7 種生物藥劑對(duì)鐵皮石斛層出鐮刀菌的生物活性及其協(xié)同作用

劉惠芳，田旭軍，王曉敏，肖彩云，李榮玉

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2.貴州大學(xué) 作物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省亞熱帶作物研究所，貴州 興義 562400）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）屬蘭科石斛屬（Dendrobium）草本植物，是一種珍貴的中藥材，富含豐富的單糖、多糖、多酚、生物堿等多種成分，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力和降血糖等多重功效，被稱為九大仙草之首，具有重要的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-5]。作為貴州十二大特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)之一的鐵皮石斛發(fā)展較快，截至2022 年底，貴州石斛栽培面積約10 666.7 hm2，其中鐵皮石斛面積約4 520 hm2[6-8]。但隨著鐵皮石斛人工種植規(guī)模的擴(kuò)大，病害的發(fā)生也越來(lái)越嚴(yán)重，其中由終極腐霉（Pythium ultimum）、細(xì)菌類歐式桿菌（Erwinia）和層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）等病原菌引起的軟腐病成為鐵皮石斛重要的病害之一，病原菌主要侵染鐵皮石斛的莖基部和莖，導(dǎo)致鐵皮石斛枯萎死亡[9]。該病全年均有發(fā)生，嚴(yán)重影響鐵皮石斛的產(chǎn)量和質(zhì)量。由于鐵皮石斛藥用的特殊性，化學(xué)農(nóng)藥的使用受到限制[10-11]。因此，鐵皮石斛軟腐病的防治手段主要包括選用抗病品系，對(duì)幼苗進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，加強(qiáng)栽培管理、創(chuàng)造良好的生長(zhǎng)條件以及進(jìn)行生物防治[12]。目前，對(duì)鐵皮石斛病害的防控研究主要集中在田間病害調(diào)查和藥劑篩選等方面。如謝顯彪等[13]明確了吡萘·嘧菌酯、肟菌·戊唑醇對(duì)石斛銹病具有較高的田間防效；沈偉東等[14]篩選出對(duì)鐵皮石斛輪紋病病原菌露濕漆斑菌菌絲生長(zhǎng)具有較好抑制作用的藥劑有4 種，分別為春雷霉素、氟菌·肟菌酯、吡萘·嘧菌酯和甲基硫菌靈；而關(guān)于鐵皮石斛層出鐮刀菌的研究相對(duì)較少，且報(bào)道的低毒高效藥劑主要有福·福鋅、咪鮮胺和吡唑醚菌酯等[15]。為此，測(cè)定了7 種生物藥劑對(duì)鐵皮石斛層出鐮刀菌的毒力及其較好藥劑的協(xié)同作用，以期為鐵皮石斛田間病害防治提供藥劑選擇和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌 鐵皮石斛層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）：2019 年從貴州興義采集鐵皮石斛軟腐病病株，經(jīng)分離純化得到，保存于貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)安實(shí)驗(yàn)室[16]。

1.1.2 供試生物藥劑 0.3%丁子香酚可溶液劑（A，簡(jiǎn)稱丁子香酚，南通神雨綠色藥業(yè)有限公司）、0.5%大黃素甲醚水劑（B，大黃素甲醚，內(nèi)蒙古清源保生物科技有限公司）、1%蛇床子素水乳劑（C，蛇床子素，內(nèi)蒙古清源保生物科技有限公司）、0.3%四霉素水劑（D，四霉素，遼寧微科生物工程股份有限公司）、12%中生菌素可濕性粉劑（E，中生菌素，福建凱立生物制品有限公司）、6%春雷霉素可濕性粉劑（F，春雷霉素，華北制藥河北華諾有限公司）、1%申嗪霉素懸浮劑（G，申嗪霉素，上海農(nóng)樂(lè)生物制品股份有限公司）。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、純凈水1 000 mL；煮好后放入HIRAYAMA 滅菌器中，在溫度為121 ℃的條件下滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右備用。

1.1.4 儀器設(shè)備 HIRAYAMA-50 滅菌器（日本HIRAYAMA 公司）、SJ-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）、BIC-400 人工氣候箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、10 mL 離心管、1 mL和5 mL移液槍、10 mL量杯、9 mm培養(yǎng)皿等。

