甜菜堿對(duì)阿霉素心臟毒性的作用及機(jī)制

滕藤 唐其柱

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,湖北 武漢 430060; 2.代謝與慢病相關(guān)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430060)

阿霉素(doxorubicin)是一種廣泛使用的蒽環(huán)類高效化療藥物,用于治療各種類型的癌癥,然而,阿霉素的劑量依賴性心臟毒性極大地限制了其臨床應(yīng)用[1]。目前為止還沒有任何一種有效的療法可以預(yù)防或者消除阿霉素的心臟毒性?；钚匝醯拇罅慨a(chǎn)生是阿霉素造成心臟損傷的主要因素,這引起心肌細(xì)胞氧化損傷和心肌細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[2]。

右雷佐生是美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)唯一批準(zhǔn)用于阿霉素心臟毒性治療的藥物,但由于其潛在的致癌性,因此臨床使用受到限制[3-4]。許多天然化合物具有明顯的抗氧化、抗炎癥等作用[5]。甜菜堿廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)[6],是動(dòng)物代謝的中間產(chǎn)物,是動(dòng)物體內(nèi)重要的甲基供體。甜菜堿可以促進(jìn)肝臟和腎臟同型半胱氨酸的代謝[7],同時(shí),甜菜堿也具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化以及抗凋亡作用[8-10],但關(guān)于其在阿霉素心臟毒性中的作用機(jī)制尚不清楚,現(xiàn)探究甜菜堿在阿霉素心臟毒性中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

甜菜堿(betaine)購(gòu)于阿拉丁;阿霉素購(gòu)于深圳萬樂藥業(yè)有限公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、磷酸化蛋白激酶B(phosph-protein kinase B,p-AKT)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、磷酸化糖原合成激酶-3β(phosph-glycogen synthase kinase-3β,p-GSK-3β)均購(gòu)于CST公司;4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)購(gòu)于Abcam公司;TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天;丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒以及胱天蛋白酶(caspase)-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所;心肌損傷標(biāo)志物試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 模型建立與動(dòng)物分組

選取購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司8～10周齡的雄性C57/BL6小鼠48只,體重為23.5～27.5 g,飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級(jí),恒溫、恒濕,12 h晝夜節(jié)律,并可自由飲食。本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過武漢大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按照隨機(jī)數(shù)字表分為4組,每組12只,分別為生理鹽水+生理鹽水組、生理鹽水+甜菜堿組、阿霉素+生理鹽水組、阿霉素+甜菜堿組。實(shí)驗(yàn)開始第一天,阿霉素組小鼠給予阿霉素(15 mg/kg)單次腹腔注射,對(duì)照組小鼠腹腔注射同體積生理鹽水;甜菜堿組小鼠給予甜菜堿(800 mg·kg-1·d-1)連續(xù)灌胃7 d,對(duì)照組小鼠給予同等體積生理鹽水灌胃。

1.3 心功能檢測(cè)及取材

各組小鼠結(jié)束灌胃后于異氟烷(2%濃度誘導(dǎo),1%濃度維持,氧流量300～500 mL/min)吸入麻醉下進(jìn)行心臟超聲檢查,評(píng)估心功能情況[左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)]、[左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)]等。完成檢測(cè)后處死小鼠、收集心臟標(biāo)本并記錄取材信息,用于分子生物學(xué)檢測(cè)和病理檢測(cè)。

1.4 組織病理檢測(cè)

1.4.1 免疫組織化學(xué)染色

將心臟組織脫蠟、水合、抗原修復(fù)、H2O2處理、封閉后滴加一抗(4-HNE)于4 ℃過夜,第二天進(jìn)行二抗孵育以及DAB顯色,顯色完全后及時(shí)終止,經(jīng)蘇木素復(fù)染、脫水、透明后用樹脂封片。

1.4.2 組織TUNEL染色

將心臟組織脫蠟、水合后,按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 分子生物學(xué)檢測(cè)

1.5.1 蛋白免疫印跡試驗(yàn)

取左心室組織樣本提取蛋白并進(jìn)行BCA定量。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜后,于4 ℃過夜進(jìn)行一抗的孵育,次日孵育對(duì)應(yīng)種屬二抗,然后按照比例配置ECL化學(xué)發(fā)光顯影液,曝光顯影,然后用Image Lab軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)

取左心室組織樣本提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,進(jìn)行目標(biāo)基因的表達(dá)檢測(cè)。

1.6 生化檢測(cè)

將左心室組織制成勻漿后分別用心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、MDA以及caspase-3活性檢測(cè)試劑盒按照說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間樣本比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間樣本比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況及心功能比較

