適度提高血鉀濃度可改善心肺復(fù)蘇大鼠腦組織線粒體功能

石佳欣，李諾，楊葉桂△，方衛(wèi)，覃斯娜，黃京菊，陳蒙華

心肺復(fù)蘇（cardiopulmonary resuscitation，CPR）后的腦損傷是影響早期復(fù)蘇成功的心臟驟停（cardiac arrest，CA）患者遠(yuǎn)期預(yù)后的重要因素。當(dāng)循環(huán)功能和組織灌注恢復(fù)后，部分患者的病情進(jìn)一步加重，其機(jī)制與缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）有關(guān)。亞低溫能夠提高機(jī)體的器官、組織，包括心、腦等對IRI的耐受性［1］。相關(guān)研究表明，高鉀可提高心臟對IRI的耐受性［2］。本課題組前期研究證實，升高血鉀有助于減輕CPR 后腦的IRI，但其機(jī)制尚不清楚［3］。而且，血鉀過高可抑制心肌細(xì)胞興奮性，拮抗Ca2+，抑制心臟收縮。血鉀升高的幅度越高、速度越快對心臟的抑制作用則越大，嚴(yán)重時甚至可發(fā)生CA。因此，本研究擬探討CPR 早期使用氯化鉀的最佳劑量，并深入研究適度升高血鉀對復(fù)蘇后腦組織線粒體功能的影響，為探索和改善缺血性腦損傷的救治策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

（1）動物準(zhǔn)備。由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（體質(zhì)量210～240 g，鼠齡7～8 周），動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2014-0002。本實驗所有操作通過廣西醫(yī)科大學(xué)動物管理和應(yīng)用委員會批準(zhǔn)，符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)（倫理號：202101022）。所有大鼠在SPF級環(huán)境下喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料并自由飲水，實驗室及飼養(yǎng)中心室內(nèi)溫度維持在26 ℃。（2）主要儀器。起搏電極購于成都科技市場有限公司；小型動物呼吸機(jī)（RWD407）購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司；生物機(jī)能實驗系統(tǒng)（BL-420F）購于四川成都泰盟儀器公司。主要試劑：氯化鉀溶液購于河北天成藥業(yè)股份有限公司；0.9%氯化鈉注射液購于廣西裕源藥業(yè)有限公司；蛋白質(zhì)濃度定量檢測試劑盒購于上海杰美基因醫(yī)藥生物技術(shù)研究所；腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）檢測試劑盒及Na+/K+-ATP 酶測定試劑盒購于南京建成生物科技有限公司；動物細(xì)胞/組織活性線粒體分離試劑購于上海碧云天生物技術(shù)研究所；線粒體呼吸鏈復(fù)合物試劑盒（GMS50007、GMS50008、GMS50009、GMS50010）購于上海杰美基因醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CA/CPR動物模型建立與分組

根據(jù)Chen等［4］報道的經(jīng)食管電刺激誘導(dǎo)心室顫動（VF）建立CA/CPR 模型。術(shù)前禁食12 h，自由飲水。經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉注射液（3 mL/kg）麻醉大鼠。留置股靜脈導(dǎo)管用于藥物注射，留置股動脈導(dǎo)管用于動脈壓監(jiān)測，持續(xù)監(jiān)測第Ⅱ肢導(dǎo)心電圖。將經(jīng)口氣管導(dǎo)管連接小型動物呼吸機(jī)，行機(jī)械通氣（潮氣量6 mL/kg，頻率72 次/min）。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將80只大鼠分為假手術(shù)組（SH組）、生理鹽水組（NS組）及氯化鉀低（LK 組）、中（MK 組）、高劑量組（HK 組），每組16只。SH組僅行麻醉及以上操作。其余各組在心電及血流動力學(xué)穩(wěn)定10 min 后，將起搏電極置入食管心臟后方，停止機(jī)械通氣，用12 V 交流電經(jīng)食管電刺激誘導(dǎo)VF 1 min。CA 6 min后，立即行CPR及呼吸機(jī)機(jī)械通氣，并經(jīng)靜脈予NS組、LK 組、MK 組、HK 組注射同體積的生理鹽水和1.25%、2.5%、5%氯化鉀溶液，劑量為2.4 mL/kg。CPR 后若未達(dá)到自主循環(huán)恢復(fù)（return of spontaneous circulation，ROSC），則在CPR 1 min、3 min靜脈注射0.02 mg/kg腎上腺素。CPR超過10 min未達(dá)ROSC 定義為復(fù)蘇失敗。建模期間，室溫維持26 ℃，大鼠直腸溫度維持在（37.0±0.3）℃。ROSC 后持續(xù)監(jiān)測動脈血壓和心電1 h。ROSC 后24 h 進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的評估及檢測。動物實驗的流程見圖1。

