防治甜瓜細菌性果斑病種傳病原菌的殺菌劑篩選

林 濤,馬國斌,姜守陽,張克巖,李菊芬*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學院設(shè)施園藝研究所,上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室,上海 201106;2 上海農(nóng)科種子種苗有限公司,上海 201106)

細菌性果斑病(Bacterial fruit blotch,簡稱BFB)是由燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Acidovorax avenaesubsp.citrulli)引起的一種多發(fā)于葫蘆科作物的世界性病害[ 1],也是我國植物檢疫性病害之一。 在高溫高濕環(huán)境下,病原菌可快速繁殖,導致作物在苗期爛苗毀苗[ 2],果實膨大期主要侵染葉片和果實,使其失去商品價值,造成減產(chǎn),嚴重危害我國西瓜、甜瓜及其他葫蘆科作物的生產(chǎn)[ 3]。 由于細菌性果斑病是典型的種傳病害,且其病原菌具有存活時間長、抗逆、抗干旱、抗衰老、致病力強等特點[ 4-6],因此對帶菌種子進行滅菌處理,控制和消除病害的最初侵染來源是防治該病害的關(guān)鍵。

目前,種子發(fā)酵[ 7]、高溫干燥處理[ 8-9]、藥劑處理[ 10-12]等方法均可不同程度地殺滅種子所攜帶的細菌性果斑病菌。 由于藥劑處理方便快捷、效果顯著,因此種子處理的方法多以藥劑處理為主。 目前,關(guān)于甜瓜帶菌種子的藥劑處理雖已有報道,但存在藥劑更新慢、研究結(jié)果不一致等問題[ 13-14]。 本研究選用16 種殺菌劑進行帶菌種子處理試驗,以期建立一套更安全、更高效的甜瓜帶菌種子的處理方法,為甜瓜細菌性果斑病的防治提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甜瓜種子:在新疆繁育的攜帶瓜類細菌性果斑病菌的甜瓜種子。

供試菌株:由中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所提供的細菌性果斑病標準菌株(Acidovoras avenae

subsp.citrulli)。

供試殺菌劑:共16 種,參考推薦使用劑量,每種殺菌劑選擇3 個稀釋倍數(shù),使用無菌水稀釋,現(xiàn)配現(xiàn)用(表1)。

表1 供試殺菌劑Table 1 The tested bactericides

1.2 方法

1.2.1 混菌平板的制作

將培養(yǎng)48 h 的供試菌株配制成108CFU∕mL 的菌懸液,按體積比1∶20 的比例將菌懸液和40 ℃的LB培養(yǎng)基(瓊脂粉用量為15 g∕L)混合均勻,倒板(平板直徑9 cm)后于超凈臺內(nèi)吹干備用[ 15]。

1.2.2 殺菌劑抑菌效果的測定

采用抑菌環(huán)法。 將直徑為6 mm 的滅菌濾紙片置于含菌平板上,每皿3 片,等邊三角形放置。 分別取配制好的殺菌劑5 μL 滴于濾紙片上,于超凈臺內(nèi)吹干,28 ℃下倒置培養(yǎng)48 h 后,用十字交叉法測量抑菌環(huán)直徑[ 15],以無菌水處理為對照,每個處理重復(fù)3 皿。 菌落生長抑菌率=[(處理抑菌環(huán)直徑-對照抑菌環(huán)直徑)∕處理抑菌環(huán)直徑 ] ×100%[ 16]。

1.2.3 種子的殺菌劑處理和PCR 檢測

稱取完整帶菌種子10 g,放入滅菌三角瓶中,加入50 mL 配制好的殺菌劑,分別處理30 min、60 min和90 min 后用流水沖洗3 次,再加入10 mL 無菌水,于28 ℃、220 r∕min 搖培4 h,取1 μL 搖培提取液作為PCR 模板,進行PCR 檢測。 以帶菌種子加入10 mL 無菌水進行搖培作為對照(CK),各處理設(shè)置3 個重復(fù)。

