lncRNA-MALAT1表達與TSCC臨床病理特征及預后的關(guān)系研究*

夏章暉,付小紅,榮 剛△

1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院口腔科,湖北武漢 430077;2.武漢市第一醫(yī)院口腔科,湖北武漢 430077

舌鱗狀細胞癌(TSCC)屬于頭頸部鱗狀細胞癌的特殊亞型,與飲酒、吸煙、嚼檳榔和人乳頭瘤病毒感染高度相關(guān),手術(shù)切除是早期TSCC的首選治療方案,但TSCC侵襲性較強且極容易發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,復發(fā)率高,預后較差,多數(shù)患者5年生存率不足50%[1]。不具有蛋白質(zhì)編碼功能的長鏈非編碼核糖核酸(lncRNA)在細胞代謝、增殖凋亡、侵襲等多種細胞生物學過程中發(fā)揮著重要作用,越來越多的證據(jù)表明lncRNA不僅可調(diào)節(jié)癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,還可調(diào)節(jié)癌細胞代謝重編程和代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯,在癌癥發(fā)生和發(fā)展中充當癌基因或腫瘤抑制因子,發(fā)揮著復雜而精確的調(diào)節(jié)作用[2]。轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)是一種新型的lncRNA,定位于細胞核,其3′末端可被加工產(chǎn)生類似轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)的細胞質(zhì)RNA,參與促使腫瘤微環(huán)境、癌細胞增殖分化、癌癥代謝重編程和線粒體功能調(diào)節(jié)過程,與肺腺癌、子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤、肝細胞癌等多種實體腫瘤的發(fā)生、進展和對治療的反應密切相關(guān)[3-4]。lncRNA-MALAT1與TSCC的關(guān)系尚不明確,相關(guān)報道較少。本研究擬檢測TSCC組織中l(wèi)ncRNA-MALAT1的表達,分析其與TSCC臨床特征以及預后的關(guān)系,以期為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年1月至2020年1月華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院收治的80例TSCC患者納入研究。其中,男45例,女35例;年齡49～72歲,平均(65.35±6.79)歲;腫瘤直徑1～3 cm,平均(2.01±0.53)cm;分化程度:低中度分化46例,高度分化34例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期51例,Ⅲ期29例;浸潤深度:<2/3 42例,≥2/3 38例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例,手術(shù)切緣陽性18例。納入標準:(1)經(jīng)術(shù)后病理或診斷性全內(nèi)窺鏡檢查確診為TSCC;(2)術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療;(3)年齡18周歲以上,術(shù)后定期接受電話隨訪和門診復查,隨訪和臨床資料完整。排除標準:(1)有惡性腫瘤病史;(2)術(shù)前發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移;(3)舌良性腫瘤。TNM分期參考第7版美國癌癥分期聯(lián)合委員會(AJCC)腫瘤分期標準,本研究已經(jīng)獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準?；颊呋蚣覍賹Ρ狙芯恐橥獠⒑炇鹬橥鈺?。

1.2方法

1.2.1lncRNA-MALAT1表達水平檢測 取手術(shù)切除的癌組織和癌旁組織(距癌5 cm以上)標本各0.2 g,研磨,采用Wizard?SV Genomic DNA Purification組織DNA提取試劑盒(美國Promega生物公司)按照說明書流程提取組織RNA,Multiskan SkyHigh全波長酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)檢測總RNA的純度、濃度和完整性,選擇吸光度值A(chǔ)260/A280在1.8～2.0之間的RNA,采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司)將其轉(zhuǎn)錄為cDNA。CFX96實時熒光PCR儀(美國Bio-Rad公司)和PrimeScript RT Master Mix 試劑盒(日本Takara公司)檢測lncRNA-MALAT1相對表達水平。PCR反應體系:cDNA 1 μL,上游和下游引物各 0.4 μL,2×SYBR-Green Super Mix 10 μL,M5 HiPure ROX Reference Dye(50×)0.4 μL,添加ddH2O至20 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火延伸20 s,共40個循環(huán)。引物序列:lncRNA-MALAT1,上游,5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′,下游,5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3′,GAPDH上游,5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游,5′-GAAGATGGGTGATGGGAT TTC-3′。以GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt計算lncRNA-MALAT1相對表達水平。每個樣品設(shè)3個重復孔。

1.2.2隨訪 患者出院后均由主治醫(yī)師進行定期電話隨訪(每3個月一次)和門診復查,門診復查內(nèi)容包括血常規(guī)、腫瘤標志物以及口腔CT、X線片、全身骨的放射性核素顯像等,隨訪截止至2022年7月。計算隨訪期間總生存率和無進展生存率。無進展生存時間定義為自病理確診到腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移或全因死亡或隨訪結(jié)束時間,總生存時間為自病理確診到全因死亡或隨訪結(jié)束時間。

