有機(jī)廢棄物對(duì)辣椒、番茄幼苗生長及根際微生物群落的影響

王 燦，解志強(qiáng)，孫 媛，趙強(qiáng)彪，朱德顏，毛振坤，彭翠仙*

（1.文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南文山 663000；2.文山州植保植檢站，云南文山 663000）

蔬菜是云南高原特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)。其中辣椒（Capsicum annuumL.）、番茄（Lycopersicon esculentumMill.）已成為云南省主要的外銷亞熱帶果蔬作物之一。隨著產(chǎn)業(yè)化、機(jī)械化、規(guī)模化、自動(dòng)化程度的不斷提高，對(duì)育苗基質(zhì)的需求量也急劇上升［1］。目前市場(chǎng)上普遍使用的育苗基質(zhì)主要成分是草炭，但其資源有限、短期內(nèi)不可再生，大量開發(fā)會(huì)導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化，且國內(nèi)草炭品質(zhì)參差不齊，影響育苗效果。為此，利用一些農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物，通過發(fā)酵腐熟、炭化、添加外源物等方式［2］，開發(fā)價(jià)格低廉的新型有機(jī)復(fù)合育苗基質(zhì)代替草炭已成為當(dāng)務(wù)之急和研發(fā)的熱點(diǎn)，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)意義。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的有機(jī)廢棄物富含有機(jī)質(zhì)、N、P、K 等營養(yǎng)元素［3］，通過堆肥發(fā)酵、炭化處理、添加外源物料等方式制成育苗基質(zhì)，一方面育苗效果顯著，提高了農(nóng)業(yè)廢棄物利用率，另一方面保護(hù)了生態(tài)環(huán)境。Yousry 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，葡萄果實(shí)廢棄物堆肥發(fā)酵后與泥炭或蛭石1∶1 混合作為黃瓜育苗基質(zhì)，可顯著提高種子萌發(fā)、幼苗成活率及質(zhì)量，同時(shí)降低育苗成本，可用于園藝苗圃的商業(yè)化生產(chǎn)。Perez-Murcia 等［5］利用城市污泥替代草炭作為基質(zhì)觀察對(duì)西蘭花生長的影響，結(jié)果表明城市污泥用量為30%時(shí)西蘭花生長最快。

辣椒、番茄主要采用育苗盤方式進(jìn)行育苗，育苗基質(zhì)是影響幼苗質(zhì)量的主要因素，不僅為幼苗生長提供水分與養(yǎng)分，同時(shí)也起到對(duì)外界環(huán)境不利因素刺激的緩沖作用［6］。有研究表明,基質(zhì)的理化性狀會(huì)影響微生物類群、數(shù)量、養(yǎng)分釋放量，進(jìn)而影響植物對(duì)養(yǎng)分的利用情況［7-9］。王闖等［9］研究表明，椰糠+菇渣+珍珠巖制成育苗基質(zhì)明顯促進(jìn)番茄植株生長，其產(chǎn)量、光合特性、根呼吸和微生物含量都顯著高于對(duì)照（草炭）。宋佳澤［10］通過將不同處理的秸稈用于黃瓜種植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各處理均在一定程度上促進(jìn)了根際土壤中酶活性和芽單胞菌科、鞘脂單胞菌科等土壤微生物生長繁殖，進(jìn)而提高土壤養(yǎng)分，促進(jìn)黃瓜生長發(fā)育。張凱歌等［11］發(fā)現(xiàn)，檸條堆肥結(jié)合適度深翻有效促進(jìn)了土壤細(xì)菌群落的多樣性，提高功能基因豐度與6 大碳源利用水平。

大量研究表明，有機(jī)廢棄物基質(zhì)對(duì)植物幼苗生長有顯著促進(jìn)作用，但對(duì)辣椒、番茄幼苗根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響鮮有報(bào)道。因此，本研究采用16S/ITS rDNA 對(duì)成苗期的辣椒、番茄根際微生物進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序，旨在探究有機(jī)廢棄物基質(zhì)對(duì)辣椒、番茄幼苗根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，為利用有機(jī)廢棄物作為育苗基質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

辣椒品種為‘京滇皺皮椒’，購買于云南京滇種業(yè)有限公司。番茄品種為‘305’，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)滇臺(tái)特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化工程研究中心提供。

有機(jī)廢棄物育苗基質(zhì)主要材料包括稻殼生物炭、發(fā)酵茶渣等，為上一階段試驗(yàn)篩選得出的最佳配比［12］。商品育苗基質(zhì)為‘綠成豐’牌，由連云港恒奧達(dá)肥料科技有限公司生產(chǎn)，主要成分為草炭土、蘑菇渣、珍珠巖、礦石、豆粕渣?；|(zhì)理化性狀由試驗(yàn)前期完成測(cè)定（表1、表2）。

