紅景天苷輔助治療中重癥急性胰腺炎的機(jī)制研究

王小紅，錢晶，王加偉，祁小鳴，孟蕓，王萍，程睿智，周國(guó)雄

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是由多種病因引起的胰腺內(nèi)胰酶激活，伴或不伴有其他器官功能改變的疾病，臨床上輕癥AP（mild acute pancreatitis，MAP）多見，病程具有自限性。近年來，AP 發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)，全球發(fā)病率約為34/10萬，其中約20%的患者會(huì)發(fā)展成重癥AP（severe acute pancreatitis，SAP）。SAP具有發(fā)病急、進(jìn)展快等特征，病死率高達(dá)30%，甚至可出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammation response syndrome，SIRS），影響預(yù)后并可并發(fā)多器官功能不全綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）［1-3］。因此，探索AP 的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療藥物具有重要意義。目前，細(xì)胞焦亡在AP發(fā)生機(jī)制中的作用受到廣泛關(guān)注［4］。研究表明，黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）炎性小體參與了SAP 并發(fā)MODS的發(fā)生、發(fā)展［5］。本課題組前期體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅景天苷對(duì)SAP 有確切的治療作用［6-8］。本研究進(jìn)一步觀察紅景天苷對(duì)中重癥急性胰腺炎（moderately severe acute pancreatitis，MSAP）患者的輔助治療作用，并探索其可能的作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

前瞻性招募2019 年1 月—2022 年8 月于南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院消化內(nèi)科及普通外科診治的MSAP患者60例，男33例，女27例，年齡20～74歲，平均年齡（50.42±14.51）歲，診斷均符合《急性胰腺炎診治指南（2014 版）》的標(biāo)準(zhǔn)［9］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）胰腺腫瘤、慢性胰腺炎、自身免疫性胰腺炎、膽石癥、消化性潰瘍、心肌梗死、腸梗阻等患者；（2）妊娠期；（3）對(duì)本研究用藥過敏者；（4）正在進(jìn)行有可能干擾本研究的其他治療者；（5）臨床研究期間死亡和自動(dòng)出院者，或因各種原因中途退出者。采用隨機(jī)數(shù)字表法將MSAP患者分為2組。常規(guī)組30 例，男16 例，女14 例，平均年齡（50.53±15.14）歲；試驗(yàn)組30例，男17例，女13例，平均年齡（50.30±14.11）歲；2組年齡（t=0.060）、性別構(gòu)成（χ2=0.067）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)2020-03-16），患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 治療方法

常規(guī)組患者住院后即采取禁食、禁水、胃腸減壓措施，給予醋酸奧曲肽注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字H20150364，1 mL：0.1 mg，瑞典阿斯利康制藥有限公司）抑制胰液分泌，注射用甲磺酸加貝酯（國(guó)藥準(zhǔn)字H20059767，100 mg/支，常州四藥制藥有限公司）抑制胰酶，注射用埃索美拉唑鈉（國(guó)藥準(zhǔn)字H20093314，40 mg/支，瑞典阿斯利康制藥有限公司）抑制胃酸、導(dǎo)瀉、止痛、抗感染及營(yíng)養(yǎng)支持等常規(guī)治療措施。試驗(yàn)組患者在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上給予注射用紅景天苷（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20060361，10 mL/支，紅景天苷含量3.5 g/L，通化玉圣藥業(yè)股份有限公司），一次10 mL，加入250 mL的5%葡萄糖注射液靜脈滴注，每日1次，連用5 d，糖尿病患者在葡萄糖注射液中加入4 U胰島素。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）細(xì)胞焦亡及AIM2 炎性小體信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)。治療前及治療后7 d抽取空腹外周靜脈血15 mL，常溫下靜置2 h后，4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，取上清液于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清胱天蛋白酶（cysteinecontaining aspartate-specific proteases，Caspase）-1、Gasdermin蛋白D（gasdermin D，GSDMD）、AIM2、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β 及IL-18 水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。其中Caspase-1 試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，GSDMD 試劑盒購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司，AIM2 試劑盒購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司，IL-1β 及IL-18 試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。（2）應(yīng)用急性生理與慢性健康評(píng)分（acute physiology and chronic health evaluation，APACHE）Ⅱ［10］評(píng)估AP 病情變化及預(yù)后，胰腺改良CT 嚴(yán)重指數(shù)（modified CT severity index，MCTSI）評(píng)分［11］評(píng)估MSAP炎癥反應(yīng)及胰腺壞死程度。（3）記錄2組腹痛緩解時(shí)間及住院時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 9.1軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2 組間均數(shù)比較用2 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組血清Caspase-1、GSDMD水平比較

治療后7 d，2 組患者Caspase-1 和GSDMD 均較治療前下降，試驗(yàn)組較常規(guī)組均下降（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of serum levels of Caspase-1 and GSDMD between two groups表1 2組患者血清Caspase-1、GSDMD水平比較（n=30，μg/L，±s）

