中藥調(diào)周對(duì)薄型子宮內(nèi)膜患者Wnt/β-catenin 信號(hào)通路及臨床妊娠結(jié)局的影響

李海霞 夏正明 蘇寧 彭婭婭 王維 羅小歡 蔡美虹 夏薇

不孕癥是一種以正常性交12 個(gè)月后臨床妊娠失敗為特征的疾病,未受孕。據(jù)估計(jì),全球育齡夫婦的不孕癥發(fā)生率在8%～12%［1］。對(duì)于女性不孕癥的阻礙正常著床和妊娠的因素,胚胎和子宮內(nèi)膜質(zhì)量共擔(dān)責(zé)任［2］。FET 在過去十年中隨著手術(shù)適應(yīng)證的擴(kuò)大而急劇增加,部分原因是與較舊的慢速冷凍方法相比,玻璃化冷凍技術(shù)的改進(jìn)［3］。FET 技術(shù)可以促進(jìn)選擇性單胚胎移植,減少卵巢過度刺激綜合征,優(yōu)化子宮內(nèi)膜容受性,為植入前遺傳學(xué)檢測(cè)留出時(shí)間,并促進(jìn)保存生育力。薄型子宮內(nèi)膜被定義為在排卵當(dāng)天,或在新鮮體外受精(IVF)周期中注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)當(dāng)天,或在FET 周期中開始黃體酮治療當(dāng)天<7 mm［4］。在輔助生殖技術(shù)周期中,薄型子宮內(nèi)膜的發(fā)生率約為2.4%,并且與較低的著床率和妊娠率有關(guān)［5］。研究表明子宮內(nèi)膜厚度與循環(huán)雌激素增加直接相關(guān)［6］。此外,子宮內(nèi)膜厚度與子宮內(nèi)膜容受性有關(guān),可以作為輔助生殖成功的預(yù)測(cè)指標(biāo)［7］。故本研究針對(duì)薄型子宮內(nèi)膜患者在FET 助孕前給予中藥調(diào)周療法,以活血化瘀為核心,以期達(dá)到祛瘀生新,提高胚胎著床率和臨床妊娠率的目的。

1 資料與方法

1.1 試劑及儀器 SP 免疫組織化學(xué)試劑及Western blot檢測(cè)試劑(武漢谷歌生物科技有限公司),β-catenin、Integrin β3 一抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)。脫水機(jī)、包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；顯微鏡及成像系統(tǒng)(尼康,日本)；電泳儀(北京六一儀器廠)；灰度分析軟件(Alpha innotech,美國(guó))；Image J 圖像處理軟件(Adobe 系統(tǒng)公司,美國(guó))。

1.2 一般資料 選取本中心2021 年3 月～2022 年9 月進(jìn)入FET 周期的100 例薄型子宮內(nèi)膜患者,年齡25～35 歲,月經(jīng)周期28～32 d,未合并子宮肌瘤以及內(nèi)外科合并癥,近3 個(gè)月內(nèi)未采用過激素治療。將其隨機(jī)分為中藥調(diào)周組和對(duì)照組,每組50 例。另選取同時(shí)期50 例正常受試者作為正常組。

1.3 方法

1.3.1 治療方案 三組均予HRT 方案準(zhǔn)備內(nèi)膜；中藥調(diào)周組則在此基礎(chǔ)上同時(shí)予中藥調(diào)周,中藥調(diào)周組在行FET 前,在辯證論治的基礎(chǔ)上,給予3 個(gè)月經(jīng)周期的中藥周期治療。

HRT 方案：患者于月經(jīng)1～3 d 服用戊酸雌二醇或17p 雌二醇,初始劑量4 mg/d,連續(xù)口服5 d,劑量改為6 mg/d,連續(xù)口服5 d,然后超聲檢查子宮內(nèi)膜厚度,根據(jù)檢查結(jié)果適當(dāng)調(diào)整用藥時(shí)間及劑量,口服雌激素藥時(shí)間<21 d。隨后患者加用孕激素。當(dāng)內(nèi)膜厚度達(dá)到較為理想時(shí)根據(jù)患者情況可行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化。雌激素戊酸雌二醇片(商品名：補(bǔ)佳樂)用藥可遵循內(nèi)膜準(zhǔn)備方案,排除生化妊娠后逐漸減藥至停藥,常規(guī)內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日后5 d 行FET。

1.3.2 藥物 中藥調(diào)周(包括經(jīng)后增殖方和促黃體方),為廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)?；颊咴陆?jīng)周期開始后給予促黃體顆粒加減,排卵期(子宮內(nèi)膜增殖期)行FET,再給予促黃體顆粒加減。

