提升患者化療完成度及治療效果上具有明顯的優(yōu)勢[3-5].白藜蘆醇是一種非黃酮多酚類化合物,廣泛存在于天然植物及傳統(tǒng)中藥中;作為一種天然的抗毒素,白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學功效[6-8].早期有研究顯示,白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞化療耐藥[7].此外,白藜蘆醇可靶向miR-122-5p增加乳腺癌細胞MCF-7對阿霉素的敏感性[8].由此可見,白藜蘆醇可與多種化療藥物聯(lián)用,增加藥物療效;然而目前并未有關(guān)于白藜蘆醇對人食管癌細胞Eca109化療耐藥的影響及相關(guān)機制的報道.本研究以人食管癌細胞Eca109及其順鉑耐藥細胞系Eca109/DDP為觀察對象,評估白藜蘆醇干預(yù)后Eca109/DDP細胞順鉑耐藥性的變化,并從細胞鐵死亡的角度初步探究其可能的作用機制,為白藜蘆醇在食管癌化療中的實踐應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料 人食管癌細胞Eca109及其順鉑耐藥細胞系Eca109/DDP購自中科院上海生物化學與細胞生物學研究所;RPMI1640液體細胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;白藜蘆醇、鐵死亡抑制劑(ferrostatin-1,Fer-1) 和鐵離子螯合劑(deferoxamine,DFO)購自Sigma公司;注射用順鉑購自齊魯制藥有限公司;鐵分析試劑盒購自美國Abnova公司;?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl coenzyme A synthetase long chain family member 4,ACSL4)、鐵蛋白重鏈(ferritin heavy chain,FTH)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、腫瘤蛋白53(tumor protein 53,P53)和肌動蛋白β(β-actin)抗體均購自美國Abcam公司;噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)細胞增殖檢測試劑盒以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、活性氧(active oxygen species,ROS)檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng): 食管癌細胞Eca109及其順鉑耐藥細胞系Eca109/DDP常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640液體細胞培養(yǎng)基中,定期換液和傳代.為保證細胞的耐藥性,Eca109/DDP細胞培養(yǎng)基中需間斷性加入順鉑.培養(yǎng)環(huán)境為: 37 ℃,50 mL/L CO2.

1.2.2 MTT檢測: 采用MTT法檢測細胞經(jīng)處理后增殖情況的變化,將細胞接種至96孔板中(2×104個/mL),給予相應(yīng)的藥物處理后,加入MTT試劑,培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h.最后用酶標儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度值(OD),分析細胞的增殖情況.每次實驗設(shè)三個復(fù)孔取平均值,同時設(shè)不含細胞的單孔作為空白對照.實驗重復(fù)三次.不同實驗分組設(shè)置如下:

檢測順鉑對Eca109及Eca109/DDP細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50),順鉑的濃度梯度設(shè)置為0、3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM、25 μM和50 μM.

檢測白藜蘆醇對食管癌耐藥細胞Eca109/DDP的毒性作用,白藜蘆醇的濃度設(shè)置為0、15 μM、30 μM、60 μM、120 μM和240 μM.

1.2.3 細胞集落形成檢測: 采用細胞集落形成實驗評估細胞的增殖情況.將細胞鋪板于6孔板(1000個/孔),依據(jù)下述實驗分組分別加藥處理,置于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 wk.吸棄培養(yǎng)液,PBS清洗后加多聚甲醛固定細胞集落,而后加結(jié)晶紫染液染色,將染色結(jié)果置于顯微鏡下拍照觀察并計算細胞的集落形成數(shù).

實驗分組如下: 對照組(不加順鉑及白藜蘆醇;Ctrl);白藜蘆醇組(白藜蘆醇濃度為30 μM;Res);順鉑組(順鉑濃度為12.5 μM;DDP);順鉑及白藜蘆醇聯(lián)用組(順鉑濃度為12.5 μM,白藜蘆醇濃度為30 μM;Res+DDP).

1.2.4 細胞內(nèi)MDA、GSH檢測: 依據(jù)實驗分組分別處理各組細胞,按照試劑盒提供的操作說明書進行如下操作: 首先離心收集各組細胞經(jīng)PBS清洗后,重懸細胞.超聲破碎細胞并離心收集上清液,依據(jù)說明說加入相應(yīng)的工作液孵育,酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值.繪制標準曲線并分析相應(yīng)的檢測指標.實驗分組同2.3.

1.2.5 二價鐵離子(Fe2+)含量檢測: 依據(jù)實驗分組分別處理各組細胞,按照試劑盒提供的操作說明書進行如下操作: 胰酶消化收集各組細胞,離心后加Assay buffer重懸細胞.渦旋化冰后再次離心收集上清液待檢,向待檢樣品中依次加入鐵還原劑和探針,孵育后經(jīng)酶標儀檢測593 nm波長處的吸光度值.繪制標準曲線并分析各實驗組鐵離子的濃度.實驗分組同2.3.

