L-精氨酸快速定量檢測(cè)方法的研究

呂志飛 王松江 郭傳莊 隋松森 李小雙 連 戰(zhàn) 孫瑞成 王建彬

（諸城東曉生物科技有限公司，山東 濰坊 261000）

L-精氨酸是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中一種關(guān)鍵的功能性必需氨基酸[1]，能夠促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫、提高動(dòng)物機(jī)體繁殖性能和生產(chǎn)性能，在促進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)綠色健康發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[2]。L-精氨酸是新生哺乳動(dòng)物和家禽維持最佳生長(zhǎng)的必需氨基酸[3]，動(dòng)物飼糧中添加適量的L-精氨酸能夠降低料重比，提高平均日增重[4-6]。Yao 等[7]研究表明，仔豬飼糧中添加1%精氨酸能夠促進(jìn)小腸吸收營(yíng)養(yǎng)及仔豬腸道的生長(zhǎng)發(fā)育，從而使仔豬生長(zhǎng)性能達(dá)到最佳。L-精氨酸主要通過(guò)“精氨酸酶”和“一氧化氮”兩條途徑調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體免疫平衡[8]，提高免疫力與幼齡動(dòng)物存活率[9]。此外，在飼糧中添加適量L-精氨酸可以有效增強(qiáng)哺乳動(dòng)物的繁殖性能[10]，提高胚胎存活率，調(diào)節(jié)母畜生殖道內(nèi)環(huán)境酸堿度，在不影響受胎率的情況下提高產(chǎn)母犢率[11-12]。L-精氨酸在動(dòng)物生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，對(duì)提高飼料利用率和畜禽產(chǎn)品質(zhì)量、降低養(yǎng)殖成本、提升效益大有裨益。

目前，L-精氨酸多通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。該方法通過(guò)嚴(yán)格控制發(fā)酵周期防止倒酸，保證產(chǎn)酸水平，因此，要求L-精氨酸的含量檢測(cè)必須高效準(zhǔn)確。高效的檢測(cè)方法有助于L-精氨酸穩(wěn)定生產(chǎn)，從而降低飼料中添加L-精氨酸的高昂成本，助力養(yǎng)殖業(yè)降本增效。L-精氨酸檢測(cè)方法主要包括氨基酸分析儀法、液相色譜分析法、酶法與坂口試劑法。氨基酸分析儀維護(hù)成本高，操作要求嚴(yán)格；液相色譜法設(shè)備成本高，檢測(cè)周期長(zhǎng)，僅4 ℃沉降就需要2～3 h[13-14]；酶法需要制備丙酮干粉，制備時(shí)間長(zhǎng)達(dá)40 h，檢測(cè)效率較低[15]。

本研究通過(guò)對(duì)坂口試劑改良法進(jìn)行檢測(cè)參數(shù)優(yōu)化、準(zhǔn)確度驗(yàn)證，保證L-精氨酸檢測(cè)的準(zhǔn)確、高效，以期通過(guò)L-精氨酸的穩(wěn)產(chǎn)降低飼料成本，為L(zhǎng)-精氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

L-精氨酸發(fā)酵液，由諸城東曉生物科技有限公司L-精氨酸生產(chǎn)車間提供。

1.2 試驗(yàn)試劑

L-精氨酸（純度≥99%）購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，雙乙酰（純度≥98%）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；8-羥基喹啉、正丙醇、氫氧化鈉、分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

5804R 高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)艾本德股份公司，PL1502E 電子天平購(gòu)自梅特勒-托利多國(guó)際有限公司，ZWY-110X50 恒溫培養(yǎng)振蕩器購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司；L5S 紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自上海儀電分析儀器有限公司；Spectronic200 可見分光光度計(jì)購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；UV-5500PC紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自上海元析儀器有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀購(gòu)自株式會(huì)社日立制作所。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 顯色液

取5 g 8-羥基喹啉加1%雙乙酰水溶液2.5 mL，使用正丙醇定容至100 mL。

1.4.2 標(biāo)品

稱取1 gL-精氨酸標(biāo)品加去離子水定容至100 mL，得到1%L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用移液管移取1%L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL定容至100 mL，得到0.10 g/L的L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，即為標(biāo)品。

1.4.3 發(fā)酵液前處理

發(fā)酵液離心取上清液，用去離子水稀釋至L-精氨酸含量1%左右，準(zhǔn)確移取1 mL定容至100 mL，即為樣品。

1.4.4L-精氨酸含量測(cè)定步驟

根據(jù)需要準(zhǔn)備10 mL 具塞試管，做好標(biāo)記。準(zhǔn)確移取7 mL 17.1 g/L 氫氧化鈉溶液于每支試管中。分別移取標(biāo)品、樣品和純水（空白）1 mL于對(duì)應(yīng)的試管中，在每支試管中加入2 mL 混合顯色劑，混勻，在30 ℃左右的水浴鍋中放置20 min充分顯色，在520 nm分光光度計(jì)下測(cè)定OD520nm值。

