基于PI3K/Akt/NF-κB信號通路探討升陽益胃湯對肺癌大鼠免疫力的影響

王宏君，孫星星，張潤蓮

肺癌是一種異質(zhì)性惡性疾病，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一?；熓欠伟┏Ｓ玫闹委煼椒?，但化療藥物在有效殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也會造成免疫系統(tǒng)功能損傷［1］；肺癌免疫微環(huán)境中的免疫細(xì)胞對肺癌的發(fā)生、發(fā)展有很大影響［2］。因此，提高肺癌患者免疫力具有重要意義。磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/核因子-κB（NF-κB）信號通路在腫瘤細(xì)胞凋亡和肺癌靶向藥物的發(fā)現(xiàn)中起著至關(guān)重要的作用［3-4］。腫瘤細(xì)胞中PI3K/Akt/NF-κB通路的激活與腫瘤免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)，可增加腫瘤細(xì)胞增殖水平［5-6］；PI3K/Akt/NF-κB信號通路的抑制可抑制腫瘤生長和腫瘤免疫逃逸［7］。因此，PI3K/Akt/NF-κB 信號通路可能是腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)。

升陽益胃湯源于李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》，有健脾祛濕、升陽益胃的功效。研究顯示，升陽益胃湯具有抗炎、抗氧化和增強(qiáng)免疫的作用，在肺系統(tǒng)疾病和癌癥中具有較高應(yīng)用價值［8］。如在脾虛型胃癌患者中，升陽益胃湯聯(lián)合奧沙利鉑可以提高患者自身免疫力，有利于其后期康復(fù)且無明顯不良反應(yīng)［9］；在慢性支氣管炎患者中，升陽益胃湯可顯著抑制炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體免疫力，改善患者肺功能［10］；升陽益胃湯對治療肺癌發(fā)熱也十分有效［11］。然而，升陽益胃湯對肺癌患者免疫力的影響及具體藥理作用機(jī)制尚不清楚。有研究認(rèn)為，升陽益胃湯主要通過PI3K/Akt 信號通路參與抗炎、抗纖維化和免疫調(diào)節(jié)［12］。本研究旨在通過動物實(shí)驗探討升陽益胃湯對肺癌大鼠免疫力的影響及潛在機(jī)制，以期為肺癌治療提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

SPF 級Wistar 大鼠72 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，購自中國科學(xué)院上海藥物研究所，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2020-0005，飼養(yǎng)在溫度（24±2）℃、濕度50%～60%、12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中，自由食水。

1.2 主要試劑與儀器

升陽益胃湯（黃芪30 g、人參15 g、半夏10 g、甘草5 g、防風(fēng)10 g、白芍10 g、羌活10 g、獨(dú)活10 g、陳皮10 g、茯苓10 g、澤瀉10 g、柴胡10 g、白術(shù)10 g、黃連10 g）由河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院制劑室提供，加10 倍量蒸餾水浸泡30 min，按常規(guī)煎藥法煎煮2次，每次30 min，過濾藥液并濃縮至每毫升含原藥材2 g，高壓滅菌冷卻，保存于4 ℃冰箱中備用，使用時稀釋至所需濃度。3-甲基膽蒽（3-Methylcholanthrene，MCA；純度98%）、二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN；純度≥99.0%）和CelLytic ?NuCLEAR ?提取試劑盒均購自美國Sigma-Aldrich 公司。碘化油注射液購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；740 Y-P（PI3K 激活劑，純度99.03%）購自美國MedChemExpress 公司。白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和免疫球蛋白（Ig）G、IgA、IgM 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。兔源PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）一抗購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；兔源Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、NF-κB p65、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、核纖層蛋白B1（Lamin B1）一抗和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Cell Signaling Technology 公司。高分辨小動物數(shù)字X線機(jī)（美國KUBTEC公司）；Synergy LX多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；Mx3005P 實(shí)時熒光定量PCR 儀（美國Stratagene 公司）；BX53光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 模型制備