1.2.6 ROS檢測: 將細胞鋪板于24孔板(2×104個/孔),依據(jù)實驗分組分別處理各組細胞,并增加空白對照孔(僅溶劑)和陽性對照孔(加ROS對照試劑5 mg/mL Rosup),更換細胞培養(yǎng)液,避光加DCFH-DA染液染色30 min.消化收集細胞,PBS洗滌并重懸,于熒光顯微鏡下拍照觀察并分析熒光強度.實驗分組同2.3.

1.2.7 western blot蛋白表達水平檢測: 細胞經(jīng)冰PBS洗滌后,加RIPA裂解液收集各組細胞蛋白.參考BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,而后上樣進行SDSPAGE凝膠電泳和電轉(zhuǎn),將分離的目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜.加入5%的脫脂乳粉于室溫下封閉90 min.依據(jù)說明書要求加入相應(yīng)比例的一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗滌后加入相對應(yīng)的二抗室溫孵育2 h.TBST洗滌,暗室中經(jīng)ECL化學發(fā)光法檢測目的蛋白的表達情況并行灰度半定量分析.實驗分組同2.3.

統(tǒng)計學處理所得數(shù)據(jù)錄入GraphPad8.3軟件中進行統(tǒng)計學分析.實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,多組間的比較采用方差分析,各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗,P＜0.05表示差異有顯著性.

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇及順鉑在食管癌化療中的協(xié)同增敏作用 本研究首先采用MTT法確定Eca109/DDP細胞對順鉑的耐藥性.結(jié)果如圖1所示,順鉑可濃度依賴性抑制Eca109及Eca109/DDP細胞的增殖,其中順鉑對Eca109細胞和Eca109/DDP細胞的IC50分別為(7.70±1.18) μM和(24.73±4.45) μM;Eca109/DDP細胞對順鉑具有明顯的耐藥性,可用于后續(xù)實驗分析.

圖1 白藜蘆醇及順鉑聯(lián)用對Eca109/DDP細胞活力的影響. n=3,aP＜0.05 vs Eca109細胞,bP＜0.05 vs Eca109/DDP細胞.Res: 白藜蘆醇.

CCK-8細胞活力檢測的結(jié)果顯示(表1),Eca109/DDP細胞經(jīng)不同濃度的白藜蘆醇處理24 h后,細胞活力隨白藜蘆醇濃度的增加有所降低,其中120 μM及240 μM的白藜蘆醇可顯著抑制細胞活力(P＜0.05);處理48 h后,白藜蘆醇濃度在60 μM、120 μM及240 μM時的作用較為顯著(P＜0.05).選取無細胞毒性作用的濃度為白藜蘆醇的耐藥逆轉(zhuǎn)濃度,即30 μM.

表1 白藜蘆醇對Eca109/DDP細胞活力的影響

為進一步驗證白藜蘆醇是否可逆轉(zhuǎn)Eca109/DDP細胞的耐藥性,本研究采用MTT法檢測30 μM白藜蘆醇預(yù)孵之后,順鉑對Eca109/DDP細胞的殺傷作用.結(jié)果圖1所示;30 μM白藜蘆醇預(yù)孵后,Eca109/DDP細胞對順鉑的敏感性顯著增強,且在順鉑濃度為12.5 μM時,差異較為顯著(P＜0.05),故而后續(xù)實驗選用此濃度進行處理.

2.2 白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用對細胞集落形成的影響 細胞克隆形成實驗檢測結(jié)果顯示(圖2),相比于對照組,單用順鉑處理(DDP組)細胞集落形成數(shù)由1058.27±95.82減少至693.69±53.25(P＜0.05),而白藜蘆醇和順鉑聯(lián)合處理組(Res+DDP組)細胞集落形成數(shù)進一步減少至357.78±23.24.結(jié)果表明在Eca109/DDP細胞中,白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用可進一步增強順鉑對細胞的殺傷力.

圖2 白藜蘆醇及順鉑聯(lián)用對Eca109/DDP細胞集落形成的影響(比例尺= 5 mm).Ctrl: 對照組;Res: 白藜蘆醇組;DDP: 順鉑組;Res+DDP: 順鉑及白藜蘆醇聯(lián)用組.n=3,aP＜0.05 vs Ctrl組,bP＜0.05 vs DDP組.

