一個大麥黃化突變體的突變機(jī)理及其遺傳機(jī)制研究

白道寬， 郭寶健， 洪益， 張萌娜， 朱娟， 呂超， 王菲菲， 許如根

（揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州，225009）

葉綠體是植物光合作用的場所，可將太陽能轉(zhuǎn)化成化學(xué)能供植株生長和發(fā)育，最終形成作物產(chǎn)量[1]。葉綠素含量直接影響光合效率，最終決定農(nóng)藝性狀和作物產(chǎn)量[2]。葉綠素分為葉綠素a和葉綠素b，葉綠素a是主要光合色素，直接從太陽光獲取能量；葉綠素b是輔助光合色素，將光能傳遞給葉綠素a。葉色與葉綠素組分和含量有關(guān)，易于識別。葉色突變體是最常見的葉色變異材料，突變往往造成相關(guān)基因的缺陷，使葉綠素合成受到影響，造成植株葉片黃化，是研究葉綠素形成機(jī)理的重要材料[3-4]。

近年來，利用葉色突變體對葉綠素合成、葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育、光合作用以及色素合成相關(guān)酶的生物學(xué)功能等進(jìn)行了大量研究，水稻中已有百余個葉色突變體被報道（http://www.gramene.org）[5]，部分表現(xiàn)出條紋、斑點(diǎn)、葉脈黃化等特殊表型[6-8]。玉米中分離克隆的與葉色相關(guān)的數(shù)量性狀座位（quantitative trait locus，QTLs）或基因已達(dá)200余個（http://www.maizegdb.org）[9]。目前，已報道的大麥黃化相關(guān)基因主要與葉綠素代謝途徑和葉綠體發(fā)育相關(guān)，其中包含多個葉綠素合成關(guān)鍵酶基因，如PORA、PORB、CAO、Xantha-h、Xantha-g、Xantha-f等[10-13]，PORA與PORB突變使蛋白復(fù)合物合成缺失，導(dǎo)致植株體內(nèi)單線態(tài)氧積累，造成植株黃化；Xantha-h、Xantha-g、Xantha-f分別編碼大小為40、70和140 kD的3個大小不同的多肽亞基，組成鎂螯合酶，任一基因突變均會影響Mg2+插入原卟啉IX（Proto IX）；CAO突變導(dǎo)致葉綠素b合成途徑受阻，形成獨(dú)特的缺葉綠素b型黃化。此外，葉綠體與核糖體發(fā)育途徑及光系統(tǒng)中的基因發(fā)生突變同樣會導(dǎo)致葉色變化，如HvCMF7[14]、HvCMF3[15]、HvLST[16]等。Landau等[17]發(fā)現(xiàn)，YCF3基因突變致使PSI組件發(fā)生缺陷，導(dǎo)致PSII嚴(yán)重的光抑制和降解。Lencina等[18]利用cpm突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，MSH1基因突變會造成細(xì)胞質(zhì)體發(fā)育不穩(wěn)定，從而影響葉綠體發(fā)育。Bosco等[19]利用大麥葉色缺陷突變體闡述了葉綠體發(fā)育缺陷對COR(cold-regulated)基因表達(dá)的影響，從一定程度上解釋了葉綠體發(fā)育與抗逆性之間的關(guān)聯(lián)。相比較于水稻、擬南芥等模式植物，大麥由于基因組較大，已定位的與葉綠素合成、葉綠體分化及光形態(tài)建成相關(guān)基因較少，隨著大麥全基因組測序完成，越來越多調(diào)控大麥葉色的基因逐漸被發(fā)掘出來，但是涉及響應(yīng)冷脅迫的大麥葉色突變體偏少，開展有關(guān)溫度對大麥葉色突變體的發(fā)育及光合特性影響的研究，可用于探究大麥的葉綠素合成、葉綠體發(fā)育及光合對溫度的響應(yīng)機(jī)制。

