血清HCO3-酶法檢測(cè)試劑改良路徑的比較研究*

黃 潔,崔 婷,張炳峰,張潔心△

1.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科,安徽蕪湖 241000;2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部,江蘇南京 210029

血液中二氧化碳(CO2)主要以碳酸氫鹽(HCO3-)形式存在。由HCO3-和碳酸(H2CO3)組成的緩沖液體系維持機(jī)體酸堿平衡和血液pH值。任何導(dǎo)致pH值超出范圍的病理生理狀態(tài)都屬于酸堿平衡紊亂[1]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),血清HCO3-濃度與高血壓、急性腎損傷進(jìn)展、惡性腫瘤相關(guān)死亡率、心力衰竭有關(guān)[2-6]。它還與糖耐量受損、糖尿病相關(guān)高風(fēng)險(xiǎn)因子之間存在相關(guān)性,并可能成為糖尿病預(yù)防相關(guān)研究的新靶點(diǎn)[7-8]。因此,及時(shí)準(zhǔn)確地獲得血清HCO3-濃度對(duì)于動(dòng)態(tài)觀察機(jī)體酸堿平衡狀態(tài)以及疾病鑒別診斷和預(yù)后判斷尤為重要。

血清HCO3-濃度可通過(guò)血?dú)夥治鰞x或者生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。為了獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果,臨床醫(yī)生多數(shù)選擇留取靜脈血進(jìn)行生化檢測(cè)。磷酸烯醇式丙酮酸羥化酶法(PEPC法)是目前臨床生化實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)血清HCO3-濃度的方法。循環(huán)酶法(CEM法)是近幾年新興的改良酶法。本課題組前期報(bào)道了檢測(cè)前環(huán)境因素可干擾血清CO2濃度檢測(cè)[9]。考慮到生化試劑本身性能也會(huì)對(duì)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生重要影響,本研究通過(guò)比較兩種方法學(xué)試劑的開(kāi)瓶穩(wěn)定性和試劑組分有效性這兩個(gè)方面,進(jìn)一步評(píng)估改良酶法試劑質(zhì)量,探討未來(lái)臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1儀器及試劑 Beckman Coulter公司AU5800 型全自動(dòng)生化分析儀。CEM法試劑1(貝克曼庫(kù)爾特公司,以下稱(chēng)“C1試劑”)、CEM法試劑2(澳林生物科技有限公司,以下稱(chēng)“C2試劑”)。PEPC法試劑(邁克生物股份有限公司,以下稱(chēng)“P試劑”)。CEM法試劑所含供氫體為乙?；?還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(AcNADH),PEPC法試劑所含供氫體為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),其余試劑成分同。C1試劑含AcNADH為1.6 mmol/L,C2試劑含AcNADH為0.5 mmol/L。P試劑含NADH為0.5 mmol/L。反應(yīng)體系按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置。質(zhì)控品為美國(guó)伯樂(lè)公司的生化低值質(zhì)控品(批號(hào):26461)和高值質(zhì)控品(批號(hào):26462)。

1.2方法

1.2.1試劑開(kāi)瓶穩(wěn)定性 參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)EP25-A文件[10]結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室每個(gè)月標(biāo)本量和試劑使用量實(shí)際情況制定。C1試劑和P試劑敞口置于生化分析儀內(nèi)4 ℃保存。每天早上8:30檢測(cè)試劑空白,連續(xù)檢測(cè)20 d,計(jì)算各試劑當(dāng)天空白吸光度值與第一天空白吸光度值的檢測(cè)偏倚(BA)。

1.2.2試劑組分有效性 參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)EP5-A3文件[11]結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室每個(gè)月標(biāo)本量和試劑使用量實(shí)際情況制定。將低值、高值質(zhì)控品復(fù)溶,各分裝20份,置于4 ℃密封保存。每天各取1份,使用C1試劑、C2試劑和P試劑分別進(jìn)行檢測(cè),連續(xù)檢測(cè)20 d,計(jì)算檢測(cè)值的前n天變異系數(shù)(CV)。