Fig.1 The flow chart of animal experiment圖1 動物實驗的流程圖

1.2.2 評判標(biāo)準(zhǔn)

CA 標(biāo)準(zhǔn)：心電圖呈VF、心臟停搏或無脈性電活動，血管內(nèi)壓力監(jiān)測器上動脈搏動的突然消失或平均動脈壓（MAP）＜10 mmHg（1 mm Hg=0.133 kPa）。ROSC 標(biāo)準(zhǔn)：心電圖呈竇性、房性、交界性節(jié)律，血壓監(jiān)測示MAP≥50 mmHg 且維持≥5 min［4］。

1.2.3 檢測指標(biāo)

記錄各組動物基礎(chǔ)參數(shù)，檢測ROSC后1 min及10 min血鉀，ROSC 后24 h 評估神經(jīng)功能缺損評分（neurological deficit scores，NDS），海馬組織HE 染色觀察細(xì)胞形態(tài)。ROSC 后24 h，每組選取7只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，快速提取腦標(biāo)本，提取右側(cè)海馬后勻漿，使用ATP 檢測試劑盒測定ATP 含量和Na+/K+-ATP 酶活性；提取左側(cè)海馬后勻漿，采用差速離心法提取海馬組織線粒體，運用比色法定量法測定線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，對于方差齊的數(shù)據(jù)組間多重比較行LSD-t檢驗；方差不齊的數(shù)據(jù)組間多重比較行Tamhane 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的基線特征比較

各組體質(zhì)量、心率、MAP、電刺激時間等基礎(chǔ)參數(shù)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of baseline characteristics between five groups表1 各組動物基線特征比較（n=16，±s）

Tab.1 Comparison of baseline characteristics between five groups表1 各組動物基線特征比較（n=16，±s）

均P＞0.05。

組別SH組NS組LK組MK組HK組F體質(zhì)量/g 222.13±9.51 225.13±9.05 223.38±7.77 222.75±6.05 224.31±8.93 0.330心率/（次/min）390.88±16.20 393.81±22.98 384.94±14.22 389.56±16.86 394.25±17.94 0.711 MAP/mmHg 93.19±7.17 92.44±7.81 93.31±6.34 90.75±5.61 94.13±7.32 0.546電刺激時間/s 61.75±2.38 61.44±2.25 61.88±3.05 61.13±2.06 0.298

2.2 ROSC后各組大鼠復(fù)蘇效果比較

與LK、MK 組比較，HK 組ROSC 時間延長（P＜0.05）；與NS 組相比，MK 組ROSC 后24 h NDS 升高（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Comparison of resuscitation effects between five groups表2 各組動物復(fù)蘇效果比較（±s）

Tab.2 Comparison of resuscitation effects between five groups表2 各組動物復(fù)蘇效果比較（±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與SH 組比較，b與NS 組比較，c與LK 組比較，d與MK組比較，P＜0.05。

組別SH組NS組LK組MK組HK組F ROSC只數(shù)0 10 12 15 10 ROSC時間/s 92.70±14.28 83.00±10.97 82.53±12.87 98.60±15.47cd 3.927＊ROSC后24 h生存只數(shù)16 9 12 15 9 ROSC 后24 h NDS/分80.00±0.00 72.11±1.45a 73.58±1.68 76.40±1.35bc 72.67±2.23d 68.534＊＊

2.3 ROSC后MAP變化

與NS組比較，LK組復(fù)蘇后2 min MAP明顯升高（P＜0.05），MK 組復(fù)蘇后MAP 無明顯差異，HK 組ROSC 后8 min 內(nèi)的MAP 下降（P＜0.05）。隨著ROSC 后時間的延長，HK 組與NS 組組間MAP 差異逐漸縮小。見表3。

Tab.3 Comparison of MAP within 1 hour after ROSC between five groups表3 各組ROSC后1 h內(nèi)的MAP比較（mmHg，±s）