表1 基質(zhì)物理性狀

表2 基質(zhì)化學(xué)性狀

1.2 方法

試驗(yàn)于2021 年4 月—2021 年12 月在文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院進(jìn)行，共設(shè)2 個(gè)處理，A 處理為有機(jī)廢棄物育苗基質(zhì)，CK 處理為商品育苗基質(zhì)。

將發(fā)芽整齊一致的辣椒、番茄種子播種于每盤36 孔的育苗盤中，每盤為一次重復(fù)，每個(gè)處理各3 次重復(fù)。苗齡65 d 時(shí)，采用5 點(diǎn)取樣法選取整齊一致的植株整株，拔出并抖落附著的土壤基質(zhì)，用無菌刷刷取粘附在根表面的土壤基質(zhì)混合于50 mL 無菌離心管中，迅速置于干冰中保存運(yùn)輸，后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，同時(shí)收集抖落土壤用于檢測(cè)理化性質(zhì)；將植株保存于4 ℃用于生化檢測(cè)。

植株干重用分析天平測(cè)量，株高和莖粗用刻度尺、游標(biāo)卡尺測(cè)量。葉綠素采用紫外分光光度法測(cè)定［12］，根系活力采用TTC 法測(cè)定［13］，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定［14］，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-520 染色法測(cè)定［15］。

生長函數(shù)（mg/d）=全株干重/苗齡

壯苗指數(shù)=（地下部分干重/地上部分干重＋莖粗/株高）×全株干重

秧苗根際微生物DNA 提取均使用HiPure Soil DNA Kit 核酸提取試劑盒，使用Qubit? dsDNA HS Assay Kit 檢測(cè)DNA 濃度。由GENEWIZ，Inc（South Plainfield, NJ）公司完成二代測(cè)序文庫構(gòu)建和測(cè)序。16S rDNA 上V3 及V4 區(qū) 引物 系列 如下：F：5’-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3’；R：5’-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3’。ITS rDNA 上的ITS2 可變區(qū) 引物如下：F：5’-GTGAATCATCGARTC-3’；R：5’- TCCTCCGCTTATTGAT-3’。通過Illumina MiSeq 進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

數(shù)據(jù)差異顯著性分析使用DPS 7.05（Duncan新復(fù)極差法，P＜0.05）。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)化使用Cutadapt 1.9.1、Vsearch 1.9.6、Qiime 1.9.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)幼苗生長代謝的影響

不同處理下辣椒、番茄的株高、莖粗無顯著差異（表3），在干重、生長函數(shù)、壯苗指數(shù)方面，A 處理顯著高于CK。在生化指標(biāo)上（表4），辣椒中A處理葉綠素含量、根系活力顯著高于CK，可溶性蛋白和可溶性糖含量則無顯著差異；番茄中A 處理葉綠素、可溶性蛋白、可溶性糖含量、根系活力均顯著高于CK。

表3 不同處理對(duì)幼苗生長的影響

表4 不同處理對(duì)幼苗生化指標(biāo)的影響

2.2 根際微生物群落組成

試驗(yàn)共收集4 個(gè)樣本，質(zhì)控后依據(jù)97 %相似性聚類獲得269 個(gè)細(xì)菌OTUs、142 個(gè)真菌OTUs（不同樣本取并集所得）。A 處理下辣椒、番茄根際土壤 細(xì) 菌OTU 個(gè) 數(shù) 分 別 為186、219，CK 則 分 別 為247、227（圖1a）。A 處理辣椒、番茄根際土壤真菌OTU 個(gè)數(shù)分別為71、77，CK 則分別為97、126（圖1b）。A 處理作物根際土壤細(xì)菌和真菌OTU 數(shù)均低于CK。

圖1 根際微生物OTU花瓣圖

土壤細(xì)菌門水平組成如圖2a 所示，4 個(gè)土壤樣本共得到9 個(gè)類群，相對(duì)豐度從大到小依次為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、Patescibacteria、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）。A 處理辣椒和番茄根際土壤中酸桿菌門占比分別是5.97%和8.27%，低于CK（10.48%、21.92%），芽單胞菌門、綠彎菌門、Patescibacteria、藍(lán)細(xì)菌門占比也均低于CK。但A 處理下辣椒、番茄根際土壤中厚壁菌門分 別 為 2.21% 和 3.93% ，高 于 CK（1.24% 和0.59%）。土壤細(xì)菌屬水平下（Top15），黃桿菌屬（Flavobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Devosia為主要細(xì)菌屬，且A 處理以上細(xì)菌屬相對(duì)豐度均高于CK（圖2b）。真菌門水平下，除A 處理辣椒樣本外，其余樣本物種數(shù)目均為4，主要菌群為子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。A 處理辣椒、番茄根際土壤中擔(dān)子菌門相對(duì)豐度分別為26.43%和20.52%，高于CK（1.67%和1.61%，圖2c）。屬 水 平 下（Top15），毛 孢 子 菌（Trichosporon）、Aspergillus、Graphium為主要菌屬，且A 處理以上真菌屬相對(duì)豐度均高于CK（圖2d）。

