METTL16、MAT2A在胃癌組織中的表達及其與胃癌患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系*

秦豫培,楊 麗,胡陽黔

國藥東風(fēng)總醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院消化內(nèi)科,湖北十堰 442001

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,全球每年發(fā)病例數(shù)達100萬例,死亡例數(shù)達78萬例,嚴(yán)重威脅人類健康[1]。胃癌早期無特異性臨床表現(xiàn),多數(shù)患者確診時已進入中晚期,5年生存率較低[2]。尋找能夠早期診斷及預(yù)測胃癌預(yù)后的分子標(biāo)志物具有重要意義。甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白16(METTL16)是一種N6甲基腺苷(m6A)RNA甲基轉(zhuǎn)移酶,通過甲基化修飾U6小核RNA、長鏈非編碼RNA MALAT1,調(diào)控下游基因表達,影響個體生長發(fā)育及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程[3]。研究發(fā)現(xiàn),METTL16在肝癌等惡性腫瘤中表達上調(diào),其通過與真核生物起始因子3a相互作用,促進翻譯起始復(fù)合物的組裝,促進下游癌基因的表達,導(dǎo)致腫瘤進展[4]。甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2A(MAT2A)蛋白參與催化甲硫氨酸和ATP產(chǎn)生S-腺苷甲硫氨酸,是細(xì)胞內(nèi)重要的甲基供體[5]。MAT2A在乳腺癌等腫瘤中表達上調(diào),其通過促進腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和干性轉(zhuǎn)化,促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。目前METTL16、MAT2A在胃癌中的表達水平及在預(yù)后判斷中的價值尚不明確。本研究旨在通過分析胃癌中METTL16和MAT2A的表達,探討兩者的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 將本院2018年3月至2019年3月診治的92例胃癌患者納入研究。男56例,女36例;年齡33～77歲,平均(58.3±5.1)歲;分化程度:中、高分化49例,低分化43例;腫瘤TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期40例,Ⅲ期52例;合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者53例;腫瘤最大徑:>5 cm者51例,≤5 cm者41例;病理類型:腺癌62例,腺鱗癌30例;腫瘤位置:胃竇部55例,賁門胃底部37例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為胃癌;(2)初次診治,既往無手術(shù)、放化療等治療史;(3)患者及家屬配合檢查治療,臨床病理資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他惡性腫瘤;(2)合并肝、腎等臟器功能衰竭;(3)妊娠及哺乳期女性。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過,納入研究者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 METTL16、MAT2A單克隆抗體均購自美國Abcam公司,貨號ab40850、ab209328。兩步法免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自北京中杉金橋公司,貨號PV-6001。

1.3方法

1.3.1免疫組化檢測METTL16、MAT2A表達 將術(shù)中獲取的胃癌和癌旁組織用含10%甲醛的組織固定液固定過夜,常規(guī)石蠟包埋后用切片機切片,厚度4 μm,65 ℃烘箱放置2 h,用二甲苯Ⅰ、Ⅱ依次脫蠟兩遍,每次10 min,梯度乙醇(100%、95%、80%、70%、50%乙醇)水化,每個梯度5 min。檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中進行抗原熱修復(fù),熱修復(fù)條件:水浴鍋100 ℃ 15 min。3%的過氧化氫水溶液作用15 min,消除內(nèi)源性過氧化物。3%山羊血清室溫封閉2 h。滴加一抗,METTL16一抗稀釋比例1∶1 000,MAT2A一抗稀釋比例1∶2 000。4 ℃孵育過夜,辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗室溫孵育2 h。癌組織DAB顯色3 min,癌旁組織DAB顯色5 min,蘇木素染核10 s。50%、70%、80%、95%、100%梯度乙醇脫水,每個梯度5 min,最后中性樹脂封片鏡檢。鏡下觀察染色情況,同時進行免疫組化染色評分。染色強度評分:不著色為0分,淡黃色1分,棕黃色2分,深褐色3分;染色面積評分:<25%為1分,25%～50%為2分,>50%為3分。染色強度評分與染色面積評分乘積為免疫組化染色評分,>2分為陽性,≤2分為陰性。

1.3.2隨訪 所有患者自病理確診之日起開始進行定期門診或電話隨訪,術(shù)后第1年每3個月隨訪1次,術(shù)后第2至3年每半年隨訪1次,總隨訪時間3年,隨訪內(nèi)容為患者生存及腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況,隨訪截至2022年4月1日,隨訪終點為患者死亡或隨訪結(jié)束。