Tab.1 Comparison of serum levels of Caspase-1 and GSDMD between two groups表1 2組患者血清Caspase-1、GSDMD水平比較（n=30，μg/L，±s）

＊＊P＜0.01；表2—4同。

組別常規(guī)組試驗(yàn)組t Caspase-1治療前85.43±12.32 86.71±12.59 0.790治療后7 d 70.65±8.15 58.37±9.57 4.430＊＊t 13.190＊＊28.490＊＊GSDMD治療前94.53±12.64 95.39±12.87 0.490治療后7 d 79.94±8.79 67.73±10.53 4.610＊＊t 12.460＊＊12.510＊＊

2.2 2組血清AIM2、IL-1β、IL-18水平比較

治療后7 d，2組AIM2、IL-1β、IL-18均較治療前下降，試驗(yàn)組較常規(guī)組均下降（P＜0.01），見表2。

Tab.2 Comparison of serum levels of AIM2,IL-1β and IL-18 between two groups of patients表2 2組患者血清AIM2、IL-1β、IL-18水平比較（n=30，±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of AIM2,IL-1β and IL-18 between two groups of patients表2 2組患者血清AIM2、IL-1β、IL-18水平比較（n=30，±s）

組別常規(guī)組試驗(yàn)組t AIM2/（μg/L）治療前2.53±0.30 2.41±0.29 1.890治療后7 d 1.44±0.16 0.92±0.12 12.260＊＊t 19.340＊＊27.410＊＊IL-1β/（ng/L）治療前110.80±14.11 112.42±14.57 0.610治療后7 d 86.60±7.18 70.17±5.88 8.410＊＊t 11.710＊＊14.710＊＊IL-18/（ng/L）治療前277.19±37.74 278.84±41.06 0.510治療后7 d 212.21±32.40 178.23±20.20 4.420＊＊t 16.120＊＊18.840＊＊

2.3 2組APACHE Ⅱ及胰腺M(fèi)CTSI評(píng)分比較

治療后7 d，2組患者2評(píng)分均較治療前下降，試驗(yàn)組較常規(guī)組均下降（P＜0.01），見表3。

Tab.3 Comparison of APACHE Ⅱand pancreas-MCTSI scores between two groups of patients表3 2組患者APACHE Ⅱ及胰腺M(fèi)CTSI評(píng)分比較（n=30，分，±s）

Tab.3 Comparison of APACHE Ⅱand pancreas-MCTSI scores between two groups of patients表3 2組患者APACHE Ⅱ及胰腺M(fèi)CTSI評(píng)分比較（n=30，分，±s）

組別常規(guī)組試驗(yàn)組t APACHEⅡ治療前10.63±1.52 10.77±1.31 0.320治療后7 d 9.40±1.35 7.07±0.94 7.620＊＊t 10.790＊＊16.400＊＊組別常規(guī)組試驗(yàn)組t胰腺M(fèi)CTSI評(píng)分治療前5.33±0.61 5.10±0.85 0.460治療后7 d 4.40±0.50 3.30±0.54 7.040＊＊t 14.000＊＊13.800＊＊

2.4 2組患者腹痛緩解時(shí)間、住院時(shí)間比較

與常規(guī)組比較，試驗(yàn)組腹痛緩解時(shí)間和住院時(shí)間均縮短（P＜0.01），見表4。

Tab.4 Comparison of the time of abdominal painrelieving and hospital stay between two groups of patients表4 2組患者腹痛緩解時(shí)間、住院時(shí)間比較（n=30，d，±s）

Tab.4 Comparison of the time of abdominal painrelieving and hospital stay between two groups of patients表4 2組患者腹痛緩解時(shí)間、住院時(shí)間比較（n=30，d，±s）

組別常規(guī)組試驗(yàn)組t腹痛緩解時(shí)間6.37±1.10 3.47±0.63 12.550＊＊住院時(shí)間13.70±1.60 9.47±0.63 13.480＊＊