圖2 根際土壤細(xì)菌、真菌門水平與屬水平群落組成

2.3 根際微生物群落多樣性分析

根據(jù)表5 可知，辣椒A 處理根際土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)Ace 和Chaol（200.66 和197.04）顯著低于CK（254.26 和253.38），多 樣 性 指 數(shù)Shannon 和Simpson（5.03 和0.98）同 樣 顯 著 低 于CK（6.83 和1.10）；真菌情況與細(xì)菌相似，A 處理根際土壤真菌豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均顯著低于CK 處理。A 處理番茄根際土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均低于CK，但兩者間無顯著差異；真菌豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)則顯著低于CK。表明A處理顯著降低了辣椒根際土壤細(xì)菌、真菌群落的豐富度和多樣性，對(duì)番茄根際細(xì)菌群落多樣性無顯著影響，但顯著影響真菌群落多樣性。

主坐標(biāo)分析中，樣本點(diǎn)距離的遠(yuǎn)近代表了樣本中微生物群落的相似性，距離越近，相似度越高；聚集在一起的樣本由相似的微生物群落構(gòu)成。如圖3a，在細(xì)菌中第一主坐標(biāo)揭示了樣本間72.26%的差異并將A 處理和CK 處理區(qū)分開，第二主坐標(biāo)揭示了樣本18.12 %的差異。真菌中（圖3b）第一主坐標(biāo)揭示了樣本間61.5%的差異并將A處理和CK 處理區(qū)分開，第二主坐標(biāo)揭示了樣本35.33%的差異。

圖3 根際微生物PCoA分析

2.4 微生物群落與基質(zhì)性狀相關(guān)性分析

冗余分析中選擇基質(zhì)土壤相關(guān)理化性狀與屬水平下豐度前10 的微生物進(jìn)行分析。根據(jù)圖4a，持水孔隙度、通氣孔隙度、速效P、速效K、pH 及腐殖質(zhì)均對(duì)A 處理辣椒、番茄的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，是導(dǎo)致細(xì)菌群落組成改變的影響因子。而速效P、速效K、pH 及有機(jī)質(zhì)對(duì)A 處理真菌群落結(jié)構(gòu)組成有顯著影響（圖4b）。

圖4 細(xì)菌（a）、真菌（b）與土壤理化性質(zhì)的冗余分析

土壤細(xì)菌群落與理化性質(zhì)的Spearman 分析中（圖5a），A 處理優(yōu)勢(shì)菌厚壁菌門相對(duì)豐度與pH值、有機(jī)質(zhì)、速效K 含量顯著正相關(guān)，與速效N 含量顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。而CK 處理中的優(yōu)勢(shì)菌酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門則正好相反。酸桿菌門相對(duì)豐度與pH 值、有機(jī)質(zhì)、速效K 含量顯著負(fù)相關(guān)；芽單胞菌門相對(duì)豐度與pH 值、有機(jī)質(zhì)、通氣孔隙度顯著負(fù)相關(guān)，與速效N 含量顯著正相關(guān)；綠彎菌門豐度與pH 值、有機(jī)質(zhì)顯著負(fù)相關(guān)，與EC 值、速效N 顯著正相關(guān)（P＜0.05）。在土壤真菌與理化性質(zhì)的相關(guān)性分析中（圖5b），A 處理的優(yōu)勢(shì)菌擔(dān)子菌門相對(duì)豐度與pH 值、通氣孔隙度、有機(jī)質(zhì)、速效K 含量顯著正相關(guān)，與EC 值、速效N 含量顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