1.4.5L-精氨酸含量的計(jì)算

L-精氨酸(%)=(樣品OD/標(biāo)品OD)×稀釋倍數(shù)(1)

1.4.6L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制0.2 g/L的L-精氨酸水溶液作為母液，稀釋獲得質(zhì)量濃度為0.04、0.08、0.10、0.12、0.16 g/L 的L-精氨酸水溶液，其中0.10 g/L 的L-精氨酸水溶液為標(biāo)品。按照L-精氨酸含量測(cè)定步驟加樣、顯色，測(cè)定吸光度，繪制L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Origin pro 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)參數(shù)的確定

2.1.1 分光光度計(jì)的選擇

為排除儀器誤差對(duì)L-精氨酸含量測(cè)定結(jié)果的影響，分別選用3 臺(tái)不同廠家、型號(hào)的分光光度計(jì)對(duì)同一樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，分光光度計(jì)L5S、Spectronic200、UV-5500PC 測(cè)得的L-精氨酸含量分別為50.82、50.71、50.75 g/L。由此可知，坂口試劑改良法對(duì)分光光度計(jì)的選擇性不高，可適用于工業(yè)生產(chǎn)。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

反應(yīng)液的紫外分光光度計(jì)掃描結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)液的紫外分光光度計(jì)掃描結(jié)果

L-精氨酸側(cè)鏈胍基在堿性介質(zhì)中與顯色液發(fā)生反應(yīng)生成紅色物質(zhì)，該物質(zhì)的吸光度在一定范圍內(nèi)與L-精氨酸濃度呈線性關(guān)系。本試驗(yàn)用L5S 紫外可見分光光度計(jì)對(duì)生成的紅色反應(yīng)液進(jìn)行掃描。由圖1 可知，525 nm 處的吸光度最大。因此，以525 nm作為L(zhǎng)-精氨酸檢測(cè)的最適波長(zhǎng)。

2.1.3 顯色時(shí)間與顯色反應(yīng)穩(wěn)定性（見圖2、圖3）

圖2 反應(yīng)液的動(dòng)力學(xué)測(cè)量結(jié)果（顯色20 min）

圖3 反應(yīng)液的動(dòng)力學(xué)測(cè)量結(jié)果（顯色30 min）

試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，顯色時(shí)間對(duì)反應(yīng)液的吸光度有一定影響。因此，為探究顯色反應(yīng)的穩(wěn)定性，將同一濃度的L-精氨酸溶液分別顯色20、30 min 后，用L5S 分光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，觀察反應(yīng)液吸光度隨時(shí)間變化的情況。

由圖2 可知，樣品水浴顯色20 min 后直接測(cè)吸光度時(shí)，此時(shí)吸光度未達(dá)到最大值，顯色不完全。

由圖3 可知，樣品水浴顯色30 min 后直接測(cè)吸光度時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，顯色完全，且吸光度在10 min內(nèi)保持不變。對(duì)比圖2、圖3可知，水浴顯色30 min后取出樣品，并在10 min 內(nèi)完成吸光度的測(cè)定，更有利于保證L-精氨酸在實(shí)際測(cè)定過(guò)程中測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.1.4L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖4）

圖4 L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

在檢測(cè)波長(zhǎng)525 nm，水浴顯色30 min 的條件下繪制L-精氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖4 可知，L-精氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=6.456 4x，L-精氨酸在該范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.999 8。

2.2 不同因素對(duì)L-精氨酸含量測(cè)定的影響

2.2.1L-賴氨酸的存在對(duì)L-精氨酸含量測(cè)定的影響（見表1）

表1 L-賴氨酸對(duì)L-精氨酸含量測(cè)定的影響（n=3）單位：g/L

研究表明，L-賴氨酸為L(zhǎng)-精氨酸發(fā)酵中最主要的副產(chǎn)物。在L-精氨酸工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，L-賴氨酸濃度可達(dá)10 g/L[16]。為探究L-賴氨酸的存在對(duì)L-精氨酸含量測(cè)定的影響，分別配制L-精氨酸溶液、L-賴氨酸溶液、相同濃度的L-精氨酸和L-賴氨酸的混合液，測(cè)定3種溶液的L-賴氨酸、L-精氨酸含量。結(jié)果表明，發(fā)酵液中L-賴氨酸的存在對(duì)L-精氨酸含量的測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾。