2 結(jié) 果

2.1TSCC組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA-MALAT1表達水平比較 TSCC組織中l(wèi)ncRNA-MALAT1表達水平為(3.69±1.24),癌旁組織中l(wèi)ncRNA-MALAT1表達水平位(1.49±0.43),TSCC組織的lncRNA-MALAT1表達水平高于癌旁組織(t=14.993,P<0.05)。

2.2不同病理特征TSCC組織lncRNA-MALAT1表達水平比較 低中度分化、TNM分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度≥2/3的TSCC患者癌組織中l(wèi)ncRNA-MALAT1水平分別高于高度分化、TNM Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度<2/3的TSCC患者(P<0.05)。不同年齡、性別、腫瘤直徑、手術(shù)切緣TSCC患者癌組織中l(wèi)ncRNA-MALAT1表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

表1 不同臨床病理特征的患者TSCC癌組織lncRNA-MALAT1表達水平比較

2.3TSCC患者生存曲線 中位隨訪41(30～54)個月,隨訪期間死亡48例,復發(fā)7例,遠處轉(zhuǎn)移6例。lncRNA-MALAT1高表達(lncRNA-MALAT1≥3.65,42例)TSCC患者總生存率為19.05%(8/42),低于lncRNA-MALAT1低表達(lncRNA-MALAT1<3.65,38例)TSCC患者的63.16%(24/38),差異有統(tǒng)計學意義(Log-Rankχ2=16.270,P<0.05),見圖1。lncRNA-MALAT1高表達TSCC患者無進展生存率為4.76%(2/42),低于lncRNA-MALAT1低表達TSCC患者的44.74%(17/38),差異有統(tǒng)計學意義(Log-Rankχ2=19.700,P<0.05),見圖2。

圖1 不同lncRNA-MALAT1表達水平TSCC患者總生存曲線

2.4影響TSCC患者預后的COX風險比例回歸分析 以TSCC患者生存情況為因變量(0=存活,1=死亡),納入年齡(0為<60歲,1為≥60歲)、腫瘤直徑(0為≤2 cm,1為>2 cm)、分化程度(0=高度分化,1=低中度分化)、TNM分期(0=Ⅰ～Ⅱ期,1=Ⅲ期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(0=否,1=是)、浸潤深度(0為<2/3,1為≥2/3)、手術(shù)切緣(0=陰性,1=陽性)、lncRNA-MALAT1(0=低表達,1=高表達)為自變量。單因素COX風險比例回歸分析結(jié)果顯示,低中度分化、TNM Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度≥2/3、lncRNA-MALAT1高表達與TSCC患者死亡有關(guān)(P<0.05),見表2。構(gòu)建多因素COX風險比例回歸模型,納入單因素中差異有統(tǒng)計學意義的變量,向后逐步法篩選變量,最終得到TNM Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA-MALAT1高表達是TSCC患者死亡的危險因素(P<0.05),見表3。