Tab.3 Comparison of MAP within 1 hour after ROSC between five groups表3 各組ROSC后1 h內(nèi)的MAP比較（mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；a與SH組比較，b與NS組比較，c與LK組比較，d與MK組比較，P＜0.05。

組別SH組NS組LK組MK組HK組F n 16 9 12 15 9 2 min 87.88±3.84 72.90±2.51a 78.33±5.21b 73.60±2.97 58.90±4.46bcd 89.356＊＊4 min 86.81±3.94 74.60±3.03a 78.83±5.37 73.93±2.52 61.00±4.57bcd 68.531＊＊6 min 87.06±4.33 75.70±1.83a 79.42±5.52 74.93±2.74 62.80±4.76bcd 57.534＊＊8 min 87.25±3.73 77.00±2.10a 80.50±4.78 75.93±3.61 66.00±6.68bcd 39.473＊＊10 min 87.00±4.05 77.40±2.95a 80.58±4.62 77.13±3.87 71.30±8.54 17.440＊＊30 min 87.56±3.37 78.50±3.24a 80.75±5.03 78.27±4.53 73.80±7.70c 14.489＊＊60 min 87.81±3.80 78.40±3.60a 80.75±5.85 78.40±4.82 75.70±6.89 11.805＊＊

2.4 血鉀水平變化

與NS 組比較，MK 組、HK 組ROSC 后1 min、10 min 血鉀升高（P＜0.05）。與LK 組比較，MK 組ROSC 后10 min 血鉀升高，HK 組ROSC 后1 min、10 min血鉀升高（P＜0.05）。見表4。

Tab.4 Comparison of blood levels of K+before and after ROSC between five groups表4 各組ROSC前后血鉀水平比較（n=7，mmol/L，±s）

Tab.4 Comparison of blood levels of K+before and after ROSC between five groups表4 各組ROSC前后血鉀水平比較（n=7，mmol/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與SH 組比較，b與NS 組比較，c與LK 組比較，d與MK組比較，P＜0.05。

組別SH組NS組LK組MK組HK組F CA前3.93±0.14 3.92±0.22 3.91±0.23 3.84±0.18 3.84±0.16 0.965 ROSC后1 min 3.92±0.16 4.83±0.21a 5.22±0.28 5.82±0.35b 6.52±0.39bc 56.277＊＊ROSC后10 min 3.85±0.15 4.15±0.22 4.34±0.35 5.15±0.34bc 5.67±0.42bc 51.072＊＊

2.5 海馬細(xì)胞形態(tài)及組織中相關(guān)指標(biāo)比較

（1）HE染色。結(jié)果顯示，SH組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊，大小正常，染色均勻，色淡，層次分明，核仁清晰。對比SH組，NS組CA1區(qū)細(xì)胞外間隙增寬，細(xì)胞腫脹，部分細(xì)胞核固縮、深染。與NS 組相比，MK 組細(xì)胞排列及形態(tài)明顯改善，染色均勻，核仁比較清晰。MK 組細(xì)胞排列及形態(tài)優(yōu)于LK 組及HK組。見圖2。（2）ATP 含量及Na+/K+-ATP 酶活性。與SH 組比較，NS 組海馬組織ATP 含量減少，Na+/K+-ATP 酶活性降低（P＜0.05）。與NS 組相比，LK 組ATP 含量升高（P＜0.05），MK 組ATP 含量及Na+/K+-ATP酶活性升高（P＜0.05）。見表5。（3）呼吸鏈復(fù)合體的活性。與SH 組比較，NS 組海馬組織呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性降低（P＜0.05）。與NS組比較，LK組呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ活性升高（P＜0.05），MK 組呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性明顯升高（P＜0.05），HK組呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ活性升高（P＜0.05）。見表6。

Tab.5 Comparison of ATP content and Na+/K+-ATPase activity in hippocampus of rats between five groups表5 各組大鼠海馬組織ATP含量及Na+/K+-ATP酶活性比較（n=7，±s）

Tab.5 Comparison of ATP content and Na+/K+-ATPase activity in hippocampus of rats between five groups表5 各組大鼠海馬組織ATP含量及Na+/K+-ATP酶活性比較（n=7，±s）