2 結(jié) 果

C1試劑和P試劑開(kāi)瓶后20 d內(nèi)空白吸光度值BA均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其中,C1試劑空白吸光度值BA為-1.47%±3.19%,最大變化-11.3%;而P試劑空白吸光度值BA為-19.03%±6.01%,最大可達(dá)-28.35%。見(jiàn)圖1。

使用C1試劑、C2試劑和P試劑連續(xù)檢測(cè)低值、高值質(zhì)控品20 d。3個(gè)試劑的檢測(cè)值前n天CV均呈增高趨勢(shì)。將最大CV按從大到小排列依次為P試劑(11.43%和13.64%)、C2試劑(6.05%和7.48%)和C1試劑(4.92%和3.72%)。P試劑的低值質(zhì)控品檢測(cè)值前n天CV為6.50%±2.90%,高值質(zhì)控品檢測(cè)值前n天CV為6.34%±3.60%;C2試劑的低值質(zhì)控品檢測(cè)CV為3.71%±1.19%,高值質(zhì)控品檢測(cè)CV為3.47%±2.22%。加大了底物AcNADH濃度的C1試劑,其低值質(zhì)控品檢測(cè)CV為3.62%±1.18%,高值質(zhì)控品檢測(cè)CV為2.35%±1.27%。見(jiàn)圖2。

注:A為檢測(cè)低值質(zhì)控品;B為檢測(cè)高值質(zhì)控品。

3 討 論

NADH是檢測(cè)血清HCO3-濃度的生化試劑中的重要供氫體,其在特定波長(zhǎng)處有吸收峰。當(dāng)NADH被中間產(chǎn)物氧化為無(wú)吸收峰的NAD+,反應(yīng)液吸光度值的降低與血清中HCO3-的濃度成正比[12]。由于試劑敞口存放在生化分析儀的試劑托盤(pán)上,空氣中的 CO2 也可緩慢與試劑中NADH成分發(fā)生非特異性反應(yīng),導(dǎo)致試劑空白吸光度值隨著試劑敞口時(shí)間延長(zhǎng)而發(fā)生下降[13-14]。CEM法將NADH修飾成AcNADH,并增加一個(gè)獨(dú)立的AcNADH循環(huán)再生酶促反應(yīng)體系,即添加葡萄糖組分作為供氫體,在葡糖糖脫氫酶的催化下將氧化型AcNAD再次還原成AcNADH,從而形成閉環(huán)。理論上,基于改良方法學(xué)的生化試劑能克服環(huán)境因素影響,確保開(kāi)瓶穩(wěn)定性[15]。本研究數(shù)據(jù)證實(shí)CEM法試劑的開(kāi)瓶穩(wěn)定性較PEPC法試劑有顯著提升。

生化酶法檢測(cè)血清HCO3-通常采用兩點(diǎn)速率法,即通過(guò)測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)吸光度的降低值來(lái)算得血清HCO3-濃度。此法一定程度上能抵消空白吸光度值波動(dòng)所致的不良影響[16-17]。底物濃度是決定反應(yīng)速度最重要因素之一。只有當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐虼髸r(shí),酶促反應(yīng)速度才能保持恒定,使反應(yīng)處于零級(jí)反應(yīng)期,此時(shí)酶促反應(yīng)速度和酶濃度存在線性關(guān)系。隨著反應(yīng)時(shí)間增加,底物濃度快速降低,酶促反應(yīng)速度逐漸減慢,反應(yīng)達(dá)到非線性期[18]。兩點(diǎn)速率法的吸光度讀點(diǎn)區(qū)設(shè)定在線性期。若底物濃度不足,零級(jí)反應(yīng)期變短,讀點(diǎn)區(qū)在零級(jí)反應(yīng)期之外,檢測(cè)線性范圍將變小,檢測(cè)精密度變差[19-22]。本研究結(jié)果表明,當(dāng)提高改良酶法試劑中AcNADH濃度至三倍,可更加延長(zhǎng)維持試劑成分有效性,全面提高批間精密度。因此,在采用CEM法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加大底物AcNADH濃度可保證改良酶法試劑質(zhì)量,提高實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)水平,具有廣闊的臨床推廣和應(yīng)用前景。