本課題組以二棱啤用大麥品種‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’為材料，利用甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate，EMS）誘變的方法，篩選得到1個溫敏黃化突變體G039。該突變體在揚(yáng)州秋播，自出苗即呈現(xiàn)出黃化表型，春季隨氣溫升高，葉片逐漸轉(zhuǎn)綠。本文通過表型觀察、生理指標(biāo)、組織結(jié)構(gòu)及相關(guān)基因分析，探究突變體G039的基因突變機(jī)理及遺傳特點(diǎn)，以期為大麥葉綠素合成及光合能力相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’（Yangnongpi 5，YNP 5）、‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’種子EMS誘變后連續(xù)6代自交的溫敏黃化突變體G039及突變體分別與野生型和江蘇主推大麥品種‘揚(yáng)農(nóng)啤7號’配置的雜種F1與F2群體為材料。供試材料均來自揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院大麥研究所。

1.2 材料種植

1.2.1 田間種植 2020—2021連續(xù)2年秋季將供試材料點(diǎn)播于揚(yáng)州大學(xué)大麥試驗(yàn)田，行長1.2 m，行距0.2 m，株距0.06 m，每個材料3個重復(fù)，每個重復(fù)2行。

1.2.2 氣候箱培養(yǎng) 將野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’及突變體G039種子置于25 ℃下催芽1 d，選取萌發(fā)程度一致的種子種植于裝有營養(yǎng)土的盆缽，每盆均種2粒，各種植50盆，置于光照培養(yǎng)箱（合肥達(dá)斯卡特生物科技有限公司，RGLC-P1200-D3）中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)條件：12000 lx、光16 h/暗8 h、70%濕度、25 ℃。之后將‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’和G039幼苗同時分別置于不同溫度（10、15、20、25 ℃）光照培養(yǎng)箱中生長2周，光照和濕度同上。2周后進(jìn)行葉色觀察、SPAD值、葉綠素含量及光合特性參數(shù)的測定。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 主要農(nóng)藝性狀調(diào)查 在大田成熟期，隨機(jī)取20株‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039調(diào)查株高（cm）、穗長（cm）、穗下節(jié)間長（cm）、分蘗數(shù)與每穗粒數(shù)5項(xiàng)農(nóng)藝性狀，取平均數(shù)作為各材料的性狀值；收獲后隨機(jī)取‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039的種子，利用自動考種分析儀（萬深SC-G）考察粒長（mm）、粒寬（mm）和千粒重（g），重復(fù)3次。利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行t測驗(yàn)，比較二者主要農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量構(gòu)成因素差異性。

1.3.2 SPAD值測定 不同溫度下分別取3株‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039，利用柯尼卡美能達(dá)SPAD儀（SPAD-502PLUS）測量第2葉最寬處的葉綠素SPAD值，重復(fù)3次。

1.3.3 光合色素含量測定 不同溫度下分別取3株‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039，取第2葉中間部位，將葉片兩端剪去并分離主葉脈，稱取葉片重量并記錄。將葉片剪成0.2 cm×0.2 cm的小塊，放置于10 mL離心管中，加入8 mL 95%的乙醇，避光浸提48 h。參考Qin等[20]的方法利用紫外分光光度計(jì)測量上清液吸光度值，計(jì)算葉綠素a (chlorophyll a, Chl a)、葉綠素b (chlorophyll b, Chl b)及總?cè)~綠素含量，重復(fù)3次。用同樣方法測定田間條件下苗期與灌漿期‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’和G039的葉綠素含量。

1.3.4 光合速率測定 使用CIRAS-3型光合儀（漢莎科學(xué)儀器有限公司）在植株第2葉葉片中下部進(jìn)行測定，不同溫度處理下‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039各選擇3株，取平均值。測定的主要指標(biāo)包括：凈光合速率（net photosynthate，Pn）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr）、氣孔導(dǎo)度（stomatal conductance，Gs）、水分利用率（water utilization rate，WUE）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）。

1.3.5 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察 取樣方法同1.3.3，取樣后將葉片剪成面積約1 mm2的正方形，置于2.0 mL離心管中，立即放入2.5%的戊二醛固定液（25%戊二醛∶0.2 mol·L-1磷酸緩沖液∶無菌水體積比為1∶4∶5），于4 ℃下保存，固定好后進(jìn)行清洗，然后再固定、洗滌、脫水與硬化，再經(jīng)置換、浸漬、包埋、聚合、修塊、切片、染色等一系列過程處理后，用透射電鏡（Hitachi 7800型）進(jìn)行觀察、拍照[7]。

1.3.6 遺傳分析方法 觀察F1表型，統(tǒng)計(jì)2個F2群體中突變表型和野生表型株數(shù)及性狀分離比；利用卡方檢驗(yàn)，分析G039突變性狀的遺傳方式。