選用特異引物BX-L1:5’-CAGCTGGGAGCGATCTTCAT-3’ 和BX-S-R2:5’-GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA-3’進行PCR 擴增[ 17]。 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PCR 所需試劑均購于天根生化科技(北京)有限公司。 PCR 反應(yīng)體系(25 μL):10 × buffer 2.5 μL,MgCl22 mmol∕L,dNTPs 0.2 mmol∕L,Taq DNA 聚合酶1 U,正反向引物各0.2 μmol∕L,模板1 μL,無菌三蒸水補齊。 擴增條件:95 ℃3 min;94 ℃35 s,60 ℃35 s,72 ℃45 s,35 個循環(huán);72 ℃7 min。 PCR 儀為BIO-Rad T100TM Thermal Cycler。 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和Goldview 染液染色后,于紫外凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 3500)下觀察并拍照[ 18]。

1.2.4 病原菌存活檢測

半選擇性KB 培養(yǎng)基的配制參照李菊芬等[ 9]:蛋白胨20 g∕L,丙三醇10 mL∕L,MgSO4·7H2O 1.5 g∕L,K2HPO41.5 g∕L,瓊脂15 g∕L,pH 調(diào)至7.0,121 ℃滅菌20 min,冷卻至50 ℃時加入氨芐青霉素20 mg∕L、新生霉素5 mg∕L、放線菌酮25 mg∕L。

取1.2.3 節(jié)中的搖培提取液100 μL,于半選擇性KB 培養(yǎng)基上均勻涂板,超凈臺內(nèi)吹干,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h 后觀察結(jié)果。 各處理設(shè)置3 個重復(fù)。 平板上菌落的計數(shù)標準為(個∕皿) -:菌落數(shù)為0;+:0 ＜菌落數(shù)≤10; ++:10 ＜菌落數(shù)≤100; +++:100 ＜菌落數(shù)≤500; ++++:500 ＜菌落數(shù);+++++:菌落長滿整個平板連成片[ 19]。

總菌落DNA 提取及PCR 檢測:無菌水沖洗半選擇性KB 培養(yǎng)基表面上的所有細菌菌落,離心濃縮,并提取基因組DNA[ 18],以此為模板,進行PCR 驗證。 反應(yīng)體系及擴增程序同1.2.3 節(jié)。

1.2.5 殺菌劑處理對種子發(fā)芽的影響

取1.2.3 節(jié)殺菌劑處理后的種子各100 粒,無菌水浸泡12 h 后置于培養(yǎng)皿中,無菌水棉球保濕,35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽24 h,統(tǒng)計發(fā)芽率和根長。

1.2.6 殺菌劑處理對苗期發(fā)病的影響

育苗基質(zhì)采用滅菌的泥炭和蛭石,以體積比3∶1的比例混合,裝入50 孔的育苗穴盤中,用無菌水澆透。 取1.2.3 節(jié)殺菌劑處理后的種子,每個處理播1 盤,各處理重復(fù)3 次。 培養(yǎng)條件為:8 h 光照,28 ℃;16 h 黑暗,20 ℃;濕度50%—70%。 出苗10 d 后,統(tǒng)計發(fā)病率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌劑對甜瓜細菌性果斑病菌的抑菌效果

如圖1 和表2 所示,16 種殺菌劑中僅有5 種能形成不同直徑的抑菌環(huán)。 殺菌劑1 號各稀釋倍數(shù)均具有明顯的抑菌環(huán),其中以100 倍液的抑菌環(huán)直徑最大,抑菌效果最佳,抑菌率可達78.62%;200 倍液和300 倍液的抑菌率分別為68.72%和67.41%。 0.3%四霉素的3 個稀釋倍數(shù)也具有不同直徑的抑菌環(huán),其中以250 倍液的抑菌環(huán)直徑較大,抑菌效果相對較好,抑菌率為60.94%,與500 倍液和750 倍液之間存在顯著差異。 萎銹·福美雙原液和100 倍液也有抑菌效果,且原液和100 倍液的抑菌環(huán)大小存在顯著差異。 2%春雷霉素和4%咯菌·噻霉銅僅原液具有抑菌效果。 綜合考慮藥劑的抑菌效果及實際使用成本,后續(xù)試驗分別選用殺菌劑1 號200 倍液、萎銹·福美雙100 倍液和0.3%四霉素250 倍液進行。

圖1 不同殺菌劑對甜瓜細菌性果斑病菌的抑菌環(huán)比較Fig.1 Comparison of antibacterial rings of different bactericides against bacterial fruit blotch pathogens in melon

