有髯鳶尾系間遠(yuǎn)緣雜交障礙研究

王詩婷 石安琪 范諸平 高亦珂 王鑫姿 李叢叢 張啟翔

(北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院,北京 100083)

有髯鳶尾(Bearded iris) 觀賞價(jià)值高,在園林和庭院綠化中應(yīng)用廣泛。有髯鳶尾原產(chǎn)地歐洲中部和南部夏季少雨,而中國大部分地區(qū)屬于亞熱帶或溫帶季風(fēng)氣候,夏季高溫多雨,栽培有髯鳶尾夏季易染病致死,嚴(yán)重影響其推廣及應(yīng)用[1]。因此,解決有髯鳶尾夏季根腐問題是擴(kuò)大其應(yīng)用范圍的關(guān)鍵。

鳶尾屬內(nèi)不同系間遠(yuǎn)緣雜交可為有髯鳶尾引入其他鳶尾中適應(yīng)夏季高溫高濕的特性,為提高其對(duì)高溫高濕的耐受性提供更大的潛力。但有髯鳶尾系間遠(yuǎn)緣雜交存在嚴(yán)重障礙,人工雜交難以得到后代。將有髯鳶尾作父本與鳶尾(Iristectorumf.albaMakino)、黃菖蒲(IrispseudacorusL.)和西伯利亞鳶尾(IrissibiricaL.)雜交均未成功[2]。過去100余年的時(shí)間里,以有髯鳶尾作母本與鳶尾系間遠(yuǎn)緣雜交共獲得Loptec[3]、Ariel-tec[4]、Flying Dragon[5]、Dragonscrest[6]和Paltec[7]這5個(gè)品種,但雜交過程不祥且品種真實(shí)性未得到驗(yàn)證;同時(shí)這5個(gè)品種花部特征具有父本特點(diǎn),垂瓣中央的髯毛表現(xiàn)為毛和鳶尾雞冠狀附屬物的結(jié)合。系間雜種的存在說明有髯鳶尾系間雜交存在可行性。此外,有研究利用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得燕子花鳶尾類玉蟬花(Irisensata)和有髯鳶尾品種G1組培苗[8]。以往很難通過人工雜交獲得有髯鳶尾系間遠(yuǎn)緣后代,因此,探索有髯鳶尾系間遠(yuǎn)緣雜交障礙發(fā)生時(shí)期及克服方法是獲得有髯鳶尾系間遠(yuǎn)緣雜交后代的關(guān)鍵。

本研究將有髯鳶尾與無根腐病的鳶尾和無髯類的西伯利亞鳶尾人工授粉,進(jìn)行系間遠(yuǎn)緣雜交,通過對(duì)花粉原位萌發(fā)和子房發(fā)育觀測,判斷不同組合遠(yuǎn)緣雜交主要障礙,確定胚拯救時(shí)期;并利用胚拯救技術(shù)克服受精后障礙獲得鳶尾系間雜交幼苗,旨在為提高有髯鳶尾遠(yuǎn)緣雜交效率,培育抗根腐病能力提高的有髯鳶尾新品系提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交試驗(yàn)材料栽培于國家花卉工程技術(shù)研究中心苗圃(40°09′ N,116°26′ E)。親本:‘白與黃’‘印度首領(lǐng)’‘音箱’及其雜交后代等有髯鳶尾、鳶尾和西伯利亞鳶尾。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1親本和雜交組合

設(shè)置4個(gè)雜交組合:有髯鳶尾與鳶尾正反交、有髯鳶尾與西伯利亞鳶尾正反交,去雄人工授粉雜交。

1.2.2花粉原位萌發(fā)觀測

授粉后2、4、6、12、24、48 h,每組合取3個(gè)已授粉雌蕊,使用卡諾固定液固定,置于70%酒精貯存。用0.1%水溶性苯胺藍(lán)染色,在熒光顯微鏡下觀測拍照。

1.2.3子房發(fā)育動(dòng)態(tài)觀測

每組合隨機(jī)選取5個(gè)子房,授粉后每3 d觀測子房中部直徑,取平均值。

1.2.4子房坐果率統(tǒng)計(jì)

觀察4個(gè)系間遠(yuǎn)緣雜交組合子房發(fā)育情況,授粉后5～7 d統(tǒng)計(jì)坐果率。

坐果率=(果實(shí)數(shù)/授粉花朵數(shù))×100%

1.2.5胚拯救

授粉后持續(xù)觀察子房發(fā)育動(dòng)態(tài),當(dāng)子房停止發(fā)育,將胚珠從子房中取出,接種至含MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA和MS+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉在柱頭上萌發(fā)的熒光觀察與雜交障礙分析