1.3.7 光合相關(guān)基因定量分析方法 選取不同溫度下野生型和突變體G039葉片相同位置提取植物總RNA，采用諾威贊生物科技（南京）有限公司的Fast Pure Universal Plant Total RNA Isolation Kit 試劑盒提取總RNA；采用該公司的HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；使用Ensembleplants (https://plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/Info/Index）下載葉綠素合成相關(guān)基因PORA、PORB、CAO、Xantha-h、Xantha-g、Xantha-f，與光合作用相關(guān)的基因ycf（光系統(tǒng)I組裝蛋白），葉綠體發(fā)育相關(guān)基因CMF7、CMF3、PTOX、LST和LFN1，編碼錯配修復(fù)蛋白的基因MSH1，與冷脅迫相關(guān)的基因COR的編碼區(qū)序列；利用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量PCR引物,交由擎科生物科技有限公司合成（表1）。以大麥GAPDH（HORVU.MOREX.r3.7HG0703580）基因和α-tublin（HORVU.MOREX.r3.1HG0082050）基因?yàn)閮?nèi)參，參照95 ℃ 30 s、95 ℃ 3 s、60 ℃ 20 s，40個循環(huán)的程序在7500 Real-time PCR 儀(Applied Biosystems 公司)上擴(kuò)增, 利用自帶軟件分析 CT值，計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。利用G039與‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’的比值代表各溫度下基因的相對表達(dá)量，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

表1 葉綠素合成、光合作用相關(guān)基因的定量引物Table 1 Primer of chlorophyll synthesis， photosynthesis related genes used fou quantitative real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039的大田表現(xiàn)分析

2.1.1 葉色分析 通過2020—2021與2021—2022年度連續(xù)2年的田間觀察發(fā)現(xiàn)，在大田生長條件下，相比較于野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’，突變體G039出苗即表現(xiàn)出明顯葉色黃化，并隨溫度降低二者差異愈發(fā)明顯（圖1A、1B）;至次年3月份，隨著氣溫逐漸回升，葉色逐漸轉(zhuǎn)綠，灌漿期G039與‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’之間葉色差異消失（圖1C）。為進(jìn)一步探索突變體G039出現(xiàn)黃葉表型原因，測定2個不同時期葉綠素含量。結(jié)果表明，與野生型相比，突變體G039苗期的總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b含量極顯著降低（圖2A）;在灌漿期，突變體G039的葉綠素a含量與野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’無顯著差異，而葉綠素b和總?cè)~綠素含量仍顯著低于‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’（圖2B）。以上結(jié)果表明，G039葉色黃化原因是葉片葉綠素含量降低。

圖1 自然條件下野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’和突變體G039的表型Fig. 1 Phenotypes of ‘YNP5’ and G039 under natural condition

圖2 野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’和突變體G039葉綠素含量Fig. 2 Contents of chlorophyll pigments in ‘YNP5’ and G039

2.1.2 農(nóng)藝性狀分析 通過對野生型與突變體成熟期相關(guān)農(nóng)藝性狀的考察（表2）發(fā)現(xiàn)，突變體G039的株高、穗長、穗下節(jié)間長、分蘗數(shù)與每穗粒數(shù)均顯著低于野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’；而突變體G039的粒長、粒寬與千粒重均高于‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’，并達(dá)到極顯著水平（圖1D、1E）。

表2 野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與突變體G039的主要農(nóng)藝性狀Table 2 Agronomic traits of the wild type ‘YNP5’ and mutant G039

2.2 不同溫度下葉片SPAD值分析

為了系統(tǒng)觀察突變體G039葉色受溫度的影響，對植株進(jìn)行不同溫度處理。由圖3可知，‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039在不同溫度下培養(yǎng)2周后，葉片的SPAD值在各個溫度下均存在顯著差異，但隨著溫度的升高，‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039的SPAD值差異幅度不斷縮小，葉色差異也變?。▓D4），說明G039葉色變化與生長環(huán)境溫度有關(guān)。

圖3 不同溫度下野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與突變體G039的SPAD值Fig. 3 SPAD values of the ‘YNP5’ and G039 under different temperature conditions

