基于高通量測(cè)序分析多巴胺受體DRD5缺失小鼠腸道菌群的變化*

劉 璐,吳昱青

1.南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系,江蘇南京 211100;2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部,江蘇南京 210029;3.國(guó)家醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心,江蘇南京 210029

腸道菌群是定植在腸道內(nèi)復(fù)雜且豐富的微生物群落。研究表明,腸道菌群在生物體內(nèi)的新陳代謝、免疫系統(tǒng)發(fā)育、炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用,腸道菌群的紊亂與消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。目前研究發(fā)現(xiàn)帕金森患者腸道菌群紊亂并伴隨有腸道功能異常的出現(xiàn)[3],多巴胺的水平及其受體表達(dá)的異常與帕金森病的發(fā)生密切相關(guān)[4]。小鼠腸腔內(nèi)含有由腸道多巴胺能神經(jīng)元分泌產(chǎn)生的高濃度的多巴胺[5],多巴胺可通過(guò)多巴胺受體調(diào)控胃腸道功能,胃腸道中多巴胺水平的下降也可導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡[6],而多巴胺受體DRD5在腸道微生物穩(wěn)態(tài)中扮演的角色并不十分明確。本研究擬采用高通量測(cè)序分析DRD5缺失小鼠糞便樣本的腸道菌群變化,探討DRD5在腸道微生態(tài)調(diào)控中的作用,以期為臨床診斷和治療腸道菌群紊亂提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5只野生型無(wú)特定病原體級(jí)(SPF級(jí))C57BL/6J小鼠作為對(duì)照組(購(gòu)于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。5只DRD5敲除小鼠作為對(duì)照組(購(gòu)于廣州賽業(yè)生物科技有限公司)。兩組小鼠均飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施合格證號(hào)為SYXK(蘇)2021-0023。光暗每日各半,室溫控制在(23±2)℃,相對(duì)濕度45%～70%。本研究已通過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查(批準(zhǔn)編號(hào):1707029)。

1.2方法

1.2.1小鼠糞便標(biāo)本及腸道組織的收集 糞便標(biāo)本的采集采取立取、立存(取樣后立即保存)原則,用無(wú)菌1.5 mL EP管收集飼養(yǎng)至8周齡的小鼠糞便,取樣前洗手,戴無(wú)菌手套、口罩,連續(xù)收集3次糞便,混勻。標(biāo)本采集后,標(biāo)記好小鼠品系、編號(hào)、采樣日期等。收集同期小鼠腸道組織,進(jìn)行大體觀察,測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度,同時(shí)制備常規(guī)石蠟切片,進(jìn)行HE染色,于鏡下觀察組織形態(tài)。

1.2.2DNA提取 采用糞便DNA組快速提取試劑盒進(jìn)行糞便基因組DNA提取,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,并檢測(cè)DNA濃度。

1.2.3DNA 16S rRNA檢測(cè) 對(duì)16S rRNA的DNA序列進(jìn)行高通量測(cè)序,高通量測(cè)序及測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.4生物信息學(xué)分析 原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控,使用FLASH軟件進(jìn)行拼接。通常將相似度在97%以上的序列聚類(lèi)作為1個(gè)操作分類(lèi)單元(OTU),并在聚類(lèi)過(guò)程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋,比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU123),比對(duì)閾值設(shè)置為70%。

2 結(jié) 果

2.1小鼠腸組織的大體形態(tài)觀察 對(duì)照組小鼠腸組織長(zhǎng)度、大體形態(tài)正常;敲除組小鼠腸組織水腫,長(zhǎng)度縮短,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注:A為對(duì)照組;B為敲除組。

2.2小鼠腸組織的鏡下觀察 結(jié)腸腸壁由內(nèi)至外依次為黏膜層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層和漿膜層。對(duì)照組小鼠腸道組織形態(tài)正常,可見(jiàn)明顯的隱窩和大量杯狀細(xì)胞,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。敲除組小鼠腸道組織結(jié)構(gòu)紊亂,腸道黏膜層輕微增生,有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),見(jiàn)圖2。