2.1.1有髯鳶尾與鳶尾正反交組合花粉萌發(fā)與花粉管生長狀況分析

以有髯鳶尾為母本,與鳶尾雜交后2～4 h,花粉大量萌發(fā),花粉管伸長,出現(xiàn)扭曲盤繞現(xiàn)象(圖1(a));授粉后4～6 h,花粉管伸長至柱頭四分之一,柱頭上胼胝質(zhì)現(xiàn)象明顯(圖1(b));授粉后6～12 h,花粉管伸長至柱頭底部,花粉管通道內(nèi)可見大量胼胝質(zhì)(圖1(c));授粉后48 h,少量花粉管順利到達(dá)胚珠(圖1(d))。以鳶尾為母本,與有髯鳶尾雜交后4～6 h,花粉粒大量萌發(fā),花粉管伸長至柱頭二分之一處,并在柱頭表面彎折(圖1(e));授粉后6～12 h,花粉管伸長至柱頭底部(圖1(f));授粉后12～24 h,花粉管未到達(dá)胚珠(圖1(g));授粉后48 h,少數(shù)花粉管到達(dá)胚珠(圖1(h))。

(a)～(d)分別為有髯鳶尾‘1601’×鳶尾雜交授粉后4、6、12和48 h;(e)～(h)分別為鳶尾×有髯鳶尾雜交授粉后6、12、24和48 h。(a)-(d) are bearded iris ‘1601’×I. tectorum at 4,6,12 and 48 h after pollination,respectively;(e)-(h) are I. tectorum×bearded iris ‘1601’ at 6,12,24 and 48 h after pollination,respectively.

以有髯鳶尾為母本的組合花粉于授粉后2～4 h萌發(fā),萌發(fā)時(shí)間比反交組合早,但花粉管前期生長速度相較而言較慢,2個(gè)組合授粉后48 h均有少量花粉管到達(dá)胚珠。二者均存在一定受精前障礙,分別在授粉后2～4與4～6 h出現(xiàn),表現(xiàn)為花粉管異常行為和胼胝質(zhì)反應(yīng)。

2.1.2有髯鳶尾與西伯利亞鳶尾正反交組合花粉萌發(fā)與花粉管生長狀況分析

以有髯鳶尾為母本,與西伯利亞鳶尾雜交后2 h,部分花粉粒萌發(fā),花粉管在柱頭表面彎折(圖2(a));授粉后6 h,花粉管伸長至柱頭三分之一,柱頭上可見明顯胼胝質(zhì)現(xiàn)象(圖2(b));授粉后12 h,花粉管伸長至柱頭底部,但花粉管曲折明顯(圖2(c));授粉后48 h,未見花粉管伸入胚珠(圖2(d))。以西伯利亞鳶尾為母本,與有髯鳶尾雜交后2 h花粉粒萌發(fā),花粉管伸長并在柱頭表面彎折纏繞(圖2(e));授粉后12 h,花粉管伸長至柱頭二分之一處,并出現(xiàn)反向生長現(xiàn)象(圖2(f));授粉后24 h,花粉管到達(dá)柱頭底部,花粉管通道內(nèi)胼胝質(zhì)反應(yīng)明顯(圖2(g));授粉后48 h,花粉管到達(dá)胚珠(圖2(h))。

(a)～(d)分別為有髯鳶尾×西伯利亞鳶尾雜交授粉后2、6、12和48 h;(e)～(h)分別為西伯利亞鳶尾×有髯鳶尾雜交授粉后2、12、24和48 h。(a)-(d) are bearded iris×I. sibirica at 2,6,12 and 48 h after pollination,respectively;(e)-(h) are I. sibirica×bearded iris at 2,12,24 and 48 h after pollination,respectively.

2個(gè)組合花粉均于授粉后2 h萌發(fā),有髯鳶尾為母本的組合花粉管前期生長較其反交組合快,授粉后48 h僅觀察到西伯利亞鳶尾為母本的組合花粉管與胚珠結(jié)合。二者合子前障礙明顯,前者主要表現(xiàn)為花粉萌發(fā)率低、胼胝質(zhì)反應(yīng)及花粉管異常行為、生長停滯,后者主要表現(xiàn)為明顯胼胝質(zhì)反應(yīng)及花粉管異常行為。

2.2 不同有髯鳶尾遠(yuǎn)緣雜交組合果實(shí)發(fā)育動(dòng)態(tài)觀測

有髯鳶尾與鳶尾雜交組合中,以有髯鳶尾為母本時(shí),膨大子房在授粉后3～12 d生長較快,12 d后生長速度變緩,21 d后子房停止生長,部分子房外壁發(fā)黃,下部皺縮;以鳶尾為母本時(shí),子房在授粉后3～15 d生長迅速,24 d后子房停止生長(圖3)。有髯鳶尾與西伯利亞鳶尾雜交組合中,以有髯鳶尾為母本時(shí),子房生長速度緩慢,在授粉6 d后停止生長,枯黃衰亡;以西伯利亞鳶尾為母本時(shí),觀察到子房在12 d后發(fā)黃脫落(圖3)。

圖3 有髯鳶尾系間不同雜交組合后代果實(shí)發(fā)育情況統(tǒng)計(jì)Fig.3 Statistics on fruit development of the offspring of different interseries crosses hybrids of Bearded iris

4個(gè)雜交組合中,以有髯鳶尾和鳶尾為親本的組合子房發(fā)育狀態(tài)較好,至24 d后停止發(fā)育,并出現(xiàn)大規(guī)模敗育(圖4);以有髯鳶尾和西伯利亞為親本的組合子房發(fā)育較差,早期出現(xiàn)敗育。