經(jīng)后增殖方：含有炙甘草6 g、黨參15 g、當(dāng)歸6 g、川芎6 g、白芍12 g、白術(shù)12 g、茯苓12 g、菟絲子15 g、熟地12 g、杜仲15 g、鹿角霜10 g、山萸肉10 g、川椒3 g。煎成20 ml,制成顆粒劑10 g,相當(dāng)于生藥量134 g。1 包/d,2 次/d,分早晚服用,于排卵期起開始口服。月經(jīng)的1～3 d 或發(fā)現(xiàn)妊娠則停藥。1 個(gè)月經(jīng)周期為1 個(gè)療程,共觀察3 個(gè)月經(jīng)周期。

促黃體方：含有熟地15 g、山藥15 g、枸杞15 g、山萸肉10 g、菟絲子15 g、鹿角膠10 g、龜板12 g、黨參15 g、白術(shù)15 g、扁豆15 g、苡米15 g、茯苓15 g。煎成20 ml,制成顆粒劑10 g,相當(dāng)于生藥量167 g。1 包/d,2 次/d 分早晚服用,于經(jīng)前口服到月經(jīng)的1～3 d 停藥,改服經(jīng)后增殖方?；颊呷舭l(fā)現(xiàn)妊娠則繼續(xù)開始服用。

1.3.3 組織來源 三組中,因胚胎情況或其他原因而取消移植的患者,在擬移植當(dāng)天,采用一次性子宮內(nèi)膜采集器獲取子宮內(nèi)膜組織做進(jìn)一步的病理檢查,以排除內(nèi)膜病變,部分內(nèi)膜組織使用4%多聚甲醛固定液固定,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 比較三組子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 表達(dá)；β-catenin、Integrin β3 mRNA 表達(dá)；β-catenin、Integrin β3 蛋白表達(dá)；比較對(duì)照組和中藥調(diào)周組患者子宮內(nèi)膜厚度、PI、RI、IR、PR。臨床妊娠：FET 后5 周陰道B 超下可見孕囊及胎心者。胚胎著床數(shù)：臨床妊娠確立后,B 超下檢查到的著床胚胎總數(shù)。PR=臨床妊娠例數(shù)/總例數(shù)×100%。IR=胚胎著床數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。

1.4.1 子宮內(nèi)膜厚度的測(cè)定 經(jīng)過一系列準(zhǔn)備工作后,在二維超聲模式下,顯示患者的子宮正中矢狀切面,清楚獲得宮腔線后,在子宮最大縱斷面距宮底2 cm 處,垂直于宮腔線,測(cè)量?jī)?nèi)膜厚度(子宮內(nèi)膜與子宮肌層的回聲界面的最大間距)。

1.4.2 子宮內(nèi)膜血流參數(shù)的測(cè)定 用彩色顯像功能表現(xiàn)子宮內(nèi)膜動(dòng)脈,在合適的血流頻譜中測(cè)出連續(xù)的2～6 個(gè)波形圖,計(jì)算內(nèi)膜下PI、RI,連續(xù)測(cè)量3 次,取平均值。

1.4.3 免疫組織化學(xué)染色 固定后的子宮內(nèi)膜組織,通過石蠟包埋切片,隨后SP 三步法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中β-catenin、Integrinβ3 表達(dá)。每張切片選擇3～5 個(gè)高倍鏡視野,利用分析軟件測(cè)定實(shí)驗(yàn)各組平均光密度(AOD)值。

1.4.4 Western blot 法檢測(cè) 提取患者的子宮內(nèi)膜組織總蛋白,BCA蛋白濃度檢測(cè)后,SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后使用脫脂奶粉進(jìn)行封閉,隨后分別加入一抗孵育1 h 和二抗孵育1.5 h。顯色劑顯色后,軟件分析目的條帶灰度值。

1.4.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)β-catenin、Integrinβ3 基因 采用RNA 提取試劑盒,提取子宮內(nèi)膜組織總RNA。逆轉(zhuǎn)錄后使用cDNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)β-catenin、Integrinβ3 在不同分組的子宮內(nèi)膜組織中基因表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 表達(dá)比較 β-catenin 主要在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。Integrinβ3 主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮。免疫組化染色可見深淺不一的棕黃色顆粒沉淀。中藥調(diào)周組子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 表達(dá)分別為(0.286±0.031)、(0.292±0.023),均高于對(duì)照組的(0.201±0.035)、(0.198±0.056),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥調(diào)周組與正常組子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 表達(dá)比較()

表1 三組子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 表達(dá)比較()

注：與對(duì)照組比較,aP<0.05

2.2 三組子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 mRNA 表達(dá)比較 中藥調(diào)周組患者子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 mRNA 表達(dá)分別為(0.498±0.047)、(0.591±0.026),均高于對(duì)照組的(0.176±0.036)、(0.218±0.075),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥調(diào)周組與正常組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 mRNA 表達(dá)比較()