3 討論

目前，盡管AP 的風(fēng)險(xiǎn)及嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)、治療和預(yù)后評(píng)估已獲得較大進(jìn)展，但由于該病病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制仍未闡明，尚無有效治療方法［12］。因此，探索AP 的發(fā)病機(jī)制，尋找其有效治療藥物至關(guān)重要。目前，中醫(yī)藥治療AP 是研究熱點(diǎn)。研究表明，臨床運(yùn)用中西醫(yī)結(jié)合療法治療AP 比單純采用西醫(yī)療法療效更佳［13］。紅景天為景天科景天屬多年生草本植物，是生長(zhǎng)于海拔1 800～2 500 m 的珍稀野生植物，屬于我國(guó)傳統(tǒng)藏藥［14］。紅景天苷是紅景天提取物中最重要的活性成分之一，化學(xué)名稱為2-（4-羥基苯基）乙基-β-D-葡萄糖苷，化學(xué)分子式C14H20O7，相對(duì)分子質(zhì)量為300.3，為類白色或淺黃色針狀結(jié)晶，是一種苯乙醇類化合物［15］?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明，紅景天苷具有中樞興奮、抗疲勞、強(qiáng)心、抗炎、抗過氧化、抗微波輻射、降血糖等功效［16］。紅景天苷具有藥理作用強(qiáng)、半衰期長(zhǎng)、使用方便、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)［17］。本課題組前期研究結(jié)果表明，紅景天苷可減輕由?；鞘懰?-硫酸鹽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞損傷；還可減輕SAP模型大鼠的組織病理學(xué)損傷并減少炎性因子釋放，對(duì)SAP大鼠具有治療作用［6-8］。本研究結(jié)果表明，治療后7 d 2 組患者APACHE Ⅱ及胰腺M(fèi)CTSI 評(píng)分均較治療前下降，試驗(yàn)組較常規(guī)組均下降，試驗(yàn)組腹痛緩解時(shí)間、住院時(shí)間均短于常規(guī)組，提示紅景天苷對(duì)MSAP具有輔助治療作用。

細(xì)胞焦亡是由Gasdermin 介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死，依賴于Caspase-1，并伴有大量促炎因子的釋放。研究表明，細(xì)胞焦亡參與了AP 的發(fā)生、發(fā)展［18］。Caspase-1、GSDMD 是細(xì)胞焦亡的標(biāo)志分子。本研究結(jié)果顯示，治療后7 d，2 組患者血清Caspase-1、GSDMD水平均較治療前下降，試驗(yàn)組較常規(guī)組均下降，證實(shí)了在MSAP 中紅景天苷對(duì)細(xì)胞焦亡具有抑制作用。AIM2 在AP 中具有重要的作用。研究顯示，在體外AP 細(xì)胞中AIM2 表達(dá)水平升高，而降低AIM2 表達(dá)水平可減輕因AP 細(xì)胞導(dǎo)致的炎癥［19］。SAP患者的全身炎癥狀態(tài)與外周血單核細(xì)胞介導(dǎo)的AIM2表達(dá)水平及IL-1β水平存在相關(guān)性［5］。在SAP早期，AIM2 炎性小體激活，表達(dá)水平增加，表明AIM2的激活不僅可以促進(jìn)局部胰腺炎癥，也可以促進(jìn)SAP中SIRS和MODS的發(fā)生［20］。然而，有關(guān)AIM2炎性小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡與AP 的關(guān)系研究鮮見。本研究結(jié)果顯示，治療后7 d，2 組患者血清AIM2、IL-1β、IL-18 水平均較治療前下降，試驗(yàn)組各指標(biāo)較常規(guī)組均下降，而AIM2、IL-1β、IL-18 是AIM2 炎性小體信號(hào)通路的標(biāo)志分子，提示紅景天苷對(duì)AIM2炎性小體信號(hào)通路具有抑制作用。

AIM2炎性小體與細(xì)胞焦亡關(guān)系密切。AIM2的C 端HIN200 結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別病毒DNA 和細(xì)菌雙鏈DNA，與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck like protein containing a CARD，ASC）結(jié)合，從而形成AIM2/ASC/pro-Caspase-1 復(fù)合體即AIM2 炎性小體［21］。AIM2 炎性小體組裝和活化后會(huì)促使無活性的pro-Caspase-1 裂解為有活性的Caspase-1?；罨腃aspase-1有兩方面作用，其一是將IL-1β前體（pro-IL-1β）、IL-18 前體（pro-IL-18）等促炎細(xì)胞因子裂解為IL-1β和IL-18的成熟形式，并誘導(dǎo)它們釋放出來，進(jìn)一步招募其他炎性細(xì)胞，放大炎癥反應(yīng)；其二是Caspase-1 剪切Caspases 的共有底物GSDMD，使之釋放出活性N 端，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生［22］。通常情況下，AIM2炎性小體的組裝和活化可釋放大量的促炎細(xì)胞因子并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生，可使損傷的細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的死亡。研究顯示，通過調(diào)節(jié)AIM2炎性小體的激活可調(diào)控炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡［23］。因此，AIM2、IL-1β、IL-18可能是細(xì)胞焦亡發(fā)生的關(guān)鍵因子。本研究結(jié)果證實(shí)，在MSAP 中，紅景天苷對(duì)AIM2炎性小體信號(hào)通路及細(xì)胞焦亡均具有抑制作用。

綜上所述，紅景天苷可通過抑制AIM2炎性小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，從而對(duì)MSAP 患者發(fā)揮輔助治療作用。然而，本研究?jī)H觀察了部分血液標(biāo)本指標(biāo)，未能觀察胰液及胰腺組織相關(guān)指標(biāo)，僅揭示了紅景天苷對(duì)MSAP 作用的部分潛在機(jī)制，相關(guān)作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。