圖4 有髯鳶尾與鳶尾雜交后胚珠敗育Fig.4 Ovule abortion after crossing Bearded iris with I. tectorum

2.3 有髯鳶尾系間遠(yuǎn)緣雜交組合坐果率

有髯鳶尾與鳶尾正反交組合坐果率為36.41%～42.35%,有髯鳶尾與西伯利亞鳶尾正反交組合坐果率為1.81%～10.35%,前者坐果率高于后者。2個(gè)不同類型的系間雜交所有組合中,有髯鳶尾作父本時(shí)坐果率均高于其反交組合(表1)。

表1 有髯鳶尾系間遠(yuǎn)緣雜交組合坐果率統(tǒng)計(jì)Table 1 Fruit setting rate statistics of distant hybridization combinations in interseries crosses in bearded iris

2.4 胚拯救

將胚珠接種至MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后,有髯鳶尾×鳶尾雜交組合有5個(gè)胚珠萌發(fā),鳶尾×有髯鳶尾雜交組合有3個(gè)胚珠萌發(fā);繼續(xù)培養(yǎng)30 d獲得有髯鳶尾×鳶尾組培苗;鳶尾×有髯鳶尾愈傷組織仍保持綠色。在MS+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基中,西伯利亞鳶尾×有髯鳶尾和鳶尾×有髯鳶尾組合有淺黃色愈傷組織生成,并繼續(xù)誘導(dǎo)形成組培苗。

3 討論與結(jié)論

鳶尾種間雜交中花粉及花粉管不親和行為包括花粉附著困難、萌發(fā)率低、花粉管的異常行為和胼胝質(zhì)反應(yīng)[10-12]。有髯鳶尾與鳶尾、西伯利亞鳶尾系間遠(yuǎn)緣雜交組合中,除有髯鳶尾×西伯利亞鳶尾外,其余組合花粉管均可進(jìn)入胚珠且均能坐果,說明各組合均能完成受精作用并生長發(fā)育,證明有髯鳶尾與飾冠鳶尾系間雜交及西伯利亞鳶尾×有髯鳶尾存在一定合子前障礙,但不是系間遠(yuǎn)緣雜交的關(guān)鍵障礙。熒光觀察中有髯鳶尾×西伯利亞鳶尾花粉管未進(jìn)入胚珠,且477個(gè)雜交個(gè)體里僅3個(gè)坐果,說明二者合子前障礙明顯,可嘗試通過提前授粉[10,13]和混合花粉授粉[14]等方式克服。

親緣關(guān)系與系間雜交親和性密切相關(guān)。有髯鳶尾與鳶尾正反交坐果率分別為36.41%和42.35%,有髯鳶尾與西伯利亞鳶尾其正反交組合坐果率較低,分別為1.81%和10.35%。子房動(dòng)態(tài)觀測表明,有髯鳶尾與西伯利亞鳶尾雜交組合子房在授粉后早期敗育。因此,有髯鳶尾與西伯利亞鳶尾遠(yuǎn)緣雜交受精后障礙更明顯且發(fā)生的時(shí)期早。有研究表明,雜交親本親緣關(guān)系越近,雜交成功可能性越大[2]。有髯鳶尾與西伯利亞鳶尾遺傳關(guān)系較與鳶尾遠(yuǎn),與受精后胚胎發(fā)育早期停止密切相關(guān)。

胚拯救可克服遠(yuǎn)緣雜交受精后障礙,獲得遠(yuǎn)緣雜交的植株。利用胚拯救技術(shù)可獲得鳶尾屬遠(yuǎn)緣雜交后代,如對(duì)燕子花(IrisleavigataFisch.)×玉蟬花(IrisensataThunb.)授粉后60 d的胚珠進(jìn)行胚珠培養(yǎng),成功獲得雜種后代[15];對(duì)黃菖蒲×喜鹽鳶尾子房進(jìn)行培養(yǎng),獲得膨大的胚珠并發(fā)育成種子[11]。動(dòng)態(tài)觀測果實(shí)發(fā)育,可從形態(tài)上判斷胚珠敗育時(shí)期,以確定胚拯救時(shí)期[16]。有髯鳶尾×鳶尾、鳶尾×有髯鳶尾和西伯利亞鳶尾×有髯鳶尾最佳胚拯救時(shí)期分別為授粉21、24和12 d后。

有髯鳶尾與鳶尾、西伯利亞類鳶尾進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交,表明有髯鳶尾系間遠(yuǎn)緣雜交親和性與親緣關(guān)系呈正相關(guān)。胚拯救技術(shù)有助于獲得有髯鳶尾系間遠(yuǎn)緣雜交后代,從果實(shí)發(fā)育過程判斷胚珠敗育時(shí)期,尚需從胚胎學(xué)角度進(jìn)一步研究。經(jīng)嚴(yán)格人工授粉和套袋雜交獲得有髯鳶尾系間遠(yuǎn)緣雜交后代,仍需進(jìn)行核型分析進(jìn)一步鑒定,為有髯鳶尾育種開拓新領(lǐng)域。