1.2 方法

1.2.1 層出鐮刀菌對(duì)7 種生物藥劑的敏感性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[16-17]測(cè)定丁子香酚、春雷霉素和大黃素甲醚等7種生物藥劑對(duì)鐵皮石斛層出鐮刀菌的毒力。將藥劑根據(jù)所設(shè)質(zhì)量濃度梯度用無(wú)菌水配制成含丁子香酚1、3、9、27、81 μg/mL，含大黃素甲醚40、120、360、1 080、3 240 μg/mL，含蛇床子素15、45、135、405、1 215 μg/mL，含四霉素2、8、14、20、26 μg/mL，含中生菌素40、80、160、320、640 μg/mL，含春雷霉素120、360、1 080、3 240、9 720 μg/mL，含申嗪霉素3、15、27、39、51 μg/mL 的不同質(zhì)量濃度母液。將培養(yǎng)基和藥劑以體積比為9∶1倒入直徑9 mm 的培養(yǎng)皿中，制成含藥PDA 平板。并將培養(yǎng)好的層出鐮刀菌用直徑5 mm 的打孔器沿菌落邊緣進(jìn)行打孔，接種至含不同藥劑的PDA 平板中央，以不含藥劑的PDA 平板作為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次，置于溫度28 ℃、濕度40%、黑暗的人工氣候箱中培養(yǎng)5 d。待菌絲生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿2/3 時(shí)采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。取其平均值作為最終的菌落直徑，用公式（1）計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。對(duì)各處理濃度對(duì)數(shù)（X）與抑制率值（Y）進(jìn)行回歸分析，利用DPS 18.10 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算有效抑制中濃度（EC50）和毒力回歸方程。

1.2.2 生物藥劑組合對(duì)鐵皮石斛層出鐮刀菌的協(xié)同作用測(cè)定 參考趙琪君等[18]的方法，測(cè)定不同組合對(duì)層出鐮刀菌的毒力。根據(jù)單劑的EC50值，設(shè)置丁子香酚、蛇床子素、四霉素和申嗪霉素的不同組合（質(zhì)量比9∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶9）進(jìn)行聯(lián)合毒力測(cè)定，篩選最佳混配組合。按照1.2.1的方法制作含藥PDA 平板。將培養(yǎng)好的層出鐮刀菌用直徑5 mm 的打孔器沿菌落邊緣進(jìn)行打孔，用接種針將菌餅菌絲面朝下接種到含藥PDA 平板中央，以不含藥劑的PDA 平板作為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。置于溫度28 ℃、濕度40%、黑暗的人工氣候箱中培養(yǎng)5 d。待菌絲生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿2/3時(shí)采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。取其平均值作為最終的菌落直徑，并計(jì)算單劑及各比例的EC50值。根據(jù)孫云沛法[19]進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，將各處理的EC50值換算實(shí)際毒力指數(shù)（ATI）；根據(jù)組合比例，計(jì)算理論混用毒力指數(shù)（TTI）。按照公式（2）（3）（4）（5）計(jì)算各組合各比例的共毒系數(shù)（CTC）[20]。

并根據(jù)孫云沛法判斷各組合各比例是否對(duì)鐵皮石斛軟腐病菌層出鐮刀菌具有增效作用。若CTC≤80，為拮抗作用；80～120 為相加作用；≥120 為增效作用。

1.2.3 生物藥劑組合對(duì)鐵皮石斛軟腐病的室內(nèi)防治試驗(yàn) 采用針刺法[21]測(cè)定丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素和蛇床子素+四霉素對(duì)鐵皮石斛軟腐病的防治效果。依據(jù)藥劑推薦濃度，將丁子香酚、蛇床子素、四霉素和申嗪霉素分別稀釋至2.7、12.78、1.66 μg/mL 和0.59 μg/mL，同時(shí)設(shè)置處理丁子香酚+蛇床子素（使用劑量為2.57+0.29 μg/mL）、蛇床子素+四霉素（0.62+0.62 μg/mL）、蛇床子素+申嗪霉素（0.63+0.08 μg/mL）。選取大小一致的鐵皮石斛幼苗移入育苗盆缽中，待其直立、生長(zhǎng)正常后，用75%的乙醇對(duì)針進(jìn)行表面消毒，然后刺傷鐵皮石斛的莖基部1～2次，刺傷但不能穿透，用直徑5 mm 的打孔器沿培養(yǎng)好的層出鐮刀菌邊緣進(jìn)行打孔制作菌餅。治療作用測(cè)定：將菌餅接到傷口，使鐵皮石斛發(fā)病到3 級(jí)左右，取5 mL 藥劑進(jìn)行噴施處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，在噴藥后3、7、14 d分別調(diào)查各處理的發(fā)病情況。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為，0 級(jí)：無(wú)病斑；1級(jí)：病斑直徑為莖部圓周的1/8 以下；3 級(jí)：病斑直徑為莖部圓周1/8～1/4（含1/8）；5 級(jí)：病斑直徑為莖部圓周1/4～1/2（含1/4）；7 級(jí)：病斑直徑為莖部圓周1/2～3/4（含1/2）；9 級(jí)：病斑直徑為莖部圓周3/4～1（含3/4）。按照公式（6）和（7）計(jì)算相應(yīng)的防效。