＊＊P＜0.01；a與SH組比較，b與NS組比較，P＜0.05。

組別SH組NS組LK組MK組HK組F ATP/（μmol/g）336.31±12.68 290.93±11.96a 310.27±17.48b 318.10±16.21b 305.89±18.61 7.988＊＊Na+/K+-ATP酶活性/（U/mg）26.39±2.69 18.93±1.21a 20.40±2.26 22.30±2.11b 20.20±1.12 15.213＊＊

Tab.6 Comparison of the activity of respiratory chain complex in the hippocampus of rats between five groups表6 各組大鼠海馬組織呼吸鏈復(fù)合體活性比較（n=7，μmol·min-1·g-1，±s）

Tab.6 Comparison of the activity of respiratory chain complex in the hippocampus of rats between five groups表6 各組大鼠海馬組織呼吸鏈復(fù)合體活性比較（n=7，μmol·min-1·g-1，±s）

＊＊P＜0.01；a與SH 組比較，b與NS 組比較，c與LK 組比較，d與MK組比較，P＜0.05。

組別SH組NS組LK組MK組HK組F復(fù)合體Ⅰ5.27±0.31 4.08±0.38a 4.43±0.33 4.74±0.45b 4.34±0.53d 11.933＊＊復(fù)合體Ⅱ6.05±0.40 4.29±0.31a 4.50±0.39 5.04±0.23bc 4.42±0.32d 32.680＊＊復(fù)合體Ⅲ3.43±0.29 2.59±0.15a 2.93±0.19b 3.11±0.36b 2.90±0.13b 11.747＊＊復(fù)合體Ⅳ3.70±0.36 3.42±0.31 3.52±0.42 3.60±0.66 3.36±0.38 0.677

Fig.2 HE staining of hippocampal CA1 region of rats in each group at 24 h after ROSC(×200)圖2 各組大鼠ROSC后24 h海馬CA1區(qū)HE染色（×200）

3 討論

本研究結(jié)果顯示，MK組ROSC后24 h海馬組織Na+/K+-ATP 酶活性和線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性升高，ATP 生成增加，NDS 升高，海馬CA1 區(qū)細(xì)胞形態(tài)明顯改善，而LK組、HK組NDS及海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)未見明顯改善。因此，筆者認(rèn)為CPR 時適當(dāng)提高血鉀可改善CA/CPR 后的腦IRI，推測其機(jī)制可能是血鉀可拮抗細(xì)胞K+離子外流，增加細(xì)胞內(nèi)K+濃度，改善線粒體功能，但過高血鉀則削弱高鉀對CPR大鼠腦組織的保護(hù)作用。

3.1 適度高鉀可維持細(xì)胞內(nèi)外K+穩(wěn)態(tài)

維持細(xì)胞內(nèi)外K+濃度差是細(xì)胞發(fā)揮正常功能的重要條件，細(xì)胞內(nèi)K+過量外排可介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡過程中，持續(xù)的外向電流IK和短暫的外向電流IA介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的K+排出細(xì)胞外，細(xì)胞外的高鉀可通過拮抗K+外流減輕神經(jīng)元的凋亡［5］。細(xì)胞膜K+跨膜轉(zhuǎn)運主要由電壓依賴性K+通道、配體依賴的K+通道及Na+-K+-ATP酶共同參與，Na+-K+-ATP酶主要參與細(xì)胞攝取K+的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞缺血缺氧時，ATP 合成不足，Na+-K+-ATP酶活性下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)K+攝取減少，細(xì)胞內(nèi)滲透壓下降，伴隨著水分子大量涌出，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，半胱氨酸蛋白酶和核酸酶活性被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。缺血后快速恢復(fù)Na+-K+-ATP酶活性、增加K+攝取則可明顯改善缺血后的腦損傷。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)K+升高達(dá)150 mmol/L時則可拮抗細(xì)胞凋亡［6］。前期局灶性腦IRI 研究證實，使用氯化鉀可抑制細(xì)胞內(nèi)K+外流、增加K+攝?。?］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，CPR時使用氯化鉀可增加Na+/K+-ATP 酶活性。由此，筆者認(rèn)為CPR 時使用氯化鉀可能通過抑制細(xì)胞內(nèi)K+外流、增加K+攝取，維持細(xì)胞內(nèi)外K+穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而減輕腦IRI。

