基于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白探討黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠的腎功能保護(hù)作用及機(jī)制*

李進(jìn)冬，高 一，李智勤，花慧蓮△

（1. 江蘇省泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300； 2. 江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004； 3. 南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院，江蘇 連云港 222000）

糖尿?。―M）晚期最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥糖尿病腎?。―N）是導(dǎo)致腎功能衰竭的主要原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。腎小管間質(zhì)纖維化（RIF）幾乎是所有慢性腎臟病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑［2］，涉及成纖維細(xì)胞增殖與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過(guò)度沉積，膠原纖維合成增多是RIF 最顯著的特征。導(dǎo)致DN 發(fā)生與發(fā)展的主要因素為長(zhǎng)期慢性高血糖、晚期糖基化終產(chǎn)物、生長(zhǎng)因子及喂乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路等，而長(zhǎng)期高血糖是DN發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素，mTOR 信號(hào)通路參與了ECM 的沉積及腎小管間質(zhì)的纖維化［3-4］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）過(guò)度表達(dá)、mTOR過(guò)度激活是基質(zhì)蛋白生成增加和降解減少的主要原因。臨床防治DN 主要強(qiáng)調(diào)維持血糖及血壓穩(wěn)定的重要性［5］，并無(wú)專(zhuān)門(mén)針對(duì)DN 發(fā)病靶點(diǎn)的干預(yù)而設(shè)計(jì)的藥物。黃芩苷是從黃芩中提取的一種黃酮類(lèi)化合物，具有抗菌、利尿、消炎和抗感染等藥理作用，可改善DM 患者的腎功能［6］。故本研究中基于TGF - β1/mTOR 探討了黃芩苷對(duì)DM 模型大鼠的作用及其機(jī)制，為臨床早期防治DN提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：BX43F型顯微鏡（日本Olympus公司）；Odyssey Sa型紅外激光成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-cor公司）。

試藥：黃芩苷（純度＞98%）、鏈脲佐菌素（STZ），均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；TGF - β1、mTOR 抗體（英國(guó)Abcam 公司）；肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）試劑盒（長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)公司）；TGF-β1試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；尿蛋白定量試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA），均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

動(dòng)物：30 只SD 雄性大鼠（體質(zhì)量180～200 g）購(gòu)于斯貝福（蘇州）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（蘇）2022-0006，飼養(yǎng)于江蘇瀚江生物科技有限公司屏障系統(tǒng)內(nèi)，恒溫（22～26 ℃）、恒濕（相對(duì)濕度40%～60%）環(huán)境喂養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)江蘇瀚江生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有操作均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范》。

1.2 方法

造模、分組及給藥：將30只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組）、模型對(duì)照組（B組）、黃芩苷組（C組），各10只。除A 組外，B組和C組大鼠一次性腹腔注射STZ（臨用前溶于pH 4.4的0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中）30 mg/kg。注射72 h 后，尾靜脈采血，測(cè)定空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG ＞13.9 mmol/ L 即為造模成功。C 組大鼠灌胃30 mg/ kg黃芩苷，A 組和B 組大鼠灌胃等量1%羧甲纖維素鈉（CMC-Na）溶液，均每日1次，連續(xù)14周。

血糖、腎質(zhì)量指數(shù)及體質(zhì)量測(cè)定：干預(yù)14 周后，經(jīng)尾靜脈采血測(cè)FBG；稱(chēng)定體質(zhì)量，處死大鼠；剖開(kāi)大鼠腹腔，取出腎臟，去除包膜，冰生理鹽水沖洗后用濾紙吸干，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算腎臟質(zhì)量指數(shù)（兩腎質(zhì)量/ 體質(zhì)量，mg/g），去除腎髓質(zhì)，取1/4 腎組織置4%多聚甲醛中固定，備用。

腎功能測(cè)定：收集大鼠24 h 尿液，按試劑盒步驟，測(cè)定Cr、BUN、24 h尿蛋白定量。

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)：取新鮮腎組織，按組織-冰生理鹽水（1∶9，g/mL）勻漿后離心，取上清液，按試劑盒步驟測(cè)定SOD及MDA含量。