預(yù)防作用測(cè)定：先進(jìn)行噴藥處理，待藥劑干燥后，用75%的乙醇對(duì)針進(jìn)行表面消毒，然后刺傷鐵皮石斛的莖基部1～2 次，并將菌餅接到傷口。調(diào)查方法及調(diào)查時(shí)間與治療作用測(cè)定一致。

1.2.4 生物藥劑組合對(duì)鐵皮石斛軟腐病的田間防治試驗(yàn) 試驗(yàn)在貴州省興義市進(jìn)行，選取1 年生且長(zhǎng)勢(shì)一致的鐵皮石斛進(jìn)行田間防效試驗(yàn)。各處理分別為0.3% 丁子香酚可溶液劑（有效成分用量0.24 g/hm2）、1%蛇床子素水乳劑（0.50 g/hm2）、0.3%四霉素水劑（0.15 g/hm2）、1% 申嗪霉素懸浮劑（1.00 g/hm2）、丁子香酚+蛇床子素（0.18+0.02 g/hm2）、蛇床子素+四霉素（0.20+0.20 g/hm2）、蛇床子素+申嗪霉素（0.90+0.10 g/hm2）以及清水對(duì)照共8個(gè)處理，每個(gè)處理小區(qū)面積為30 m2，設(shè)置3 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。采用3WBJ-16DZ 多功能靜電噴霧器噴藥，全株均勻噴霧。藥后30 d 進(jìn)行調(diào)查，調(diào)查方法根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17980.19—2000《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》的規(guī)定進(jìn)行，以株為單位，根據(jù)鐵皮石斛葉片和莖的危害癥狀程度進(jìn)行分級(jí)，各小區(qū)采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行調(diào)查，每點(diǎn)調(diào)查10 株，并記錄總株數(shù)、病株數(shù)和病級(jí)數(shù)。按照公式（6）和（7）計(jì)算病情指數(shù)和田間防治效果。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析以及表格繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種生物藥劑對(duì)鐵皮石斛層出鐮刀菌的生物活性分析

7 種生物藥劑對(duì)鐵皮石斛層出鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)具有一定的抑制效果（表1）。其中，抑制效果較好的為丁子香酚、四霉素和申嗪霉素，其EC50值分別為0.38、0.32、1.85 μg/mL；蛇床子素、中生菌素次之，其EC50值分別為4.92、8.13 μg/mL；再次為大黃素甲醚，其EC50值為43.20 μg/mL；而春雷霉素對(duì)層出鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果較弱，其EC50值達(dá)240.03 μg/mL。

表1 7種生物藥劑對(duì)層出鐮刀菌的生物活性Tab.1 Biological activity of seven biopesticides against Fusarium proliferatum

2.2 生物藥劑組合對(duì)鐵皮石斛層出鐮刀菌的協(xié)同作用

生物藥劑組合對(duì)鐵皮石斛層出鐮刀菌的協(xié)同作用結(jié)果如表2 所示，丁子香酚、蛇床子素、申嗪霉素以及四霉素4 個(gè)單劑和25 個(gè)生物藥劑組合對(duì)鐵皮石斛軟腐病致病菌（層出鐮刀菌）均有較好的抑制作用。丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素、蛇床子素+四霉素、四霉素+申嗪霉素4個(gè)組合以有效質(zhì)量比分別為1∶9、3∶1、1∶9、1∶3 時(shí)，其CTC 值均小于80，表現(xiàn)為拮抗作用。其余組合表現(xiàn)為相加作用或增效作用。其中，丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素和蛇床子素+四霉素3個(gè)組合分別以有效質(zhì)量比為9∶1、1∶1 和9∶1 時(shí)增效顯著，其CTC值分別為325.38、236.46 和541.53，EC50值分別為2.86、1.23 μg/mL和0.75 μg/mL。

表2 丁子香酚、蛇床子素、四霉素和申嗪霉素組合對(duì)層出鐮刀菌的協(xié)同作用Tab.2 Synergistic effects of eugenol，osthole，tetramycin and shenqinmycin against Fusarium proliferatum