圖5 細(xì)菌（a）、真菌（b）與土壤理化性質(zhì)的Spearman分析

3 討論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的商業(yè)育苗基質(zhì)相比，有機(jī)廢棄物基質(zhì)處理并未降低辣椒和番茄的生長質(zhì)量，反而提高了葉綠素含量、根系活力等指標(biāo)。表明有機(jī)廢棄物基質(zhì)具有與商品基質(zhì)同樣育苗效果的潛力，這與前人研究結(jié)果一致［16］。通過16S/ITS rDNA 擴(kuò)增子測(cè)序進(jìn)一步對(duì)兩者間根際微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)A 處理辣椒、番茄根際土壤細(xì)菌和真菌的OTU 數(shù)均低于CK，表明A 處理降低了根際微生物的OTU 個(gè)數(shù)。在A 處理下辣椒和番茄根際土壤中酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、Patescibacteria 和藍(lán)細(xì)菌門的相對(duì)豐度均低于CK，但厚壁菌門的相對(duì)豐度則高于CK。真菌中主要菌群為子囊菌門和擔(dān)子菌門，且A 處理辣椒、番茄根際土壤中擔(dān)子菌門相對(duì)豐度顯著高于CK。表明有機(jī)廢棄物基質(zhì)處理改變了根際微生物群落結(jié)構(gòu)，使辣椒和番茄根際中厚壁菌門、黃桿菌屬、假單胞菌屬和Devosia、毛孢子菌、Aspergillus、Graphium等顯著富集。這可能是廢棄物基質(zhì)中添加有生物炭，而研究表明生物炭可直接（提供易分解的有機(jī)碳和營養(yǎng)元素）或間接（改變土壤基質(zhì)物理性質(zhì)增加孔隙度等）影響微生物群落［17-18］，同時(shí)基質(zhì)中的茶渣含有豐富的有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)，也為微生物的繁殖提供了營養(yǎng)物質(zhì)。厚壁菌門中的許多成員都是植物益生菌，具有固氮和纖維素降解作用，能夠分解相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)供作物生長利用，從而促進(jìn)作物生長［20］。

α 多樣性指數(shù)中，Ace 和Chao1 反映菌群豐富度，數(shù)值越小表明豐富度越低，Shannon、Simpson反映菌群多樣性，其數(shù)值越小表明群落多樣性越低。A 處理顯著降低了辣椒根際細(xì)菌、真菌多樣性與豐富度，顯著降低番茄根際真菌群落多樣性，對(duì)番茄根際細(xì)菌豐富度無顯著影響。廢棄物基質(zhì)中添加了適量殼聚糖，研究表明殼聚糖可顯著降低環(huán)境中微生物群落豐富度及多樣性［19］。董春娟等［19］分析認(rèn)為，殼聚糖可促進(jìn)某些可分解利用殼聚糖的微生物繁衍，抑制其它微生物生長，導(dǎo)致相關(guān)微生物富集。主坐標(biāo)分析表明，不同處理下的辣椒、番茄根際微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，A 處理下辣椒和番茄幼苗間根際細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)差異較小，CK 處理下辣椒、番茄細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)差異均較大。表明農(nóng)業(yè)廢棄物基質(zhì)定向改變了辣椒、番茄根際土壤細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)。

冗余分析和Spearman 分析表明有機(jī)質(zhì)含量、孔隙度等是改變微生物群落豐度的主要因素。土壤基質(zhì)不僅為幼苗生長提供水分與養(yǎng)分，同時(shí)也為微生物生長與繁殖提供適宜的環(huán)境，其物理化學(xué)性質(zhì)影響了基質(zhì)中微生物群落組成［21］。進(jìn)一步說明了農(nóng)業(yè)廢棄物有機(jī)質(zhì)含量、孔隙度等對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)有一定影響。向羽等［22］研究表明，向種植土壤中添加腐熟菜籽餅肥可顯著促進(jìn)煙株生長，提高烤煙根際土壤微生物對(duì)氨基酸、聚類化合物碳源的利用能力，其根際微生物代謝功能及多樣性指數(shù)顯著高于對(duì)照。農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如有機(jī)酸，氨基酸、糖類等其它的大分子有機(jī)化合物，對(duì)土壤微生物群落組成、功能和碳源利用效率均有顯著影響［23-25］，同時(shí)有機(jī)廢棄物增加了土壤孔隙度，為好氧微生物提高了良好生存環(huán)境。Dombrowski等［26］研究多年生黃花亭薺在自然和控制條件下根際細(xì)菌群落組成，發(fā)現(xiàn)土壤性質(zhì)能夠解釋根內(nèi)細(xì)菌15%的群落變異性，而環(huán)境條件和植物基因型最多解釋了11%的群落變異性，且土壤類型對(duì)根內(nèi)細(xì)菌門分類水平上的影響更加顯著。因此，可以通過調(diào)控作物根際生長環(huán)境，定向改變其根際微生物群落，抑制某些有害微生物，讓相關(guān)有益微生物富集，從而促進(jìn)作物生長。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在相同基質(zhì)土壤環(huán)境中，同科不同屬（辣椒屬、番茄屬）的作物幼苗根際微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定差異，但有機(jī)廢棄物基質(zhì)可通過改變環(huán)境因子如增加適量有機(jī)質(zhì)含量和孔隙度等來調(diào)控它們之間的差異，達(dá)到定向改變微生物群落，促進(jìn)有益微生物富集，進(jìn)而協(xié)助作物生長或抑制相關(guān)病原微生物。這為有機(jī)廢棄物作為育苗基質(zhì)的應(yīng)用提供了新的見解。