2 結(jié) 果

2.1胃癌和癌旁組織中METTL16、MAT2A蛋白的表達 癌組織中METTL16黃褐色陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜,MAT2A陽性染色主要分布于細(xì)胞核。胃癌組織中METTL16、MAT2A陽性率分別為73.91%(68/92)、71.74%(66/92),明顯高于癌旁組織的METTL16、MAT2A陽性率[26.09%(24/92)、25.00%(23/92)],差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=42.087、40.238,P<0.001),見圖1。Spearman秩相關(guān)分析顯示,胃癌組織中METTL16與MAT2A蛋白呈正相關(guān)(r=0.769,P<0.001)。

圖1 胃癌和癌旁組織中METTL16、MAT2A蛋白表達情況(×200)

2.2METTL16、MAT2A表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 不同腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的患者癌組織中METTL16、MAT2A陽性率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),腫瘤TNM分期Ⅲ期及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中的METTL16、MAT2A陽性率分別高于腫瘤TNM分期Ⅰ～Ⅱ期及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織(P<0.05)。不同年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤位置、病理類型、病理分級患者癌組織中METTL16、MAT2A陽性率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 METTL16、MAT2A表達情況與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3METTL16、MAT2A表達與胃癌患者生存預(yù)后的關(guān)系 隨訪期間無失訪,死亡患者例數(shù)28例,3年總體生存率為69.56%(64/92)。METTL16陽性組及陰性組3年總體生存率分別為63.24%(43/68)、87.50%(21/24),平均生存時間分別為(30.26±2.33)、(33.95±2.51)個月。METTL16陽性組的生存預(yù)后差于METTL16陰性組(Log-Rankχ2=3.913,P=0.011);MAT2A陽性組及陰性組3年總體生存率分別為60.61%(40/66)、92.31%(24/26),平均生存時間分別為(29.75±2.24)、(34.87±2.63)個月。MAT2A陽性組的生存預(yù)后差于陰性組(Log-Rankχ2=4.335,P=0.002)。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier分析METTL16、MAT2A表達與胃癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

2.4單因素及多因素COX回歸分析影響胃癌預(yù)后的因素 以胃癌患者生存預(yù)后情況為因變量(1=死亡,0=存活),以年齡(1為≥60歲,0為<60歲)、性別(1=男,0=女)、腫瘤位置(1=胃竇部,0=胃底賁門部)、腫瘤最大徑(1為>5 cm,0為≤5 cm)、病理分級(1=中、高分化,0=低分化)、病理類型(1=腺癌,0=腺鱗癌)、腫瘤TNM分期(1=Ⅲ期,0=Ⅰ～Ⅱ期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(1=有,0=無)、METTL16(1=陽性,0=陰性)、MAT2A(1=陽性,0=陰性)為自變量。單因素及多因素COX回歸分析顯示,胃癌組織中METTL16陽性、MAT2A陽性、腫瘤分期Ⅲ期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素。見表2、3。

表2 單因素COX比例風(fēng)險模型分析影響胃癌患者預(yù)后的危險因素

表3 多因素COX比例風(fēng)險模型分析影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素

3 討 論

胃癌是我國常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤,每年新發(fā)病例42.4萬例,死亡病例29.8萬例[7]。目前胃癌的治療以手術(shù)治療及輔助放化療治療為主,但對于中晚期患者,即使經(jīng)積極治療,仍可發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致患者死亡[8]。因此,深入探索胃癌疾病機制,尋找能夠評估胃癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物,具有重要意義。胃癌的發(fā)生、發(fā)展與遺傳和環(huán)境因素有關(guān),涉及癌基因過度激活,抑癌基因的失活及轉(zhuǎn)錄翻譯過程的異常。腫瘤中存在RNA修飾異常的現(xiàn)象,如m6A RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的甲基化修飾可通過影響RNA的剪接、易位和穩(wěn)定性,調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、干細(xì)胞分化等過程[9]。