表2 不同殺菌劑對甜瓜細菌性果斑病菌的抑菌效果Table 2 Antibacterial effects of different bactericides on bacterial fruit blotch pathogens in melon

2.2 不同殺菌劑的殺菌效果

2.2.1 PCR 檢測

依據(jù)抑菌環(huán)結(jié)果,用殺菌劑1 號200 倍液、萎銹·福美雙100 倍液和0.3%四霉素250 倍液對帶菌種子分別進行30 min、60 min 和90 min 的殺菌處理,并以處理后的種子搖培液為模板進行PCR 檢測。 如圖2 所示,所有處理均能檢測到特異性目的條帶(279 bp)。

圖2 不同殺菌劑處理帶菌種子的PCR 檢測Fig.2 PCR detection of seed treated with different bactericides

2.2.2 活菌分離和病原菌檢測

為進一步檢驗殺菌劑處理后是否還有存活的細菌性果斑病菌,進行了活菌分離驗證。 結(jié)果表明:殺菌劑1 號200 倍液分別處理帶菌種子30 min、60 min 和90 min 后,半選擇性KB 培養(yǎng)基上均無菌落長出,病原菌被有效殺滅。 帶菌種子經(jīng)萎銹·福美雙100 倍液處理30 min、60 min 和90 min 后,平板上均長滿菌落,與對照相當;經(jīng)0.3%四霉素250 倍液處理不同時間后,48 h 內(nèi)長出的菌落數(shù)量與對照相比均明顯減少(表3)。 對半選擇性KB 平板上長出的總菌落進行DNA提取及病原菌PCR 檢測,如圖3 所示,均能檢測到細菌性果斑病菌的特異性目的條帶(279 bp),表明帶菌種子經(jīng)0.3%四霉素250 倍液和萎銹·福美雙100 倍液處理后仍有部分病原菌存活。

圖3 半選擇性KB 培養(yǎng)基上總菌落的PCR 檢測Fig.3 PCR detection of bacterial colonies on semi-selective KB medium

表3 不同殺菌劑處理后的種子懸浮液在半選擇性KB 培養(yǎng)基上的涂板結(jié)果Table 3 Culture results of seed suspensions treated with different fungicides on semi-selective KB medium

綜上可知,帶菌種子經(jīng)殺菌劑1 號200 倍液處理后未能分離出病原活菌,殺菌效果最佳;其次是0.3%四霉素250 倍液,處理后雖仍能檢測到病原活菌,但菌落總數(shù)比對照明顯減少;而萎銹·福美雙100倍液處理后既能檢測到病原活菌,且菌落總數(shù)與對照無明顯差異。 故選取前2 種殺菌劑進行后續(xù)種子發(fā)芽及苗期發(fā)病試驗。

2.3 殺菌劑處理對種子發(fā)芽的影響

依據(jù)病原菌存活檢測的結(jié)果,選取經(jīng)殺菌劑1 號200 倍液和0.3%四霉素250 倍液處理后的種子進行發(fā)芽試驗,結(jié)果表明:所有處理及對照的發(fā)芽率均在90%以上。 與對照(95.9%)相比,除殺菌劑1 號200 倍液處理30 min 后發(fā)芽率(93.9%)略有降低外,其他處理均高于對照。 帶菌種子經(jīng)殺菌劑1 號200 倍液分別處理30 min 和60 min 后,平均根長與對照相比無顯著差異;但處理90 min 后,平均根長顯著低于對照。 帶菌種子經(jīng)過0.3%四霉素250 倍液分別處理30 min、60 min 和90 min 后,平均根長與對照相比均有顯著提高(表4)。

表4 不同殺菌劑處理對種子發(fā)芽的影響Table 4 Effects of different bactericides on seed germination

2.4 殺菌劑處理對苗期發(fā)病的影響

出苗10 d 后,幼苗開始出現(xiàn)病癥。 如表5 所示,帶菌甜瓜種子經(jīng)0.3%四霉素250 倍液和殺菌劑1 號200 倍液處理后,苗期的發(fā)病率與對照相比均有顯著降低,但該2 種殺菌劑不同處理時間的苗期發(fā)病率無顯著差異。