2.2.2 不同pH值對(duì)L-精氨酸含量測(cè)定的影響（見表2）在L-精氨酸的發(fā)酵與后提取過(guò)程中，L-精氨酸溶液的pH 值會(huì)因酸、堿的加入產(chǎn)生變化。為探究不同pH 值對(duì)L-精氨酸含量測(cè)定的影響，調(diào)節(jié)L-精氨酸溶液pH 值至設(shè)定值，測(cè)定L-精氨酸含量。由表2可知，不同pH值的L-精氨酸溶液中，L-精氨酸含量標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.047。因此，L-精氨酸生產(chǎn)過(guò)程中，pH 值的變化對(duì)L-精氨酸含量的測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾。

表2 pH值的不同對(duì)L-精氨酸含量測(cè)定的影響（n=3）

2.2.3 發(fā)酵液成分對(duì)L-精氨酸含量測(cè)定的影響（見表3）

表3 樣品加標(biāo)回收結(jié)果（n=3）

L-精氨酸生產(chǎn)過(guò)程往往采取流加葡萄糖與硫酸銨的方式提高發(fā)酵水平，大量的葡萄糖、硫酸銨等物質(zhì)對(duì)顯色反應(yīng)影響尚不明確。故通過(guò)加標(biāo)回收的方法驗(yàn)證發(fā)酵液成分對(duì)L-精氨酸含量測(cè)定的影響?？紤]不同發(fā)酵階段發(fā)酵液組分存在差異，選擇發(fā)酵初始階段（發(fā)酵12 h）和下罐（發(fā)酵59 h）兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵上清液/上清稀釋液分別重復(fù)本實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證發(fā)酵液成分對(duì)L-精氨酸含量測(cè)定的影響。由表3 可知，測(cè)得樣品的加標(biāo)回收率分別為99.20%、100.60%。由此可知，發(fā)酵液成分對(duì)L-精氨酸含量測(cè)定結(jié)果影響極小。

2.3 方法的可靠性

2.3.1 檢測(cè)方法的重現(xiàn)性（見表4）

表4 檢測(cè)方法的重現(xiàn)性

方法的重現(xiàn)性能夠很好地檢驗(yàn)方法的可行性。為探究本檢測(cè)方法的重現(xiàn)性，重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作過(guò)程。根據(jù)各批次繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.012，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的重現(xiàn)性良好，可以用于L-精氨酸的定量檢測(cè)。

2.3.2 不同化驗(yàn)員操作平行性（見表5）

表5 不同化驗(yàn)員操作平行性（n=3）

4位化驗(yàn)員采用不同的分光光度計(jì)，分別對(duì)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液進(jìn)行L-精氨酸含量的測(cè)定。由表5 可知，L-精氨酸含量測(cè)定方法的操作平行性良好。

2.3.3 檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性（見表6）

表6 檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性（n=3） 單位：g/L

取3 份樣液，分別用本研究?jī)?yōu)化后的坂口試劑改良法和全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行定量檢測(cè)。由表6 可知，本文方法定量測(cè)定L-精氨酸的結(jié)果較準(zhǔn)確。

3 討論

本研究對(duì)坂口試劑改良法進(jìn)行了檢測(cè)參數(shù)的優(yōu)化以及準(zhǔn)確性的檢驗(yàn)，建立了一種L-精氨酸快速定量檢測(cè)方法。與其他方法相比，本檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)為所用設(shè)備均為實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備，對(duì)分光光度計(jì)的選擇性不高，檢測(cè)成本低廉、適用性強(qiáng)。與郝剛等[17]研究結(jié)果相比，本方法測(cè)定不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，且在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中可通過(guò)不同規(guī)格的容量瓶進(jìn)行稀釋，簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程，檢測(cè)效率更高；與李煒等[15]提出的檢測(cè)方法相比，本研究檢測(cè)過(guò)程顯色更完全，吸光度更穩(wěn)定，在實(shí)際生產(chǎn)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品時(shí)能夠最大限度地保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本方法操作簡(jiǎn)便易行，化驗(yàn)員可熟練掌握，不同化驗(yàn)員檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.4%，適宜推廣使用。

4 結(jié)論

本研究對(duì)坂口試劑改良法測(cè)定L-精氨酸含量的條件進(jìn)行優(yōu)化與驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法在0～0.2 g/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。加標(biāo)回收率范圍為99.20%～100.60%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.012，小于0.05，滿足化學(xué)分析法的要求。本研究測(cè)定方法測(cè)得結(jié)果與全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)得結(jié)果差距較小，可準(zhǔn)確測(cè)定L-精氨酸含量。該方法的優(yōu)化與驗(yàn)證為L(zhǎng)-精氨酸產(chǎn)業(yè)提供了一種快速高效的L-精氨酸檢測(cè)方法，也為其他氨基酸的快速定量檢測(cè)方法的選擇與優(yōu)化提供了參考。