100 g/L MCA、0.1 g/L DEN 分別溶解在碘化油中。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將動物按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組12只和造模組60只。造模組參考文獻(xiàn)［13］方法，采用氣管內(nèi)灌注致癌碘化油溶液法建立肺癌模型：大鼠麻醉后，將其以仰臥位固定在傾斜的手術(shù)板上，用固定線掛住大鼠上頜門齒；呼氣結(jié)束時，在額鏡直視下將0.1 mL 含致癌物質(zhì)（100 g/L MCA、0.1 g/L DEN）的碘化油通過鈍的ZY 型12 號針頭經(jīng)左肺支氣管緩緩注入到大鼠的左肺，肺內(nèi)出現(xiàn)碘化油時為灌注成功，3周后用高分辨小動物數(shù)字X線機(jī)進(jìn)行胸部影像學(xué)檢查，當(dāng)觀察到肺部有重物形成時，則表示模型制備成功，所有大鼠均造模成功。對照組同法將0.1 mL 不含任何致癌物質(zhì)的碘化油注入左肺。肺內(nèi)若可見碘化油即為灌注成功。

1.3.2 分組與給藥

造模1 周后將建模成功的60 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、順鉑組（5 mg/kg）、升陽益胃湯組（14 g/kg）、740 YP 組（10 mg/kg）［14］、升陽益胃湯+740 Y-P 組，每組12 只。順鉑和740 Y-P 采取腹腔注射給藥，升陽益胃湯采取灌胃給藥，均1次/d，連續(xù)28 d。灌胃升陽益胃湯的大鼠每日給藥劑量為14 g/kg 體質(zhì)量（根據(jù)人與大鼠的體表面積換算法計算得出）。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群

末次干預(yù)后24 h，麻醉各組大鼠，從其眼眶取外周血2 mL，置于15 mL 離心管（含1 mL 抗凝劑）中，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）稀釋，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，PBS洗滌并重懸后，加入含10μL T細(xì)胞表面標(biāo)志物異硫氰酸熒光素（FITC）-CD3、藻紅蛋白（PE）-CD4、別藻藍(lán)蛋白（APC）-CD8 單抗的離心管中，4 ℃下避光孵育10 min，利用流式細(xì)胞儀分析T 淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比，并計算CD4+/CD8+比值。

1.3.4 ELISA檢測血清炎性因子和免疫球蛋白水平

腹主動脈采血2 mL，室溫靜置30 min，3 000×g離心10 min，分離血清，按照ELISA試劑盒檢測說明書，經(jīng)溫育、加酶、顯色、終止后，于450 nm 波長處測定吸光度（A）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清IL-6、TNF-α和IgG、IgA、IgM水平。

1.3.5 肺、脾和胸腺指數(shù)檢測

腹主動脈采血完成后，處死大鼠，取肺、脾和胸腺并稱質(zhì)量，計算肺、脾、胸腺指數(shù)。肺、脾、胸腺指數(shù)=［肺、脾、胸腺質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）］。

1.3.6 HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化

取大鼠左側(cè)肺組織并分為兩部分，一部分于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，另一部分?0%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切5μm 厚切片行常規(guī)HE 染色。封片后，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.3.7 實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表達(dá)

使用Trizol試劑從凍保存的肺組織中分離總RNA。RNA濃度使用分光光度計測定。隨后使用PrimeScript RT Master Mix生成mRNA的互補(bǔ)DNA（cDNA）。qPCR反應(yīng)體系（25μL）：SYBR Green qPCR Master Mix 12.5μL、正向引物和反向引物各0.5μL、cDNA 模板2.0μL、ddH2O 9.5μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，循環(huán)40次；72 ℃延伸60 s。MMP-9引物：上游5'-CATTCGCGTGGATAAGGA GT-3'，下游5'-CACTGCAGGAGGGTCGTAGG-3'；ICAM-1引物：上游5'-CGCAAGTCCAATTCACACTGA-3'，下游5'-CCAGAGCGGCAGAGCAA-3'；GAPDH引物：上游5'-GGTTG AGCAGGTACTTT-3'，下游5'-AGCAAGAGCACAAGAGGAA G-3'。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法定量分析ICAM-1、MMP-9的mRNA相對表達(dá)水平。