腎組織病理染色：取固定腎組織，脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟后分別采用蘇木精-伊紅（HE）、馬松（Masson）、天狼星紅（Sirius Red）染色，光鏡下觀(guān)察形態(tài)變化，Masson染色膠原纖維呈藍(lán)綠色，天狼星紅染色膠原纖維呈紅色。采用Image-pro plus 6.0軟件進(jìn)行定量分析。

免疫組化法檢測(cè)腎組織中層粘連蛋白（LN）含量：腎組織用石蠟包埋，切片，采用免疫組化法檢測(cè)LN 含量。按試劑盒步驟染色，光鏡下觀(guān)察，采用Image - pro plus 6.0軟件測(cè)量棕色陽(yáng)性區(qū)占觀(guān)察視野的面積比。

免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)腎組織中TGF - β1及mTOR蛋白表達(dá)水平：取腎組織20～30 mg，加入200 μL裂解液，充分勻漿混勻，冰上裂解30 min，每隔10 min渦旋1次，4 ℃、12 000g離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移至EP管，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。按步驟配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，4 ℃封閉1 h，加一抗孵育，4 ℃過(guò)夜，洗滌，加熒光二抗（1∶1 000），孵育1 h 后洗滌，將干燥后的條帶置紅外成像系統(tǒng)，拍照。采用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料用±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FBG、體質(zhì)量與腎臟質(zhì)量指數(shù)

與A 組比較，B 組大鼠的FBG 和腎臟質(zhì)量指數(shù)均顯著升高（P＜0.01），體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01）。與B 組比較，C 組大鼠FBG 和腎臟質(zhì)量指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠FBG、體質(zhì)量與腎臟質(zhì)量指數(shù)的影響（X±s，n=6）Tab.1 Effect of baicalin on FBG，body mass and renal mass index in DM rats（±s，n=6）

表1 黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠FBG、體質(zhì)量與腎臟質(zhì)量指數(shù)的影響（X±s，n=6）Tab.1 Effect of baicalin on FBG，body mass and renal mass index in DM rats（±s，n=6）

注：與A 組比較，*P ＜0.01；與B 組比較，#P ＜0.05。圖1 至圖5同。Note：Compared with those in group A，*P ＜0.01；Compared with those in group B，#P ＜0.05（for Tab.1，F(xiàn)ig.1 and Fig.5）.

組別A組B組C組FBG（mmol/L）8.21±2.36 26.02±3.56*19.34±1.86#體質(zhì)量（g）301.73±20.78 157.52±22.84*186.25±23.84腎臟質(zhì)量指數(shù)（mg/g）8.75±1.07 18.07±3.62*13.52±2.10#

2.2 24 h 尿蛋白定量、BUN 與Cr 水平

與A 組比較，B 組大鼠24 h 尿蛋白定量及BUN，Cr水平均顯著升高（P＜0.01）；與B組比較，C組大鼠以上指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖1。

注：與B組比較，##P ＜0.01。圖2至圖5同。圖1 黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠24 h尿蛋白定量、BUN與Cr水平的影響Note：Compared with those in group B，##P ＜0.01（for Tab.1 - 5）.Fig.1 Effect of baicalin on 24 h urinary protein content，BUN and Cr levels in DM rats

2.3 腎組織中SOD 與MDA 含量

與A 組比較，B 組大鼠腎組織中SOD 含量顯著降低，MDA 含量顯著升高（P＜0.01）；與B 組比較，C 組大鼠腎組織中SOD 含量顯著升高（P＜0.01），MDA 含量顯著降低（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖2。

圖2 黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠腎組織SOD與MDA含量的影響Fig.2 Effect of baicalin on the SOD and MDA content in the renal tissue of DM rats