表5 不同殺菌劑處理對幼苗發(fā)病率的影響Table 5 Effects of different bactericides on incidence rate of seedlings

3 結(jié)論與討論

甜瓜細菌性果斑病的傳播主要依賴于種子帶菌傳播,播種后在設(shè)施內(nèi)的高溫、高濕環(huán)境下,病害可迅速蔓延[ 20]。 因此,種子殺菌處理是防治甜瓜細菌性果斑病的有效手段。

本研究通過抑菌環(huán)試驗,對16 種殺菌劑進行了篩選,發(fā)現(xiàn)其中5 種殺菌劑對細菌性果斑病菌有不同程度的抑菌效果。 結(jié)合實際使用成本,選用抑菌效果較好的3 種殺菌劑(殺菌劑1 號200 倍液、萎銹·福美雙100 倍液和0.3%四霉素250 倍液)對帶菌種子進行處理。 經(jīng)PCR 檢測,處理后的種子均能檢測到特異性目的條帶;進一步活菌分離試驗發(fā)現(xiàn),殺菌劑1 號200 倍液處理帶菌種子后,在半選擇性培養(yǎng)基上無菌落長出,0.3%四霉素250 倍液處理檢測到的菌落總數(shù)與對照相比明顯減少,而萎銹·福美雙100 倍液的處理與對照無明顯差異。 殺菌劑1 號的有效成分為異噻唑啉酮和二硫氰甲烷[ 19],在殺菌過程中可使病原菌的蛋白質(zhì)變性,消滅細胞的活性,也可使病原菌的遺傳基因發(fā)生變異或干擾細胞內(nèi)部酶的活性使其難以繁殖生長,從而起到抑制作用[ 21];0.3%四霉素屬于抗生素類殺菌劑,主要對病原菌的細胞壁、細胞膜、蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)及能量代謝系統(tǒng)等起作用,還可作用于植物,激發(fā)抗性防御反應(yīng)[ 22]。 另外,帶菌種子經(jīng)殺菌劑處理后雖然PCR 檢測結(jié)果仍然為陽性,但病菌可能已被殺死,PCR 檢測到的可能是部分死菌的殘留DNA,這與李菊芬等研究結(jié)果一致[ 9]。 因此,PCR 檢測具有一定的局限性,應(yīng)進一步結(jié)合活菌分離試驗,這樣的檢測結(jié)果才更可靠。

種子發(fā)芽試驗表明,與對照相比,殺菌劑1 號200 倍液和0.3%四霉素250 倍液分別處理30 min、60 min 和90 min 后對種子發(fā)芽率無明顯影響;但殺菌劑1 號200 倍液處理90 min 后對平均根長有顯著抑制作用,其有效成分異噻唑啉酮和二硫氰甲烷均具有一定腐蝕性[ 19],隨著處理時間的延長,滲透過種皮,可能對種胚造成一定影響,延緩了根的伸長。 0.3%四霉素250 倍液的主要成分為抗生素,經(jīng)微生物發(fā)酵獲得,內(nèi)含的有機營養(yǎng)成分可能對胚根生長具有一定促進作用。

苗期發(fā)病試驗顯示,經(jīng)殺菌劑1 號200 倍液和0.3%四霉素250 倍液處理后的帶菌種子,其苗期發(fā)病率與對照相比均顯著降低,且同一殺菌劑不同時間處理的苗期發(fā)病率之間無顯著差異。 雖然在殺菌劑1號200 倍液處理后的帶菌種子中未檢測到病原活菌,但在苗期依然有一定的發(fā)病率,這可能是由于甜瓜細菌性果斑病菌不僅存活于種子表面,種子內(nèi)部也有寄藏,且具有高抗逆性和存活時間較長的特點,因而對檢測和殺菌造成難度[ 23]。

綜上,采用殺菌劑1 號200 倍液或者0.3%四霉素250 倍液處理帶菌甜瓜種子60 min,可有效殺滅種子所攜帶的細菌性果斑病菌,而且對種子發(fā)芽和生長無明顯不良影響,還可顯著降低幼苗的發(fā)病率。 種子處理可從源頭對病害進行預(yù)防和控制,對甜瓜生產(chǎn)實踐具有重要的應(yīng)用價值。