1.3.8 Western blot 法檢測肺組織PI3K/Akt/NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)

使用RIPA裂解液（含有1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取肺組織中的蛋白質(zhì)，并采用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白（用于檢測NF-κB p65水平）。測定蛋白濃度后，將等量蛋白質(zhì)（50μg）上樣到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上并進(jìn)行電泳以分離目標(biāo)蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上后，使用5%脫脂奶粉在室溫下封閉蛋白質(zhì)2 h。將膜與一抗PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶500）、Lamin B1（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）在4 ℃下孵育過夜。然后，將膜洗滌后與HRP 偶聯(lián)的山羊抗兔IgG 二抗（1∶4 000）在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）檢測試劑顯色，并進(jìn)行半定量分析，用GAPDH條帶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺癌大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較

與對照組比較，模型組CD3+、CD4+占比和CD4+/CD8+均降低，CD8+占比升高（P＜0.05）；與模型組比較，順鉑組和740 Y-P 組CD3+、CD4+占比及CD4+/CD8+比值降低，CD8+占比升高（P＜0.05），而升陽益胃湯組CD3+、CD4+占比和CD4+/CD8+比值升高，CD8+占比降低（P＜0.05），其中升陽益胃湯組CD3+、CD4+占比和CD4+/CD8+比值較順鉑組升高（P＜0.05）；與740 Y-P 組比較，升陽益胃湯+740 Y-P 組CD3+、CD4+占比和CD4+/CD8+比值升高，CD8+占比降低（P＜0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of the proportion of CD3+,CD4+,CD8+and CD4+/CD8+proportion of T lymphocyte subsets in peripheral blood of rats between the six groups表1 各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比與CD4+/CD8+比值比較 （n=12，±s）

Tab.1 Comparison of the proportion of CD3+,CD4+,CD8+and CD4+/CD8+proportion of T lymphocyte subsets in peripheral blood of rats between the six groups表1 各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比與CD4+/CD8+比值比較 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與順鉑組比較，d與740 Y-P組比較，均P＜0.05。

組別對照組模型組順鉑組升陽益胃湯組740 Y-P組升陽益胃湯+740 Y-P組F CD3+/%72.64±7.31 48.19±5.24a 36.30±4.07b 59.57±7.16bc 32.24±4.35b 45.61±5.29d 82.799＊＊CD4+/%65.23±7.12 42.18±6.49a 30.43±4.80b 54.90±6.32bc 27.60±4.28b 39.08±3.56d 80.689＊＊組別對照組模型組順鉑組升陽益胃湯組740 Y-P組升陽益胃湯+740 Y-P組F CD8+/%27.34±3.25 38.11±5.16a 46.56±5.2b 32.31±6.85bc 49.24±5.40b 40.83±3.62d 41.064＊＊CD4+/CD8+2.38±0.17 1.10±0.13a 0.65±0.10b 1.68±0.15bc 0.55±0.09b 0.96±0.12d 344.714＊＊

2.2 各組肺癌大鼠肺、脾和胸腺指數(shù)比較

與對照組比較，模型組脾和胸腺指數(shù)均降低，肺指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，順鉑組肺、脾和胸腺指數(shù)均降低（P＜0.05），而740 Y-P 組脾和胸腺指數(shù)降低，肺指數(shù)升高（P＜0.05），升陽益胃湯組脾和胸腺指數(shù)升高，肺指數(shù)降低（P＜0.05），其中升陽益胃湯組脾和胸腺指數(shù)較順鉑組升高（P＜0.05）；與740 Y-P 組比較，升陽益胃湯+740 Y-P 組脾和胸腺指數(shù)升高，肺指數(shù)降低（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Comparison of lung index,spleen index and thymus index of rats between the six groups表2 各組大鼠肺指數(shù)、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)比較（n=12，mg/g，±s）

Tab.2 Comparison of lung index,spleen index and thymus index of rats between the six groups表2 各組大鼠肺指數(shù)、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)比較（n=12，mg/g，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與順鉑組比較，d與740 Y-P組比較，均P＜0.05。

