高效液相色譜法測(cè)定魚(yú)粉中色胺含量不確定度評(píng)定

夏 冰 劉 軍 潘燦盛 溫才潔 蔡群娣 張 飛

（廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心）廣東省化學(xué)測(cè)量與應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070）

魚(yú)粉是常見(jiàn)的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白原料，廣泛在家畜飼料和水產(chǎn)餌料應(yīng)用[1]。魚(yú)粉由一種或多種魚(yú)類通過(guò)一系列操作加工而成?；铘~(yú)死后，魚(yú)體內(nèi)蛋白酶催化蛋白質(zhì)水解成小肽物質(zhì)和氨基酸，氨基酸脫羧酶又進(jìn)一步催化氨基酸水解成生物胺[2]，魚(yú)體越腐敗，生物胺含量就越高。若使用腐敗變質(zhì)的魚(yú)肉制品或魚(yú)粉保存不當(dāng)均會(huì)導(dǎo)致魚(yú)粉中生物胺含量升高[3-4]，因此，魚(yú)粉中生物胺的含量是評(píng)價(jià)魚(yú)粉質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)[5]。色胺屬于一種生物胺，是由色氨酸脫羧形成的胺，具有潛在毒性，含量過(guò)高可能會(huì)引起變態(tài)反應(yīng)等不良后果[6]。

在日常檢測(cè)中，魚(yú)粉中色胺的檢出率較高，部分樣品中色胺的含量接近方法定量限，此時(shí)需要對(duì)影響色胺測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的因素進(jìn)行不確定度評(píng)定。不確定度評(píng)定可以提高色胺測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確度、有效性和科學(xué)性；提供測(cè)量結(jié)果的分散性[7]，對(duì)色胺質(zhì)量控制具有重要意義[8]。目前，關(guān)于魚(yú)粉中色胺的不確定度評(píng)定未見(jiàn)報(bào)道。本研究依據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS—GL06）[9]和《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[10]中規(guī)定的方法和程序，參照《動(dòng)物源性飼料中生物胺的測(cè)定》（GB/T 23884—2021）[11]，采用高效液相色譜法對(duì)魚(yú)粉中色胺的含量進(jìn)行測(cè)定，并建立數(shù)學(xué)模型，量化檢測(cè)過(guò)程中各不確定度分量，得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度，并分析影響不確定度的關(guān)鍵來(lái)源，找出影響檢測(cè)不確定度的主要因素，為進(jìn)一步提高魚(yú)粉中色胺含量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器購(gòu)自美國(guó)Agilent 公司，Multi reax 多位試管渦旋振蕩器購(gòu)自heidolph 公司，BT125D 電子天平購(gòu)自賽多利斯科技有限公司，PIFE 防腐型24 位氮吹儀購(gòu)自ANPEL 公司，F(xiàn)E15067超聲波機(jī)購(gòu)自Fisherbrand公司。

色胺（98.3%）購(gòu)自Chromadex 公司，乙腈（色譜純）購(gòu)自MERK，丹酰氯（分析純）購(gòu)自Sigma，高氯酸、氨水、碳酸氫鈉、丙酮、氫氧化鈉（分析純）購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，魚(yú)粉購(gòu)自市場(chǎng)。

丹磺酰氯溶液（10 g/L）：稱取0.5 g 丹磺酰氯于50.00 mL容量瓶，使用丙酮溶解并定容。

1.2 試驗(yàn)方法

按照《動(dòng)物源性飼料中生物胺的測(cè)定》（GB/T 23884—2021）的要求測(cè)定魚(yú)粉中色胺的含量[11]。

1.2.1 樣品制備

稱取1.0 g 于50 mL 離心管中，加入10 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液，渦旋混勻，振搖提取10 min，4 000 r/min離心10 min，移出上清液，重復(fù)提取殘?jiān)淮?，合并兩次上清液；移? mL 上清液于10 mL 比色管中，依次加入2 mol/L 氫氧化鈉溶液200 μL，飽和碳酸氫鈉溶液300 μL和10 g/L丹磺酰氯溶液2 mL，渦旋混勻，45 ℃避光反應(yīng)45 min，加入氨水100 μL 終止反應(yīng)，靜置15 min。45 ℃下用氮?dú)獯党译娑ㄈ葜? mL，過(guò)濾上機(jī)[11]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

準(zhǔn)確稱取5.54 mg 標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL 容量瓶，使用0.1 mol/L鹽酸溶液定容，得到108.9 mg/L溶液，逐級(jí)稀釋為54.500、27.200、10.900、5.450、0.545、0.109、0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Ultimate?XB-C18柱（4.6 μm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：乙酸銨溶液（5 mmol/L），流動(dòng)相B：乙腈，梯度洗脫：0～5 min，60% B；5～12 min，60% B～75% B；12～20 min，75% B～95% B；20～21 min，95%B～60% B；21～25 min，60% B；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 數(shù)學(xué)模型和不確定度來(lái)源分析

1.3.1 數(shù)學(xué)模型

式中：X為試供試液中色胺的含量（mg/kg）；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的供試液質(zhì)量濃度（mg/L）；V為樣品定容體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

1.3.2 不確定度來(lái)源分析

對(duì)試驗(yàn)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，魚(yú)粉中色胺測(cè)定結(jié)果的不確定度來(lái)源見(jiàn)圖1。

圖1 魚(yú)粉中色胺不確定度來(lái)源

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)試液中色胺濃度c的不確定度分析

2.1.1 對(duì)照品純度Urel（P）

色胺對(duì)照品純度為98.3%，未標(biāo)識(shí)不確定度。按矩形分布，對(duì)照品純度引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量Urel（mstd）