注:A為對(duì)照組;B為敲除組;箭頭表示淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3OTU分析 對(duì)照組小鼠和敲除組小鼠共產(chǎn)生OTU 443個(gè),共有OTU 273個(gè),其中對(duì)照組小鼠OUT 326個(gè),敲除組小鼠390個(gè),對(duì)照組小鼠特有OTU為53個(gè),敲除組小鼠特有OTU為117個(gè),明顯高于對(duì)照組小鼠,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),滿足歸類(lèi)分析要求,見(jiàn)圖3。

注:A為對(duì)照組;B為敲除組。

2.4物種及其豐度分析

2.4.1門(mén)分類(lèi)水平比較 門(mén)分類(lèi)水平主要檢測(cè)出10個(gè)菌門(mén),其中兩組小鼠均以擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén),對(duì)照組和敲除組優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的相對(duì)豐度百分比分別為93.06%和95.10%。兩組間優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的相對(duì)豐度比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組小鼠比較,敲除組小鼠中變形菌門(mén)顯著減少,藍(lán)細(xì)菌門(mén)顯著增多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖4。

注:A為對(duì)照組;B為敲除組。

2.4.2屬分類(lèi)水平比較 敲除組小鼠與對(duì)照組小鼠之間羅姆布茨菌屬、真桿菌屬、脫硫弧菌屬、ⅩⅢ_UCG-001屬、胃嗜氣科菌屬、Rs-E47_termite屬、雙歧桿菌屬、ASF356屬、布勞特菌屬、毛螺菌屬豐度比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但除毛螺菌屬外,其他菌屬相對(duì)豐度都很低。相對(duì)豐度居于前5位的分別為擬桿菌屬、梭菌屬、丹毒絲菌屬、毛螺菌屬和彎曲菌屬,見(jiàn)圖5。

注:A為對(duì)照組;B為敲除組。

2.5差異細(xì)菌種類(lèi) 對(duì)照組小鼠腸道菌群中彎曲菌、脫硫弧菌、紅螺菌、伯克菌以及疣微菌相對(duì)豐度較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而敲除組小鼠中顫螺菌和柔膜菌的相對(duì)豐度較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖6。

注:A為對(duì)照組;B為敲除組。

3 討 論

多巴胺又名3,4-二羥基苯乙胺,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì),負(fù)責(zé)機(jī)體的重要功能,包括情緒、認(rèn)知、行為、運(yùn)動(dòng)控制、心血管功能和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等,其缺失可導(dǎo)致帕金森病的發(fā)生[7]。多巴胺主要通過(guò)其受體發(fā)揮生物學(xué)功能,多巴胺受體包括D1類(lèi)受體和D2類(lèi)受體:D1類(lèi)受體包括DRD1和DRD5,D2類(lèi)受體包括DRD2、DRD3和DRD4[8]。目前針對(duì)多巴胺-DRD5信號(hào)的研究主要集中在其對(duì)炎癥和腫瘤等疾病的調(diào)控作用。