組別對照組模型組順鉑組升陽益胃湯組740 Y-P組升陽益胃湯+740 Y-P組F肺指數(shù)2.75±0.34 4.83±0.56a 3.50±0.41b 3.62±0.49b 5.87±0.62b 4.90±0.53d 62.721＊＊脾指數(shù)4.91±0.57 2.52±0.33a 2.03±0.28b 3.40±0.36bc 1.81±0.25b 2.39±0.30d 120.021＊＊胸腺指數(shù)2.56±0.31 2.04±0.27a 1.69±0.22b 2.45±0.30bc 1.42±0.24b 1.81±0.23d 33.981＊＊

2.3 各組肺癌大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較

與對照組比較，模型組IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，740 Y-P 組IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05），而順鉑組和升陽益胃湯組IL-6、TNF-α 水平降低（P＜0.05），且升陽益胃湯組IL-6、TNF-α 水平低于順鉑組（P＜0.05）；與740 Y-P 組比較，升陽益胃湯+740 Y-P 組IL-6、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。見表3。

Tab.3 Comparison of serum IL-6 and TNF-α levels in rats between the six groups表3 各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較（n=12，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of serum IL-6 and TNF-α levels in rats between the six groups表3 各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較（n=12，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與順鉑組比較，d與740 Y-P組比較，均P＜0.05。

組別對照組模型組順鉑組升陽益胃湯組740 Y-P組升陽益胃湯+740 Y-P組F IL-6 34.26±6.45 61.47±8.39a 50.15±7.62b 39.22±6.18bc 93.40±10.34b 70.83±9.56d 85.268＊＊TNF-α 24.45±4.20 56.29±7.86a 43.31±6.45b 32.06±5.29bc 81.52±8.37b 62.48±7.56d 115.121＊＊

2.4 各組肺癌大鼠血清IgG、IgA、IgM水平比較

與對照組比較，模型組IgG、IgA、IgM 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，順鉑組和740 Y-P 組IgG、IgA、IgM 水平降低（P＜0.05），升陽益胃湯組IgG、IgA、IgM 水平升高（P＜0.05）；升陽益胃湯組IgG、IgA、IgM 水平較順鉑組升高（P＜0.05）；與740 Y-P 組比較，升陽益胃湯+740 Y-P 組IgG、IgA、IgM水平升高（P＜0.05）。見表4。

Tab.4 Comparison of serum IgG,IgA and IgM levels in rats between the six groups表4 各組大鼠血清IgG、IgA、IgM水平比較（n=12，g/L，±s）

Tab.4 Comparison of serum IgG,IgA and IgM levels in rats between the six groups表4 各組大鼠血清IgG、IgA、IgM水平比較（n=12，g/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與順鉑組比較，d與740 Y-P組比較，均P＜0.05。

組別對照組模型組順鉑組升陽益胃湯組740 Y-P組升陽益胃湯+740 Y-P組F IgG 0.48±0.05 0.30±0.04a 0.21±0.03b 0.39±0.05bc 0.15±0.03b 0.27±0.04d 103.680＊＊IgA 0.081±0.011 0.052±0.007a 0.041±0.006b 0.067±0.008bc 0.032±0.005b 0.048±0.006d 69.151＊＊IgM 0.37±0.05 0.24±0.03a 0.15±0.03b 0.31±0.04bc 0.10±0.02b 0.23±0.04d 89.924＊＊

2.5 各組肺癌大鼠肺組織病理學(xué)變化比較

對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病變；模型組肺組織左葉增生、肺泡囊擴(kuò)張、上皮細(xì)胞明顯破損、鱗狀上皮化生、大量腫瘤細(xì)胞呈片狀或條索狀，排列紊亂，伴有較多炎性細(xì)胞浸潤；740 Y-P組上述病變較模型組加重，伴有組織腫脹、氣管黏膜充血；順鉑組和升陽益胃湯組上述肺組織病變較模型組減輕，肺組織腫脹不明顯，肺泡囊及上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本清晰；而升陽益胃湯+740 Y-P組上述肺組織病變較升陽益胃湯組加重，較740 Y-P組減輕。見圖1。

2.6 各組肺癌大鼠肺組織ICAM-1 和MMP-9 mRNA水平比較

與對照組比較，模型組肺組織ICAM-1和MMP-9 mRNA水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，740 YP組肺組織ICAM-1和MMP-9 mRNA水平升高（P＜0.05），而順鉑組和升陽益胃湯組肺組織ICAM-1 和MMP-9 mRNA 水平降低（P＜0.05），其中升陽益胃湯組肺組織ICAM-1和MMP-9 mRNA水平較順鉑組降低（P＜0.05）；與740 Y-P 組比較，升陽益胃湯+740 Y-P 組肺組織ICAM-1 和MMP-9 mRNA 水平降低（P＜0.05）。見表5。