圖4 不同溫度下野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’和突變體G039表型Fig. 4 Phenotypes of ‘YNP5’ and G039 under different temperature conditions

2.3 不同溫度葉片葉綠素含量分析

由圖5可知，4種溫度（10、15、20、25 ℃）下‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’葉綠素含量與G039均存在顯著差異。在10 ℃條件下，G039的葉綠素含量最低，葉綠素a含量僅為‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’的27.35%，葉綠素b含量為‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’的20.83%，總?cè)~綠素含量為‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’的25.83%；隨著溫度的不斷上升，突變體G039的葉綠素a、葉綠素b含量呈現(xiàn)不斷增加的趨勢。G039葉綠素a與葉綠素b含量在不同溫度間變化明顯，說明G039葉片葉綠素含量變化與環(huán)境溫度相關(guān)，溫度越低，黃化越嚴(yán)重，葉綠素含量越低。

圖5 不同溫度下野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與突變體G039的葉綠素含量Fig. 5 Chlorophyll content of the ‘YNP5’ and G039 under different temperature conditions

2.4 不同溫度葉片光合特性指標(biāo)分析

不同溫度（10、15、20、25 ℃）下‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039的5種光合特性參數(shù)如圖6所示，‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’的凈光合速率在不同溫度下無顯著變化，G039凈光合速率隨著溫度升高先升后降，在10 ℃時顯著低于‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’，至20 ℃時與‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’無顯著差異，之后出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，25 ℃時與‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’出現(xiàn)顯著差異（圖6A）。‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039的蒸騰速率與氣孔導(dǎo)度在4種溫度下均無顯著差異，且隨溫度變化趨勢相同，蒸騰速率均隨溫度升高持續(xù)上升，氣孔導(dǎo)度在10～20 ℃內(nèi)大幅上升，在25 ℃時有所下降（圖6B、6C）?！畵P(yáng)農(nóng)啤5號’和G039的水分利用率與胞間CO2濃度在10 ℃時具有極顯著差異，在25 ℃時差異不顯著，并且二者隨溫度表現(xiàn)出了迥然不同的變化趨勢，‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’的水分利用率隨溫度升高持續(xù)下降，G039的水分利用率在10～20 ℃時穩(wěn)定上升，在25 ℃時有所下降；‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’的胞間CO2濃度在10～20 ℃時表現(xiàn)出上升，在25 ℃時下降；G039則在10～25 ℃范圍內(nèi)呈現(xiàn)穩(wěn)定下降趨勢（圖6D、6E）。值得注意的是，‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039的多個光合指標(biāo)在25 ℃時出現(xiàn)轉(zhuǎn)折。

圖6 不同溫度下‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039的光合指標(biāo)Fig. 6 Photosynthetic indices of ‘YNP 5’ and G039 under different temperature conditions

2.5 不同溫度下葉綠體超微結(jié)構(gòu)的差異分析

對10 和20 ℃下生長的突變體G039葉肉細(xì)胞中的葉綠體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果（圖7）顯示，相比于20 ℃，10 ℃下生長的突變體G039葉綠體數(shù)目明顯減少（圖7A、7D）；葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)也存在差異，10 ℃下的突變體G039類囊體發(fā)育紊亂，基粒片層堆疊更少，排列更疏松（圖7B、7C、7E、7F）。以上表明，低溫條件下突變體G039葉綠體發(fā)育受到嚴(yán)重影響，光合色素合成受阻，進(jìn)而產(chǎn)生黃化葉表型。

圖7 不同溫度下突變體G039葉肉細(xì)胞的葉綠體超微結(jié)構(gòu)Fig. 7 Ultrastructure of chloroplasts in cells of G039 mutant under different temperatures conditions

2.6 突變基因的遺傳分析

利用突變體G039分別與正常葉色的大麥品種‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’和‘揚(yáng)農(nóng)啤7號’進(jìn)行雜交，2個F1組合都表現(xiàn)為正常葉色，對2個F2分離群體的正常葉色與黃化類型單株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。由表3可知，2個F2分離群體野生型單株和突變型單株分離比均符合3∶1的分離比例（χ2=0.49,χ2=0.14,χ20.05=3.84），表明該突變性狀受1對隱性核基因獨(dú)立控制。