2.4 腎組織纖維化程度

A 組大鼠腎組織可見(jiàn)少量膠原纖維沉積。與A 組比較，B 組大鼠腎小球毛細(xì)血管腔變窄，系膜區(qū)外基質(zhì)沉積和膠原沉積均顯著增加（P＜0.01）；與B 組比較，C 組大鼠腎組織纖維化程度顯著減輕（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖3。

圖3 黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠腎組織纖維化的影響（×400）Fig.3 Effect of baicalin on renal fibrosis in DM rats（×400）

2.5 腎組織LN 表達(dá)水平

與A 組比較，B 組大鼠腎組織LN 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與B 組比較，C 組大鼠腎組織LN 水平顯著降低（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖4。

圖4 黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠腎組織LN表達(dá)水平的影響（×400）Fig.4 Effect of baicalin on LN expression levels in the renal tissue of DM rats（×400）

2.6 腎組織TGF-β1 與mTOR 蛋白表達(dá)水平

與A 組比較，B 組大鼠腎組織TGF-β1及mTOR 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與B組比較，C組大鼠腎組織TGF - β1及mTOR 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖5。

圖5 黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠腎組織TGF-β1與mTOR蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of baicalin on TGF-β1 and mTOR protein expression levels in the kidney tissue of rats

3 討論

DM 為常見(jiàn)慢性代謝性疾病，以血糖持續(xù)性升高為特征，可使機(jī)體血管和神經(jīng)受累，在相應(yīng)部位出現(xiàn)病變，最終出現(xiàn)威脅生命的嚴(yán)重并發(fā)癥。DN 是DM 微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎?。‥SRD）的重要原因［7］。DN 的病理變化主要包括腎小球肥大、基底膜增厚、ECM 積聚、腎臟纖維化等［8-9］，其中系膜細(xì)胞異常增殖的主要原因?yàn)檠趸瘧?yīng)激，線(xiàn)粒體是系膜細(xì)胞中氧化應(yīng)激的主要來(lái)源［10］。高血糖是DN 發(fā)生與發(fā)展的始動(dòng)因素，可誘發(fā)腎小管肌成纖維細(xì)胞激活，從而分泌大量ECM，如Ⅳ型膠原蛋白（COL Ⅳ）、纖維連接蛋白（FN）等，在腎間質(zhì)中積聚，最終影響腎功能［11］。臨床研究顯示，黃芩苷對(duì)DM 早期腎臟病變有一定療效［6，12］，但具體機(jī)制尚未闡明。

TGF-β1是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化的多肽因子，能刺激腎小球肥大，能通過(guò)Smad 通路依賴(lài)和非依賴(lài)途徑調(diào)節(jié)ECM 的合成與降解［13］。DN 狀態(tài)下，mTOR 通路激活后刺激腎小球和腎小管肥大［14］，損傷足細(xì)胞，引起腎小球?yàn)V過(guò)率下降。同時(shí)，TGF - β1參與RIF，活化的mTOR 途徑可增加促纖維化細(xì)胞因子，如TGF-β1及其表達(dá)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子，且導(dǎo)致DM 患者的RIF［15］。本研究中對(duì)TGF- β1及mTOR 靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，與B 組比較，C 組大鼠FBG、腎臟質(zhì)量指數(shù)、24 h 尿蛋白定量及Cr，BUN，MDA，LN 水平均顯著降低，SOD 含量顯著升高（P＜0.05），腎組織纖維化程度顯著減輕（P＜0.05），TGF - β1及mTOR 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），表明經(jīng)黃芩苷干預(yù)后，大鼠腎功能趨于穩(wěn)定，腎組織纖維化程度減輕，腎組織氧化應(yīng)激水平降低，通過(guò)抑制TGF-β1及mTOR 在腎臟的過(guò)表達(dá)減少了膠原蛋白的沉積，從而延緩了DN的進(jìn)展。

綜上所述，黃芩苷可抑制DM 模型大鼠腎臟ECM積聚，降低氧化應(yīng)激水平，延緩DN 進(jìn)展，其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。