表2 影響TSCC患者生存的單因素COX風險比例回歸模型

表3 影響TSCC患者生存的多因素COX風險比例回歸模型

3 討 論

TSCC是最常見的口腔癌,具有高增殖和轉(zhuǎn)移特性,通?？蓪е卵哉Z、吞咽和咀嚼功能障礙,盡管近年來手術(shù)、化療和放療等綜合治療取得了較大的進展,但TSCC的預后仍較差。探討TSCC相關(guān)的分子標志物可為TSCC治療和預后預測提供重要參考和指導[5-6]。已知lncRNA參與細胞生物學過程,如細胞增殖和凋亡、細胞分化、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)等,據(jù)統(tǒng)計約60%的口腔癌前病變患者中可檢測lncRNA異常表達,lncRNA改變可導致與疾病和生物學功能相關(guān)基因的多種異常表達,與腫瘤發(fā)生和進展有關(guān)[7]。MALAT1也被稱為核富集轉(zhuǎn)錄本2,是一種高度保守的lncRNA,位于11q13,在正常組織中廣泛表達,lncRNA-MALAT1通過與雙鏈DNA相互作用并抑制基因轉(zhuǎn)錄,作為內(nèi)含子siRNA與mRNA結(jié)合并抑制mRNA翻譯,或者產(chǎn)生可變剪接lncRNA調(diào)節(jié)基因表達等機制參與對靶基因的直接調(diào)控,具有廣泛的生物學效應,報道顯示lncRNA-MALAT1可通過靶向miR-34c,促使富含AT序列特異性結(jié)合蛋白2表達上調(diào),增強成骨細胞活性,減輕骨質(zhì)疏松癥[8],lncRNA-MALAT1通過直接與細胞核中的反式反應DNA結(jié)合蛋白結(jié)合并阻止其活化,促進抗病毒干擾素的產(chǎn)生,減輕病毒負荷[9],lncRNA-MALAT1還可通過調(diào)節(jié)Zeste 增強子同源物2(EZH2)介導的表觀遺傳抑制核因子-E2相關(guān)因子2表達,導致活性氧產(chǎn)生和炎癥小體激活,促進神經(jīng)炎癥[10]。在惡性腫瘤發(fā)展和進展中,lncRNA-MALAT1參與絲裂原激活的蛋白激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B、WNT/β-catenin和核轉(zhuǎn)錄因子-κB等多種分子信號通路的調(diào)節(jié),導致癌細胞增殖、細胞周期改變、遷移、侵襲和血管生成等過程,與腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度和癌癥分期等臨床病理學特征有關(guān),越來越多的證據(jù)表明,lncRNA-MALAT1在腫瘤組織和/或體液中的異常表達,可作為腫瘤診斷和預后的生物標志物[11]。

報道顯示lncRNA-MALAT1在乳腺癌組織中表達上調(diào),lncRNA-MALAT1通過靶向其下游靶標miR-570-3p促使癌細胞增殖、遷移和侵襲[12],lncRNA-MALAT1通過誘導磷酸化-P38/磷酸化-核轉(zhuǎn)錄因子-κB/環(huán)氧合酶-2/前列腺素 E2信號傳導誘發(fā)腫瘤微環(huán)境中炎癥反應,促使上皮性卵巢癌細胞增殖和侵襲[13]。MALAT1還是一種線粒體相關(guān)lncRNA,可通過RNA轉(zhuǎn)運蛋白途徑進入線粒體來調(diào)節(jié)線粒體基因表達和線粒體功能,還可能通過充當誘餌、支架、競爭性內(nèi)源性 RNA等導致癌癥代謝重編程,促進能量代謝和癌癥發(fā)生和進展[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA-MALAT1在TSCC組織中表達上調(diào),lncRNA-MALAT1過表達與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度的臨床病理特征有關(guān),COX風險比例回歸分析提示lncRNA-MALAT1高表達是TSCC預后不良的危險因素,表明lncRNA-MALAT1在TSCC中發(fā)揮癌基因作用,這與其他惡性腫瘤中l(wèi)ncRNA-MALAT1的相關(guān)研究報道結(jié)果相同[13]。lncRNA-MALAT1可能通過以下機制參與TSCC發(fā)病:首先,lncRNA-MALAT1通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路、上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達促使TSCC細胞的增殖、遷移和侵襲[15]。其次,miR-140-5p可抑制TSCC細胞遷移和侵襲,是一種腫瘤相關(guān)的抑癌基因,lncRNA-MALAT1含有miR-140-5p的結(jié)合序列,通過靶向抑制miR-140-5p表達下調(diào)其下游靶標P21活化激酶的表達,促使TSCC細胞增殖、遷移和侵襲[16],第三,富含脯氨酸的小蛋白構(gòu)成角化細胞包膜前體,與上皮細胞惡變、增殖和侵襲有關(guān),富含脯氨酸的小蛋白在TSCC細胞中過表達可增加局部腫瘤的侵襲性,促進癌細胞轉(zhuǎn)移,lncRNA-MALAT1可通過上調(diào)富含脯氨酸的小蛋白表達,進而導致TSCC生長和轉(zhuǎn)移[17]。多因素回歸分析顯示,TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與TSCC預后不良也存在密切關(guān)系,分析原因為TNM晚分期提示腫瘤直徑增加、浸潤加深以及鄰近組織侵襲,TNM分期越晚患者預后越差。相關(guān)報道也指出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與TSCC惡性病理行為有關(guān),是TSCC患者5年存活率低下的危險因素[18]。

綜上所述,TSCC組織中l(wèi)ncRNA-MALAT1表達顯著上調(diào),lncRNA-MALAT1高表達與TSCC患者高TNM分期、低中度分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、深度浸潤以及隨訪期間死亡有關(guān)。lncRNA-MALAT1可作為TSCC的潛在標志物,為臨床治療提供新的靶點和思路。本研究也存在不足之處,納入研究的例數(shù)偏少,lncRNA-MALAT1參與TSCC的潛在機制尚待進一步研究證實。