表3 突變性狀的遺傳分析Table 3 Genetic analysis of the mutant trait

2.7 光合相關(guān)基因表達(dá)分析

為研究G039葉色突變和低溫響應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制，分析了G039及其野生型中與葉綠素合成、葉綠體發(fā)育及光系統(tǒng)建成等相關(guān)基因的表達(dá)水平。由圖8可知，與光系統(tǒng)組裝相關(guān)的YCF3在10、20和25 ℃時在G039中表達(dá)量顯著下調(diào)；與葉綠素合成相關(guān)的HvCAO和與葉綠體發(fā)育相關(guān)的HvPTOX在突變體G039中的表達(dá)量顯著下調(diào)，且不受溫度變化的影響；PORA與PORB編碼形成復(fù)合蛋白，在葉綠素合成途徑中有關(guān)鍵作用，10 ℃下G039中2個基因的表達(dá)量顯著低于‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’，隨著溫度升高到20 ℃，G039與‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’之間2個基因的表達(dá)不存在顯著差異；冷脅迫響應(yīng)基因COR在20～25 ℃的G039與‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’中均不表達(dá)，在10～15 ℃下G039中的表達(dá)量顯著低于‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’。在4種溫度下，葉綠體發(fā)育相關(guān)的HvCMF3基因及編碼錯配修復(fù)蛋白的MSH1基因在G039中的表達(dá)量均顯著高于‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’。因此，部分葉綠素合成途徑和葉綠體分化發(fā)育相關(guān)基因及冷脅迫響應(yīng)基因表達(dá)異?？赡苁菍?dǎo)致突變體G039葉綠素含量降低的重要因素。

圖8 不同溫度下葉綠素合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量Fig. 8 Expression levels in genes involved in chlorophyll synthesis of YNP 5 and G039 under different temperature conditions

3 討論

葉色突變具有突變頻率高、表型易識別的特點(diǎn)，在大麥遺傳育種中有多方面的應(yīng)用價值，是研究葉綠體發(fā)育與光合作用機(jī)制的重要材料；此外，也可作為標(biāo)記性狀應(yīng)用于雜交種篩選[21-22]。本研究中的黃化突變體G039苗期葉色黃化，葉綠素a與葉綠素b含量較野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’顯著下降。隨著溫度升高，突變體G039逐漸返綠，葉片SPAD值上升，對各項(xiàng)光合色素單獨(dú)測定，顯示葉綠素a與葉綠素b含量均顯著升高，葉綠體透射電鏡觀察顯示，10 ℃下G039較20 ℃下葉綠體數(shù)目顯著減少，形態(tài)異常，類囊體發(fā)育紊亂，基粒片層堆疊減少，認(rèn)為突變體G039黃葉的表型是由于葉綠體發(fā)育異常和光合色素下降引起的，且表現(xiàn)出低溫敏感性。相比于SPAD儀法，乙醇浸提法測量色素含量具有穩(wěn)定性高、精確性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠反映出特定種類葉綠素的含量，有利于判斷葉綠素合成途徑如何受到影響。

閆偉平等[23]研究發(fā)現(xiàn)，26～28 ℃條件下最利于玉米光合作用的進(jìn)行；江華等[24]、楊淑巧等[25]研究認(rèn)為，小麥光合作用的最適溫度在20 ℃左右。本研究中，突變體G039凈光合速率隨溫度上升而升高，20 ℃時與‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’無差異；至25 ℃時再次產(chǎn)生差異，可能是由于溫度偏高導(dǎo)致凈光合速率產(chǎn)生微小降低，G039的凈光合速率在20與25 ℃時無顯著差異，因此大麥光合作用的最適溫度在20 ℃左右。