對(duì)照品稱樣量為5.54 mg，精確至0.01 mg，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《電子天平》（JJG 1036—2008）[12]平行測(cè)定6 次；稱量時(shí)操作兩次，計(jì)2 次不確定度，對(duì)照品稱樣量的不確定度見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照品稱樣量的不確定度

2.1.3 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制Urel（Cstd）

使用容量瓶配制108.900、54.500、27.200、10.900、5.450、0.545、0.109、0 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，1.00、5.00 mL分度吸量管，20、200 μL 移液器，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制方法見(jiàn)表2。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[13]規(guī)定，在（20±5）℃進(jìn)行操作，水膨脹系數(shù)2.08×10-4（1/℃），溫差引起的體積分散區(qū)間半寬度。

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制方法

50 mL 容量瓶：ΔV=50 mL×2.08×10-4℃-1×5 ℃=0.052 mL。

10 mL 容量瓶：ΔV=10 mL×2.08×10-4℃-1×5 ℃=0.010 mL。

取矩形分布，標(biāo)液移取和定容引起的不確定度見(jiàn)表3。由此可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制引入的相對(duì)不確定度為：。

表3 標(biāo)液移取和定容引起的不確定度

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度Urel（Cal）

使用最小二乘法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 標(biāo)液濃度及相應(yīng)的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品做兩次平行測(cè)定，采用線性回歸方程計(jì)算得出樣品的平均質(zhì)量濃度為0.092 0 mg/L。由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。其中；=(0+0.109+0.545+5.45+10.9+27.2+54.5+108.9)/8=26.0 mg/L。

式中：SR為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差；aˉ為回歸方程斜率平均值，本試驗(yàn)aˉ=19.908；b為-99.11；cˉ為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的平均質(zhì)量濃度；P為樣品的平行測(cè)定次數(shù)，P=2；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)，n=6；j為校正曲線級(jí)別。

c的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：，。

2.2 樣品定容引入的不確定度Urel（V10）

樣品做2次平行測(cè)定，使用10 mL單標(biāo)線吸量管進(jìn)行定容，根據(jù)JJG 196—2006[13]規(guī)定，樣品定容引入的不確定度見(jiàn)表5。

表5 樣品定容引入的不確定度

2.3 樣品稱量引入的不確定度Urel（m）

樣品稱樣量為1.0 g，引入的不確定度見(jiàn)表6。

表6 樣品稱量引入的不確定度

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)引入的不確定度Urel（Frep）

重復(fù)稱取樣品6次進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得含量分別為10.50、10.20、9.97、10.50、10.50 和10.40 mg/kg，平均值為10.3 mg/kg。

單次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度使用貝塞爾公式計(jì)算[14]：。

在實(shí)際檢測(cè)時(shí)通常做平行雙樣，平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為（n=2）：。

2.5 加標(biāo)回收引入的不確定度Urel（Rec）

在加標(biāo)量為10 mg/kg 時(shí)，求得加標(biāo)回收率為分別為102.1%、100.0%、101.2%、102.5%、102.1%、102.7%，平均值101.8%，回收率的標(biāo)準(zhǔn)不確定度URec為：。

則回收率Rec的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

2.6 合成測(cè)量不確定度的評(píng)定

2.6.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

因各分量相互獨(dú)立不相關(guān)，因此樣品中色胺測(cè)定結(jié)果的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：U(ω)=0.033×10.3 mg/kg ≈0.34 mg/kg。

2.6.2 相對(duì)擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：Urel=2×3.3%=6.6%。

2.6.3 擴(kuò)展不確定度

U=2×0.34=0.68mg/kg。

樣品中魚(yú)粉色胺含量為：10.3 mg/kg。樣品中魚(yú)粉色胺含量結(jié)果表示為：(10.30±0.68) mg/kg，k=2[10]。

2.7 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本研究對(duì)高效液相色譜法測(cè)定魚(yú)粉中色胺含量的不確定度進(jìn)行評(píng)定，量化各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，見(jiàn)表7。由表7 可知，影響魚(yú)粉中色胺測(cè)量不確定度的因素有測(cè)定液中色胺的濃度（標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制）、定容體積、樣品稱量、樣品重復(fù)性和樣品前處理的回收率，其中測(cè)定液中色胺的濃度是主要因素，而樣品稱量過(guò)程引入的不確定度最小[14-15]。

表7 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3 結(jié)論

本研究通過(guò)量化色胺檢測(cè)結(jié)果中各不確定度分量，得到了影響結(jié)果不確定度的主次因素，為采取針對(duì)性的措施提供了參考，可以選購(gòu)權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的有效期內(nèi)、不確定度較小的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并且定期對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行期間核查；嚴(yán)格按照操作規(guī)范配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，包括使用計(jì)量檢定合格的移液器、移液管和容量瓶，定期對(duì)器皿進(jìn)行校準(zhǔn)和核查；選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)系列濃度點(diǎn)和測(cè)定次數(shù)；注意色譜峰面積積分細(xì)節(jié)的處理以減小最小二乘法線性擬合曲線的影響，使標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)≥0.999；設(shè)計(jì)合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線，使供試液濃度位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間；定期對(duì)儀器進(jìn)行檢定和核查，確保儀器處于最佳工作狀態(tài)；定期開(kāi)展人員比對(duì)，提高檢測(cè)人員熟練水平；確保樣品均勻性，盡量降低相關(guān)不確定度。