2.3 白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用對細胞鐵死亡的影響 細胞鐵死亡相關(guān)指標的檢測結(jié)果顯示(圖3),相比于對照組,順鉑處理組(DDP組)細胞內(nèi)二價鐵離子的含量有所升高,同時MDA和ROS水平顯著升高(P＜0.05),而GSH水平顯著降低.加入30 μM的白藜蘆醇預(yù)孵后,細胞內(nèi)二價鐵離子的含量以及MDA和ROS水平顯著高于DDP組;GSH水平則顯著低于DDP組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05).結(jié)果說明白藜蘆醇聯(lián)用順鉑可顯著促進Eca109/DDP細胞內(nèi)鐵離子的蓄積,并誘導(dǎo)細胞鐵死亡.

圖3 白藜蘆醇及順鉑聯(lián)用對Eca109/DDP細胞鐵死亡的影響.A: 二價鐵離子含量;B: MDA水平;C: GSH水平;D和E: ROS水平,放大倍數(shù)400×,比例尺=20 μm.n=3,aP＜0.05 vs Ctrl 組,bP＜0.05 vs DDP組.MDA: 丙二醛;GSH: 谷胱甘肽;ROS: 活性氧;Ctrl: 對照組;Res: 白藜蘆醇組;DDP: 順鉑組;Res+DDP: 順鉑及白藜蘆醇聯(lián)用組.

2.4 白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用逆轉(zhuǎn)耐藥性與鐵死亡的相關(guān)性 本部分實驗通過Fer-1和DFO進一步驗證白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用逆轉(zhuǎn)耐藥性與鐵死亡的相關(guān)性(圖4),MTT細胞毒性檢測結(jié)果顯示Fer-1和DFO對Eca109/DDP細胞無明顯損傷;白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用組(Res+DDP)細胞活力為(48.05±2.83)%,加2.5 μM鐵死亡抑制劑Fer-1或者2.5 μM鐵離子螯合劑DFO干預(yù),細胞活力分別回升至(60.36±2.87)%和(57.70±2.74)%,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05).結(jié)果表明,白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用所致的Eca109/DDP細胞增殖抑制作用可被鐵死亡抑制劑Fer-1和鐵離子螯合劑DFO部分逆轉(zhuǎn).

圖4 鐵死亡抑制劑Fer-1和鐵離子螯合劑DFO對Eca109/DDP細胞活力的影響. A: Fer-1的細胞毒性檢測;B: MTT檢測Fer-1、Res和DDP對Eca109/DDP細胞活力的影響;C: DFO的細胞毒性檢測;D: MTT檢測DFO、Res和DDP對Eca109/DDP細胞活力的影響.Res: 白藜蘆醇;DDP: 順鉑.n=3,aP＜0.05 vs Res+DDP組.

2.5 白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用對細胞中鐵死亡相關(guān)調(diào)控因子的影響 Western blot檢測結(jié)果如圖5所示,相比于對照組,順鉑處理組(DDP組)細胞內(nèi)FTH及GPX4的蛋白表達有所降低(P＜0.05);ACSL4及P53的蛋白表達則呈增加趨勢(P＜0.05).白藜蘆醇和順鉑聯(lián)合處理組(Res+DDP組)細胞內(nèi)FTH及GPX4的蛋白表達相比于DDP組顯著降低(P＜0.05);ACSL4及P53的蛋白表達相比于DDP組則進一步增加(P＜0.05).結(jié)果說明白藜蘆醇可影響Eca109/DDP細胞內(nèi)鐵死亡相關(guān)調(diào)控因子的蛋白表達.

圖5 白藜蘆醇及順鉑聯(lián)用對Eca109/DDP細胞鐵死亡相關(guān)調(diào)控因子的影響. n=3,aP＜0.05 vs Ctrl組,bP＜0.05 vs DDP組.FTH: 丙二醛;GPX4: 谷胱甘肽;ACSL4: 活性氧;Ctrl: 對照組;Res: 白藜蘆醇組;DDP: 順鉑組;Res+DDP: 順鉑及白藜蘆醇聯(lián)用組.

3 討論

中藥往往具有多種藥理學功效,且自身毒副作用較小,在應(yīng)對復(fù)雜疾病上具有天然的優(yōu)勢.本研究探究了白藜蘆醇對食管癌順鉑耐藥細胞Eca109/DDP化療耐藥性的影響.MTT藥敏實驗結(jié)果顯示白藜蘆醇自身對食管癌細胞Eca109和Eca109/DDP的毒性較小,聯(lián)合應(yīng)用白藜蘆醇和順鉑可增加Eca109/DDP細胞對順鉑的敏感性,具有一定的耐藥逆轉(zhuǎn)效應(yīng).同時克隆形成實驗的結(jié)果顯示相較于單用順鉑,白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用可進一步抑制Eca109/DDP細胞克隆形成,提升順鉑的作用效果.結(jié)果提示,白藜蘆醇可逆轉(zhuǎn)食管癌順鉑耐藥細胞Eca109/DDP對順鉑的耐藥性.