METTL16是一種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶,通過促進RNA的m6A修飾,甲基化小核糖核苷酸U6、長鏈非編碼RNA多個靶點。METTL16在胰腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中過度表達,其通過促進腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致患者預(yù)后不良[10-11]。本研究中,胃癌組織中METTL16表達明顯升高,提示METTL16可能參與胃癌的腫瘤發(fā)生。研究表明,腫瘤中存在METTL16基因啟動子區(qū)擴增突變的現(xiàn)象,引起腫瘤細(xì)胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定及腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的發(fā)生,導(dǎo)致腫瘤的惡性進展[12]。本研究中,胃癌中METTL16的表達與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示METTL16的表達升高參與促進胃癌的惡性增殖和轉(zhuǎn)移。研究表明,胃癌中METTL16的表達升高能夠促進細(xì)胞周期素激酶D1的表達,進而誘導(dǎo)胃癌腫瘤細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的過度增殖[13]。此外,METTL16能夠通過甲基化修飾長鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄物1,激活β-連環(huán)蛋白及下游基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達,促進腫瘤血管生成擬態(tài)及血管新生,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn),METTL16陽性表達的胃癌患者生存預(yù)后較差,是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素,表明檢測癌組織中METTL16的表達有助于評估患者的臨床預(yù)后。METTL16的表達升高導(dǎo)致順鉑等化療藥物治療敏感性降低,因而篩選能夠抑制METTL16的小分子藥物,有助于改善腫瘤患者化療耐藥的形成,這可能是新的腫瘤治療策略[16]。

MAT2A是甲硫氨酸循環(huán)中的限速酶,催化甲硫氨酸和三磷酸腺苷合成S-腺苷蛋氨酸,S-腺苷蛋氨酸作為體內(nèi)的重要甲基供體,參與多胺合成等細(xì)胞代謝過程[17]。近年來發(fā)現(xiàn),肝癌中MAT2A的表達上調(diào),其可通過激活磷脂酰肌醇3激酶,促進癌基因c-MYC的表達,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的過度增殖[18]。本研究中,胃癌組織中MAT2A表達升高,提示MAT2A可能與胃癌的腫瘤發(fā)生有關(guān)。MAT2A表達上調(diào)的機制與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤發(fā)生時環(huán)狀RNA_0044516表達異常升高,其作為分子海綿結(jié)合抑制微小RNA-361的表達及功能,導(dǎo)致微小RNA-361不能結(jié)合到MAT2A mRNA的3′非編碼區(qū),MAT2A mRNA的穩(wěn)定性增加,促進MAT2A的表達[19]。本研究中,MAT2A表達與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示MAT2A參與促進胃癌的進展,其機制與MAT2A參與腫瘤代謝重編程有關(guān)。研究表明,MAT2A通過增加受體相互作用蛋白1基因啟動子區(qū)組蛋白H3K4甲基化水平,增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)甲硫氨酸循環(huán)活性,進而促進腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M1型極化,促進腫瘤的免疫逃逸[20]。此外,腫瘤中MAT2A通過激活磷酸腺苷激活的蛋白激酶,促進程序性細(xì)胞死亡蛋白6的表達,進而促進腫瘤細(xì)胞的過度增殖[21]。本研究中,MAT2A陽性表達的胃癌患者生存預(yù)后較差,并且是胃癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素,提示MAT2A的表達有助于評估胃癌患者的預(yù)后。有研究報道,胃癌中MAT2A的表達升高促進長鏈脂酰輔酶A合成酶3基因啟動子區(qū)組H3K4三甲基化,進而激活長鏈脂酰輔酶A合成酶3的表達,導(dǎo)致胃癌細(xì)胞鐵死亡抗性的形成,降低腫瘤細(xì)胞對順鉑等化療藥的敏感性[21-22]。因此,胃癌中MAT2A的高表達在胃癌的惡性進展中發(fā)揮重要作用,可能是胃癌治療的潛在的靶標(biāo)。

本研究中,胃癌組織中METTL16與MAT2A表達呈顯著正相關(guān),提示兩者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在協(xié)同的作用。研究表明,METTL16作為甲基轉(zhuǎn)移酶,能夠與MAT2A mRNA結(jié)合,增加MAT2A mRNA的穩(wěn)定性,促進MAT2A的表達[23]。但目前兩者在胃癌中的具體作用機制有待深入研究。

綜上所述,胃癌中METTL16、MAT2A表達升高,兩者表達與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),均參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。METTL16、MAT2A陽性表達是影響胃癌患者預(yù)后的危險因素,可作為新的反映胃癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究也存在一定的不足,本研究樣本量有限,隨訪時間較短,有待今后開展前瞻性、多中心大樣本的臨床實驗來進一步完善,從而深入分析兩者在胃癌中的臨床意義。