Tab.5 Comparison of ICAM-1 mRNA and MMP-9 mRNA levels in lung tissue of rats between the six groups表5 各組大鼠肺組織ICAM-1 mRNA和MMP-9 mRNA水平比較（n=12，±s）

Tab.5 Comparison of ICAM-1 mRNA and MMP-9 mRNA levels in lung tissue of rats between the six groups表5 各組大鼠肺組織ICAM-1 mRNA和MMP-9 mRNA水平比較（n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與順鉑組比較，d與740 Y-P組比較，均P＜0.05。

組別對照組模型組順鉑組升陽益胃湯組740 Y-P組升陽益胃湯+740 Y-P組F ICAM-1 mRNA 1.00±0.00 2.15±0.31a 1.72±0.20b 1.36±0.18bc 3.20±0.35b 2.34±0.30d 115.551＊＊MMP-9 mRNA 1.00±0.00 2.38±0.29a 1.79±0.24b 1.45±0.21bc 3.56±0.38b 2.50±0.33d 134.376＊＊

2.7 各組肺癌大鼠肺組織PI3K/Akt/NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與對照組比較，模型組肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值和核NF-κB p65 蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，740 Y-P 組肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值和核NF-κB p65蛋白水平升高（P＜0.05），而順鉑組和升陽益胃湯組肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值和核NF-κB p65 蛋白水平降低（P＜0.05），且升陽益胃湯組肺組織上述指標(biāo)水平與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與740 Y-P 組比較，升陽益胃湯+740 Y-P 組肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值和核NF-κB p65 蛋白水平降低（P＜0.05）。見圖2、表6。

Fig.2 Western blot result of PI3K/Akt/NF-κB pathway in lung tissue of rats in each group圖2 各組大鼠肺組織PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白印跡圖

Tab.6 Comparison of p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt ratio and nuclear NF-κB p65 protein level in lung tissue of rats between the six groups表6 各組大鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值和核NF-κB p65蛋白水平比較 （n=12，±s）

Tab.6 Comparison of p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt ratio and nuclear NF-κB p65 protein level in lung tissue of rats between the six groups表6 各組大鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值和核NF-κB p65蛋白水平比較 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與順鉑組比較，d與740 Y-P組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組順鉑組升陽益胃湯組740 Y-P組升陽益胃湯+740 Y-P組F p-PI3K/PI3K 0.20±0.04 0.51±0.07a 0.40±0.06b 0.38±0.05b 0.70±0.08b 0.54±0.06d 91.720＊＊p-Akt/Akt 0.15±0.03 0.42±0.06a 0.31±0.05b 0.30±0.05b 0.62±0.07b 0.47±0.06d 105.187＊＊核NF-κB p65/Lamin B1 0.12±0.02 0.35±0.05a 0.27±0.04b 0.24±0.04b 0.56±0.08b 0.41±0.05d 110.736＊＊

3 討論

手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療等在肺癌治療中均發(fā)揮著重要作用，但存在器官功能受損、耐藥、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等不良反應(yīng)，患者生存期仍處于較低水平［15-16］。因此，提高患者免疫力對延長患者生存期、抑制腫瘤生長和改善生存質(zhì)量具有積極意義。

化療藥在抗腫瘤時會損害患者的免疫力，而中藥復(fù)方制劑可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的含量和活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫監(jiān)視，減弱腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，進(jìn)而達(dá)到抑瘤效果。例如，益氣化痰方可升高非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD3+、CD4+占比及CD3+/CD4+比值，調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫力［17］；益氣健脾方能減緩?fù)砥诜伟┗熁颊逿 淋巴細(xì)胞的下降速度，提高患者免疫力，減輕化療的不良反應(yīng)［18］。升陽益胃湯方劑中黃芪、人參、半夏、白術(shù)、茯苓、甘草均為治療肺癌中藥復(fù)方中的常用中藥。黃芪、人參是扶正補(bǔ)益之要藥，具有抗肺癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤的作用，作用機(jī)制可能主要與提高機(jī)體免疫力有關(guān)［19］；白術(shù)可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和調(diào)控機(jī)體免疫力，發(fā)揮抗腫瘤活性［20］；茯苓中的茯苓多糖能夠增強(qiáng)肺癌對化療的敏感性，同時減少放化療引起的不良反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)免疫因子表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫有關(guān)［21］。基于此，筆者推測升陽益胃湯可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力達(dá)到治療肺癌的效果。