本研究中，‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039的蒸騰速率均隨溫度上升而升高，這與閆蓉等[26]的結(jié)論相同；‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039的氣孔導(dǎo)度在10～20 ℃隨著蒸騰速率的上升而升高，這與董樹亭等[27]的結(jié)論一致，但在25 ℃時氣孔導(dǎo)度下降，可能是由于溫度高于大麥光合作用的最適溫度，造成‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’與G039的氣孔導(dǎo)度下降。此外，‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’的胞間CO2濃度與G039的水分利用率在25 ℃時也發(fā)生轉(zhuǎn)折，可能與氣孔導(dǎo)度下降有一定關(guān)系。在10～20 ℃范圍，‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’的水分利用率隨著溫度升高而降低，胞間CO2濃度隨著氣孔導(dǎo)度變大而升高，與劉亮等[28]的研究結(jié)論一致；但G039在2項(xiàng)上的變化卻與‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’相反，認(rèn)為G039凈光合速率大幅上升，抵消了氣孔導(dǎo)度對胞間CO2濃度的影響，造成胞間CO2濃度持續(xù)下降，而在光合學(xué)中水分利用率為凈光合速率與蒸騰速率的比值，因此，G039的水分利用率隨之上升。本試驗(yàn)中，突變體G039的蒸騰速率與氣孔導(dǎo)度與野生型無差異，而凈光合速率、水分利用率顯著低于‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’，胞間CO2濃度顯著高于‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’，表明黃化會導(dǎo)致植株凈光合速率顯著下降，但蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度等其他指標(biāo)的變化取決于突變對細(xì)胞結(jié)構(gòu)及葉綠體發(fā)育造成的不同影響。值得注意的是，G039在株高、穗長、穗下節(jié)間長、分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)上顯著低于野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’，但粒長、粒寬與千粒重均顯著高于‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’，表明葉色基因可能參與調(diào)控粒型。千粒重作為決定產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，進(jìn)一步研究有利于探究葉色基因調(diào)控大麥產(chǎn)量的機(jī)理，對增加大麥產(chǎn)量具有重要的理論意義。

迄今為止，不同物種中已有數(shù)個葉色基因被克隆，如直接編碼葉綠素合成與降解的基因HvCAO、Xantha-f、PORB等，參與調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育的基因virescent-1(v1)[29]、virescent-2(v2)[30]、OsPPR16[31]等，參與光合作用及光系統(tǒng)發(fā)育的基因OspsaA[32]與YCF3等。CAO基因控制葉綠素a轉(zhuǎn)化為葉綠素b，由3個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：A域感知葉綠素b含量并調(diào)控CAO蛋白水平，B域鏈接器控制域間的聯(lián)系，C域催化葉綠素a轉(zhuǎn)化為葉綠素b；域與域之間相互協(xié)作，任一結(jié)構(gòu)域受損均會影響葉綠素b合成。本研究中，在低溫條件下突變體G039的葉綠素合成及葉綠體分化相關(guān)基因表達(dá)量下調(diào)，其中編碼葉綠素a加氧酶基因HvCAO在不同溫度下的表達(dá)量均顯著低于野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’，該酶將葉綠素a一條支鏈的甲基轉(zhuǎn)化為甲酰基，形成葉綠素b，在葉綠素代謝途徑中發(fā)揮不可替代的作用[12]。HvPTOX是光合作用及葉綠體分化相關(guān)基因簇成員，該基因下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致G039光合速率的下降，可能與葉綠體發(fā)育缺陷有關(guān)[33]。PORA與PORB編碼原葉綠素酸酯氧化還原酶，低溫下在G039中二者均顯著下調(diào)表達(dá)，隨著溫度升高，其在G039與‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’中的表達(dá)量差異逐漸縮小，20 ℃以上PORB在G039與‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’之間不存在顯著差異，說明突變體植株的葉綠素合成在低溫下受阻，使葉綠素含量大幅下降。HvCMF3作用于光系統(tǒng)Ⅱ及葉綠體分化[15]，不同溫度下，突變體G039的HvCMF3均較野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’上調(diào)表達(dá)，G039基因突變可能反饋上調(diào)HvCMF3的表達(dá)。此外，突變體中光系統(tǒng)編碼基因YCF3的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，G039基因突變可能阻礙了光系統(tǒng)的正常組裝，對其結(jié)構(gòu)和功能造成影響，抑制光反應(yīng)的正常進(jìn)行；而編碼錯配修復(fù)蛋白的MSH1基因在不同溫度G039中的表達(dá)量均明顯高于‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’，G039基因突變可能通過反饋調(diào)節(jié)改變該基因的表達(dá)水平；COR編碼1個低溫響應(yīng)蛋白，20～25 ℃時不表達(dá)，10～15 ℃時突變體G039中表達(dá)量顯著低于野生型‘揚(yáng)農(nóng)啤5號’，表明COR基因受低溫脅迫誘導(dǎo)，且表達(dá)受葉綠體發(fā)育影響。