腸道菌群是定植在腸道內(nèi)的龐大微生物群落。腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致微生物豐度、微生物構(gòu)成和微生物代謝產(chǎn)物等發(fā)生變化,從而影響腸道或遠(yuǎn)端器官的免疫功能,甚至影響疾病的發(fā)生發(fā)展,如“菌群-腸-腦軸”“菌群-腸-肝軸”的提出說(shuō)明腸道菌群與腦、肝臟等器官及相關(guān)疾病存在密切聯(lián)系[9-10]。隨著微生物分析技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展,如高通量微生物16S rDNA基因測(cè)序技術(shù)極大地豐富了微生物的檢測(cè)手段,腸道菌群的研究進(jìn)入一個(gè)新的階段[11]。本研究通過(guò)檢測(cè)對(duì)照組小鼠和敲除組小鼠腸道菌群的變化,探討DRD5與腸道菌群紊亂的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠和敲除組小鼠OTU數(shù)存在差異。進(jìn)一步菌群差異分析發(fā)現(xiàn),兩組腸道菌群在門(mén)、綱、目、科、屬、種水平存在差異。敲除組小鼠與對(duì)照組小鼠相比,藍(lán)細(xì)菌門(mén)顯著增加,其數(shù)目增多可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病空泡性髓鞘病的發(fā)生[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組小鼠相比,敲除組小鼠中羅姆布茨菌豐度明顯降低。有研究報(bào)道,80%以上的肥胖患者腸道菌群中都存在羅姆布茨菌,提示羅姆布茨菌可能是超重人群中一種普遍的致病菌[13]。對(duì)照組小鼠中真桿菌的豐度顯著高于敲除組小鼠,真桿菌是屬于后壁菌門(mén)、梭菌目、真桿菌科的一類(lèi)革蘭陽(yáng)性菌,是人體腸道的重要組成部分。目前研究認(rèn)為真桿菌可通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸緩解宿主腸道炎癥、2型糖尿病和肥胖等癥狀,而且短鏈脂肪酸中的丁酸可修復(fù)腸道黏膜,抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生[14-15]。脫硫弧菌屬增多是腸息肉和潰瘍性結(jié)腸炎的一個(gè)重要特征[16],本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),DRD5缺失后,脫硫弧菌屬的豐度顯著下降,提示靶向抑制DRD5可降低腸息肉和潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。梭菌家族的ⅩⅢ_UCG-001菌屬相對(duì)豐度與血清總膽固醇、甘油三酯、血清低密度脂蛋白均呈正相關(guān)[17],DRD5缺失小鼠中ⅩⅢ_UCG-001菌屬的相對(duì)豐度均低于對(duì)照組小鼠。報(bào)道指出,在帕金森病患者中Gastranaerophilales菌屬的豐度顯著增加,提示Gastranaerophilales菌屬可能參與了帕金森病的發(fā)病過(guò)程[18]。本研究結(jié)果顯示,DRD5缺失后Gastranaerophilales菌屬的豐度明顯增加,提示DRD5的表達(dá)可影響帕金森病的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示,敲除組小鼠中雙歧桿菌屬豐度明顯降低。雙歧桿菌有助于腸道微生態(tài)平衡,促進(jìn)腸上皮細(xì)胞分泌黏蛋白,促進(jìn)潘氏細(xì)胞分泌sIgA,在腸道局部產(chǎn)生免疫作用,對(duì)全身免疫反應(yīng)也有一定調(diào)節(jié)作用[19]。梭狀芽孢桿菌ASF356的豐度與脂多糖(LPS)水平呈負(fù)相關(guān),而與短鏈脂肪酸呈正相關(guān)[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),敲除組小鼠中梭狀芽孢桿菌ASF356的相對(duì)豐度明顯降低。布勞特菌屬是一種具有抗炎特性的腸道共生菌,腸道中布勞特菌屬的豐度與移植物抗宿主病的病死率降低和總存活率提高有關(guān)[21]。敲除組小鼠中,布勞特菌屬的豐度明顯增加。

本研究初步揭示DRD5缺失小鼠和野生型小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性具有明顯差異,未來(lái)在臨床中可通過(guò)選擇DRD5激動(dòng)劑或抑制劑治療相關(guān)疾病,如DRD5激動(dòng)劑可通過(guò)提高雙歧桿菌的相對(duì)豐度,促進(jìn)腸道微生態(tài)的平衡,治療腸道炎癥。但本研究尚存在一定的局限性:由于16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)的局限性及小鼠樣本量不足,后續(xù)將增大樣本量并采用宏基因測(cè)序技術(shù)找出差異基因,進(jìn)一步探討DRD5影響腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的內(nèi)在機(jī)制,為不同疾病的診治提供依據(jù)。