T 淋巴細(xì)胞分為輔助性T 細(xì)胞（如CD4+）、抑制性T 細(xì)胞（如CD8+）和毒性T 細(xì)胞（CTL），其中CD4+和CD8+在癌癥治療中發(fā)揮重要作用［22］。本研究采用含致癌物質(zhì)的碘化油誘導(dǎo)肺癌模型，發(fā)現(xiàn)升陽益胃湯可升高肺癌大鼠CD3+、CD4+占比和CD4+/CD8+比值，降低CD8+占比，并且上調(diào)血清IgG、IgA、IgM水平和脾、胸腺指數(shù)，表明升陽益胃湯能夠提高肺癌大鼠免疫力。此外，IL-6、TNF-α是腫瘤炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵標(biāo)志物，通常與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲有關(guān)。在本研究中，模型組大鼠血清IL-6和TNF-α水平較對照組升高，表明肺癌大鼠體內(nèi)存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)；而升陽益胃湯能有效抑制炎性因子水平，表明升陽益胃湯可有效抑制肺癌大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，提示升陽益胃湯可通過調(diào)節(jié)免疫力和炎癥反應(yīng)，從而在肺癌大鼠中發(fā)揮腫瘤抑制作用。

PI3K/Akt 信號通路在T細(xì)胞發(fā)育中具有關(guān)鍵作用，可調(diào)節(jié)CD4+/CD8+T 細(xì)胞分化比，而NF-κB 的活性受PI3K/Akt 通路的影響［23］。研究表明，PI3K/Akt/NF-κB 通路參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展［24］。另有報道顯示，黃芩素可通過抑制PI3K/Akt/NF-κB通路來增加A549肺腺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性［25］；下調(diào)顱內(nèi)動脈瘤中PI3K/Akt/NF-κB 信號通路活性可維持Th17/Treg平衡［26］。PI3K活化可誘導(dǎo)Akt磷酸化，Akt可降解IκB，促使NF-κB 核轉(zhuǎn)位，啟動其靶基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞存活；而NF-κB 的活化可上調(diào)ICAM-1 表達(dá)并誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤免疫逃逸［27］。本研究結(jié)果顯示，肺癌大鼠肺組織中PI3K/Akt/NF-κB通路相關(guān)蛋白水平升高，并伴隨著ICAM-1 mRNA和MMP-9 mRNA水平升高，表明肺癌大鼠PI3K/Akt/NF-κB 信號通路被激活。給予升陽益胃湯干預(yù)后，肺癌大鼠肺組織PI3K/Akt/NF-κB 相關(guān)蛋白表達(dá)降低，ICAM-1 mRNA和MMP-9 mRNA水平降低，并且在使用PI3K 激活劑740 Y-P 的基礎(chǔ)上，加用升陽益胃湯干預(yù)可明顯抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路，下調(diào)ICAM-1 和MMP-9 水平，增強(qiáng)肺癌大鼠免疫力，提示升陽益胃湯可能通過抑制PI3K/Akt/NF-κB 信號通路活化而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，升陽益胃湯可增強(qiáng)肺癌大鼠T 淋巴細(xì)胞免疫力，抑制腫瘤免疫逃逸，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/NF-κB 信號通路活化有關(guān)。本研究為升陽益胃湯應(yīng)用于肺癌治療提供了新的理論依據(jù)。然而，肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程涉及多種通路，升陽益胃湯對肺癌的治療作用是否與其他機(jī)制有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。此外，升陽益胃湯是否會影響肺癌細(xì)胞的增殖及浸潤，也是下一步研究的重點(diǎn)方向。