2.3 增效組合對(duì)鐵皮石斛軟腐病的防治效果

2.3.1 室內(nèi)防效 丁子香酚、蛇床子素、四霉素和申嗪霉素4個(gè)單劑以及丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素、蛇床子素+四霉素均對(duì)鐵皮石斛軟腐病有一定的預(yù)防作用和治療作用（表3 和表4）。其中，丁子香酚+蛇床子素（9∶1）對(duì)鐵皮石斛軟腐病具有較好的預(yù)防作用，3、7、14 d 的防效分別為100%、80.00%、77.78%，均高于單劑和其他組合；且其治療作用也較好，14 d時(shí)，其防效高達(dá)90.91%。

表3 增效組合對(duì)鐵皮石斛軟腐病的預(yù)防作用Tab.3 Preventive effect of synergistic combinations on soft rot of Dendrobium officinale

表4 增效組合對(duì)鐵皮石斛軟腐病的治療作用Tab.4 Therapeutic effect of synergistic combinations on soft rot of Dendrobium officinale

2.3.2 田間防效 增效組合對(duì)鐵皮石斛軟腐病的田間防效如表5所示。丁子香酚、蛇床子素、四霉素和申嗪霉素4個(gè)單劑以及丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素、蛇床子素+四霉素對(duì)鐵皮石斛軟腐病的田間防效均高于55.36%。其中，增效組合對(duì)鐵皮石斛軟腐病的田間防效均優(yōu)于單劑，且當(dāng)丁子香酚+蛇床子素以有效質(zhì)量比為9∶1時(shí)，對(duì)鐵皮石斛軟腐病的田間防效最好，高達(dá)69.46%。

表5 增效組合對(duì)鐵皮石斛軟腐病的田間防效Tab.5 Control effects of synergistic combinations on soft rot of Dendrobium officinale in field

3 結(jié)論與討論

鐵皮石斛作為一種珍貴的中藥材，具有重要的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。野生鐵皮石斛不能滿足人們的需要，因此，人工種植鐵皮石斛成為鐵皮石斛的主要來(lái)源。但隨著鐵皮石斛人工種植規(guī)模的擴(kuò)大，病害的發(fā)生也越來(lái)越嚴(yán)重，其中終極腐霉、細(xì)菌類歐式桿菌和層出鐮刀菌等病原菌引起的軟腐病是鐵皮石斛上的重要病害，嚴(yán)重影響鐵皮石斛的產(chǎn)量和質(zhì)量。

本研究明確了丁子香酚、蛇床子素和四霉素等7種生物藥劑對(duì)層出鐮刀菌的毒力，其中丁子香酚、蛇床子素、四霉素、申嗪霉素抑制效果較好，其EC50值分別為0.38、4.92、0.32、1.85 μg/mL，與前人研究結(jié)果有一定的差異。如奉代力[22]測(cè)定的丁子香酚對(duì)灰葡萄鐮刀菌的EC50值為1.43 μg/mL，而張潔等[23]測(cè)定申嗪霉素對(duì)假禾谷鐮刀菌的EC50值為0.64 μg/mL，這可能是因?yàn)椴煌魑锷戏蛛x所得的鐮刀菌對(duì)丁子香酚和申嗪霉素的敏感性存在一定差異。

協(xié)同作用結(jié)果表明，不同配比的生物藥劑組合對(duì)層出鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用具有一定差異。其中，丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素、蛇床子素+四霉素分別以有效質(zhì)量比為9∶1、1∶1、9∶1時(shí)，對(duì)鐵皮石斛層出鐮刀菌的增效作用顯著，而且室內(nèi)盆栽試驗(yàn)表明，3 個(gè)組合對(duì)鐵皮石斛軟腐病具有一定的防治效果。其中，預(yù)防作用和治療作用最好的是丁子香酚+蛇床子素（9∶1），其防效分別為77.78%和90.91%。丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素、蛇床子素+四霉素分別以有效質(zhì)量比為9∶1、1∶1、9∶1 時(shí)，田 間 防 效 分 別 為69.46%、67.74%、67.18%，可有效防治田間鐵皮石斛軟腐病的危害。本研究結(jié)果為田間鐵皮石斛軟腐病的防治提供參考的生物藥劑選擇，也為減少或替代化學(xué)農(nóng)藥用量，而提高鐵皮石斛產(chǎn)量和質(zhì)量提供了參考。