化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用主要體現(xiàn)在抑制腫瘤細胞的無限增殖,誘導(dǎo)其多種模式的死亡上[9].細胞死亡的方式主要包括: 細胞凋亡、細胞焦亡、壞死性凋亡、鐵死亡以及自噬等,它們具有不同的形態(tài)和生化特征[9-11].本研究從鐵死亡的角度初步探究了白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)Eca109/DDP細胞順鉑耐藥性的作用機制.鐵死亡是一種鐵和脂質(zhì)過氧化依賴性的細胞死亡模式,其主要特征表現(xiàn)為細胞內(nèi)鐵離子蓄積通過芬頓反應(yīng)生成大量的ROS,同時伴隨GSH耗竭,導(dǎo)致細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物水平升高,最終誘發(fā)細胞死亡[12].目前有大量的文獻報道,在包括胃癌[13]、結(jié)直腸癌[14]以及食管癌[15]中,誘導(dǎo)細胞鐵死亡是改善腫瘤細胞放化療耐藥的重要策略.本研究的檢測結(jié)果顯示,白藜蘆醇聯(lián)用順鉑可促進Eca109/DDP細胞內(nèi)鐵離子的蓄積,并誘導(dǎo)細胞鐵死亡;同時白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用所致的Eca109/DDP細胞增殖抑制作用可被鐵死亡抑制劑Fer-1和鐵離子螯合劑DFO部分逆轉(zhuǎn).結(jié)果表明,白藜蘆醇可通過鐵死亡途徑逆轉(zhuǎn)食管癌順鉑耐藥細胞Eca109/DDP的耐藥性.

鐵離子依賴性脂質(zhì)過氧化是鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵特征,故而細胞內(nèi)調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化和鐵代謝的相關(guān)因子也是調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵因子[12].GPX4是含硒GPX家族的成員之一,可通過催化谷胱甘肽還原反應(yīng),抑制脂質(zhì)過氧化物的蓄積,是抵抗鐵死亡的核心因素[16];ACSL4則是長鏈脂酰CoA合成酶家族的成員之一,可通過參與合成易被氧化的膜磷脂誘發(fā)鐵死亡[17].另一方面,鐵蛋白則是胞內(nèi)鐵的主要儲存形式,由鐵蛋白重鏈1和輕鏈組成,對防止鐵超載進而產(chǎn)生ROS具有重要的意義[18].除了依賴于GPX4的鐵死亡途徑外,P53信號也被證明通過SLC7A11以及ALOX12等途徑參與調(diào)控鐵死亡[19].本實驗的檢測結(jié)果顯示,白藜蘆醇聯(lián)用順鉑可顯著降低Eca109/DDP細胞內(nèi)FTH和GPX4的蛋白表達,而增加ACSL4以及P53的蛋白表達水平,這可能是其促進鐵死亡的調(diào)控機制之一.

4 結(jié)論

綜上所述,白藜蘆醇聯(lián)合順鉑使用可顯著提高食管癌細胞Eca109/DDP對順鉑的敏感性,其作用機制可能是通過影響細胞鐵死亡相關(guān)調(diào)控因子FTH、GPX4、ACSL4和P53的表達,促進細胞內(nèi)二價鐵離子的蓄積,進而誘導(dǎo)細胞鐵死亡.

文章亮點

實驗背景

誘導(dǎo)癌細胞鐵死亡是改善包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞放化療耐藥的重要策略.

實驗動機

白藜蘆醇被報道其可作為多種化療藥的增敏劑,但其在食管癌耐藥細胞的順鉑化療中的作用以及其中是否涉及鐵死亡途徑并不清楚.

實驗?zāi)繕?/p>

探討白藜蘆醇對食管癌耐藥細胞的順鉑敏感性的影響,并驗證鐵死亡途徑在此過程中所起的作用.

實驗方法

白藜蘆醇+順鉑處理Eca109/DDP細胞后,檢測細胞活性和集落形成以驗證白藜蘆醇對順鉑的增敏作用,并檢測鐵死亡關(guān)鍵表征和調(diào)控因子的水平.用鐵死亡抑制劑和鐵離子螯合劑處理細胞,觀察是否消除了白藜蘆醇對順鉑的增敏作用.

實驗結(jié)果

白藜蘆醇在增強Eca109/DDP細胞對順鉑敏感過程中伴隨促進鐵死亡,抑制鐵死亡能在一定程度上消除白藜蘆醇對順鉑的增敏作用.

實驗結(jié)論

白藜蘆醇可通過誘導(dǎo)細胞鐵死亡來恢復(fù)食管癌順鉑耐藥細胞Eca109/DDP對順鉑的敏感性.

展望前景

白藜蘆醇可能是改善食管癌耐藥的潛在藥劑.