3.2 適度高鉀可改善腦組織線粒體功能

線粒體是能量合成的主要場所，ATP 的產(chǎn)生主要通過線粒體氧化磷酸化和線粒體呼吸鏈（MRC）的電子傳遞，MRC由位于線粒體內(nèi)膜的一系列有電子傳遞功能的氧化還原酶組成，主要包括呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ和ATP合成酶（呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ）。復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ是呼吸鏈電子傳遞中電子泄漏和超氧化物產(chǎn)生的重要位點［8］。線粒體基質(zhì)K+濃度和細(xì)胞內(nèi)K+濃度相似，細(xì)胞內(nèi)高K+是維持線粒體生理功能的基礎(chǔ)。線粒體外K+下降會抑制呼吸鏈，降低呼吸速率，K+內(nèi)流減少，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體基質(zhì)體積減少，對鈣誘導(dǎo)的通透性轉(zhuǎn)化更敏感，線粒體通透性增加［9］。相反，線粒體K+內(nèi)流增加，可以使線粒體基質(zhì)體積增大、呼吸作用增加，進(jìn)而促進(jìn)線粒體能量生成，抑制活性氧（ROS）的產(chǎn)生；還可以抑制Ca2+內(nèi)流，有效防止線粒體內(nèi)鈣超載。另有研究表明，線粒體K+內(nèi)流增加有助于缺血時的糖酵解途徑向有利于細(xì)胞存活的方向轉(zhuǎn)變［10］。前期研究發(fā)現(xiàn)，ROSC 后24 h 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡表現(xiàn)最明顯［11］，而提高血鉀可明顯減少ROSC 后腦組織ROS 的生成［3］。本研究結(jié)果顯示，與NS 組比較，MK 組的腦組織呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性明顯升高，ATP 含量增加。由此推測，適度升高血鉀可能通過影響線粒體呼吸鏈功能提高呼吸速率，增加ATP 的合成，減少ROS 生成，減輕腦IRI。

3.3 血鉀過高可削弱其對腦組織的保護(hù)作用

本研究發(fā)現(xiàn)，HK組的腦IRI改善不優(yōu)于MK組，這可能與過高的血鉀對心血管的抑制和復(fù)蘇后血壓下降有關(guān)。前期大腦中動脈閉塞（MCAO）模型研究顯示，高劑量氯化鉀（2.5%、3.2 mL/kg）比低劑量（1.25%，3.2 mL/kg）改善腦IRI 更明顯［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，中等劑量的氯化鉀具有更好的治療效果，分析ROSC 后MAP 的變化可以發(fā)現(xiàn)，相比NS 組，HK 組ROSC 后8 min 內(nèi)MAP 明顯降低。在正常生理狀態(tài)下，維持足夠的MAP 對保證腦灌注、促進(jìn)腦功能的恢復(fù)或防止更嚴(yán)重的缺血性腦損傷至關(guān)重要。而有效循環(huán)血量、心臟射血能力和一定的血管張力是維持正常血壓的基本要素。高血鉀使細(xì)胞膜去極化、膜負(fù)電位下降，抑制電壓依賴性慢鈣通道及抑制Na+-Ca2+交換而使鈣內(nèi)流減少，導(dǎo)致心肌收縮減弱［13］。另外，細(xì)胞外K+升高，細(xì)胞K+外流減少，靜息電位絕對值減小，Na+通道失活數(shù)量增加，相應(yīng)的可被激活的Na+通道減少，心肌興奮性降低，甚至停跳。與MCAO模型不同，CPR后機(jī)體的各器官，包括心臟均經(jīng)歷了IRI，心臟對氯化鉀耐受性減低。本研究結(jié)果也顯示HK 組復(fù)蘇早期MAP 明顯降低。因此，筆者認(rèn)為CPR時適度升高血鉀濃度可減輕腦IRI，但過高的血鉀抑制了心臟興奮性及收縮功能，削弱了高鉀潛在的拮抗缺血性損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，CPR 早期適度升高血鉀濃度可改善腦組織線粒體功能，減輕腦的IRI，但血鉀濃度過高可能出現(xiàn)心血管系統(tǒng)的抑制和血壓下降，削弱高血鉀對腦IRI的保護(hù)作用。因此，如何平衡高血鉀的獲益和風(fēng)險，探索高血鉀拮抗腦IRI的相關(guān)機(jī)制是未來研究的重點。