表2 三組子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 mRNA 表達(dá)比較()

注：與對(duì)照組比較,aP<0.05

2.3 三組子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 蛋白表達(dá)比較 中藥調(diào)周組的子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3蛋白表達(dá)分別為(0.999±0.074)、(0.978±0.089),均高于對(duì)照組的(0.080±0.057)、(0.130±0.068),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥調(diào)周組與正常組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 三組子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 蛋白表達(dá)比較()

表3 三組子宮內(nèi)膜β-catenin、Integrin β3 蛋白表達(dá)比較()

注：與對(duì)照組比較,aP<0.05

2.4 對(duì)照組與中藥調(diào)周組患者子宮內(nèi)膜厚度、PI、RI比較 中藥調(diào)周組PI(1.43±0.32)、RI(0.74±0.31)均低于對(duì)照組的(1.87±0.12)、(0.96±0.21),子宮內(nèi)膜厚度(8.97±1.23)mm 厚于對(duì)照組的(7.60±0.51)mm,IR 36.00%(18/50)、PR 56.00%(28/50)高于對(duì)照組的12.00%(6/50)、24.00%(12/50),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 對(duì)照組與中藥調(diào)周組患者子宮內(nèi)膜厚度、PI、RI 比較()

表4 對(duì)照組與中藥調(diào)周組患者子宮內(nèi)膜厚度、PI、RI 比較()

注：與對(duì)照組比較,aP<0.05

3 討論

中藥調(diào)周法是以中醫(yī)整體觀為指導(dǎo),采用補(bǔ)腎和活血調(diào)經(jīng)交替的周期序貫治療方法［8］。腎為先天之本,生殖之源,腎虛則胎孕難成,故治療不孕癥從腎入手,是古今醫(yī)家公認(rèn)之法。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“肝腎同源”,肝藏血,主疏泄,肝氣條達(dá)則血脈流通；肝失疏泄,月經(jīng)不調(diào),則自然難受孕。血瘀是不孕癥的另一個(gè)重要因素,因婦人多憂郁,氣機(jī)不暢,氣滯則血瘀,淤血阻于胞宮,兩精不能結(jié)合,以致不孕。因此,補(bǔ)腎、調(diào)肝、活血化瘀為治療不孕癥的主要治療方法［9,10］。本研究根據(jù)輔助生殖技術(shù)各環(huán)節(jié)的用藥特點(diǎn),并結(jié)合月經(jīng)周期的規(guī)律性特點(diǎn)對(duì)患者加用補(bǔ)氣血益肝腎的藥物進(jìn)行調(diào)理。促黃體顆粒、經(jīng)后增殖顆粒周期性使用在本研究中作用顯著,提高了患者的IR、PR。

人類子宮內(nèi)膜在胚胎植入過程中起關(guān)鍵作用。當(dāng)子宮內(nèi)膜被評(píng)估為“薄”時(shí),醫(yī)生和患者將面臨是否繼續(xù)周期治療的決定。子宮內(nèi)膜厚度的測(cè)量是臨床實(shí)踐中最常用的方法。治療子宮內(nèi)膜薄的患者仍然是臨床醫(yī)生面臨的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)［11］。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是胚胎發(fā)育和成人組織穩(wěn)態(tài)再生所必需的,該信號(hào)通路是通過激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin,當(dāng)β-catenin 水平低下時(shí),Wnt 信號(hào)通路關(guān)閉［12］。研究顯示,補(bǔ)腎活血中藥可通過激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路作用于子宮內(nèi)膜干細(xì)胞,改善薄型子宮內(nèi)膜的厚度,從而影響妊娠結(jié)局［13］。此外Integrinβ3 的表達(dá)與子宮內(nèi)胎兒的著床有著一定的關(guān)系,Integrinβ3 主要存在于子宮內(nèi)膜腺上皮,在一定程度上可以反應(yīng)子宮內(nèi)膜容受性［14,15］。

本研究發(fā)現(xiàn),FET 周期的薄型子宮內(nèi)膜患者在FET 進(jìn)行前,通過中藥調(diào)周對(duì)患者進(jìn)行3 個(gè)月的月經(jīng)調(diào)理,可以提高β-catenin、Integrinβ3 在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平,同時(shí)治療后患者子宮內(nèi)膜的厚度明顯增加,IR、PR 比對(duì)照組明顯的增加,這可能與β-catenin 表達(dá)量的提高激活了Wnt 信號(hào)通路,從而對(duì)病理性薄型子宮內(nèi)膜有進(jìn)一步的修復(fù)作用。

綜上所述,中藥調(diào)周可能通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與薄型子宮內(nèi)膜的修復(fù),促進(jìn)子宮內(nèi)膜容受性的建立,進(jìn)而改善FET 周期中薄型子宮內(nèi)膜患者的妊娠結(jié)局。