阿霉素+甜菜堿組的小鼠體重以及心重/脛骨長(zhǎng)的下降程度較阿霉素+生理鹽水組的小鼠明顯減輕(P<0.05)。阿霉素處理的小鼠較對(duì)照組小鼠的LVEF以及LVFS明顯降低(P<0.05),甜菜堿治療可以明顯改善阿霉素?fù)p傷的心功能(P<0.05)(圖1)。阿霉素處理的小鼠的心肌損傷標(biāo)志物cTnI以及LDH較對(duì)照組小鼠明顯升高(P<0.05),而甜菜堿治療可以明顯減輕小鼠由阿霉素導(dǎo)致的心肌損傷(P<0.05)(圖2)。

注:*表示與生理鹽水+生理鹽水組相比,P<0.05;# 表示與阿霉素+生理鹽水組相比,P<0.05;n=12。

注:?表示與生理鹽水+生理鹽水組相比,P<0.05;#表示與阿霉素+生理鹽水組相比,P<0.05;n=12。

2.2 各組小鼠心臟氧化應(yīng)激情況比較

阿霉素處理的小鼠心臟較對(duì)照組小鼠心臟中的MDA以及4-HNE含量明顯升高(P<0.05),甜菜堿治療可以明顯減少小鼠心臟中由阿霉素誘導(dǎo)的MDA以及4-HNE的生成(P<0.05)(圖3)。與對(duì)照組小鼠相比,阿霉素處理的小鼠心臟中的超氧化物歧化酶-2(superoxide dismutase-2,SOD-2)、谷胱甘肽過氧化物酶-1(glutathione peroxidase-1,GPx-1)以及過氧化氫酶(catalase,CAT)的mRNA表達(dá)降低(P<0.05),甜菜堿治療的小鼠心臟較阿霉素小鼠心臟中的SOD-2、GPx-1以及CAT的mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)(圖4)。

注:*表示與生理鹽水+生理鹽水組相比,P<0.05;#表示與阿霉素+生理鹽水組相比,P<0.05;n=12。

2.3 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較

與對(duì)照組小鼠相比,阿霉素處理的小鼠心臟中caspase-3的活性明顯增加(P<0.05),甜菜堿治療可以降低由阿霉素誘導(dǎo)增加的心臟caspase-3活性(P<0.05)。TUNEL染色顯示,阿霉素處理的小鼠心臟較對(duì)照組小鼠的心臟凋亡水平顯著增加(P<0.05),經(jīng)過甜菜堿治療,阿霉素導(dǎo)致的小鼠心臟凋亡水平顯著降低(P<0.05)(圖5)。

注:?表示與生理鹽水+生理鹽水組相比,P<0.05;#表示與阿霉素+生理鹽水組相比,P<0.05;n=12。

2.4 相關(guān)通路改變情況

蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示,阿霉素組的小鼠心臟中,p-AKT、p-GSK-3β顯著降低(P<0.05);甜菜堿恢復(fù)了小鼠心臟中p-AKT和p-GSK-3β的含量(P<0.05)(圖6)。這說明,甜菜堿可能是通過AKT/GSK-3β通路發(fā)揮對(duì)阿霉素所致心肌損傷的保護(hù)作用。

3 討論

許多癌癥患者在接受治療后因?yàn)榘⒚顾匦呐K毒性引起的心力衰竭導(dǎo)致生活質(zhì)量顯著降低[11]。因此,尋找一種有前景的藥物治療阿霉素引起的心臟毒性成為迫切需要。

注:*表示與生理鹽水+生理鹽水組相比,P<0.05;#表示與阿霉素+生理鹽水組相比,P<0.05;n=12。

注:NS,生理鹽水;DOX,阿霉素;BET,甜菜堿;?表示與生理鹽水+生理鹽水組相比,P<0.05;#表示與阿霉素+生理鹽水組相比,P<0.05;n=12。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是阿霉素誘導(dǎo)心臟毒性的最主要機(jī)制,此前的許多研究[12]表明,活性氧的過度產(chǎn)生會(huì)刺激脂質(zhì)過氧化等損傷,并最終導(dǎo)致心力衰竭。Meng等[13]研究發(fā)現(xiàn),甜菜堿可以減輕小鼠應(yīng)激以及氧化應(yīng)激引起的睪丸損傷。甜菜堿可以減輕乙醇引起的肝臟以及小腦的氧化應(yīng)激損傷[14-15]。Lv等[16]研究報(bào)道,在ApoE-/-的小鼠中,補(bǔ)充甜菜堿可以減少血液中腫瘤壞死因子α等炎癥因子,從而減小動(dòng)脈粥樣硬化的病變面積。Heidari等[17]報(bào)道,口服補(bǔ)充甜菜堿,可以減少氧化應(yīng)激標(biāo)志物,從而減輕膽汁淤積相關(guān)腎損傷。這些研究結(jié)果說明,甜菜堿具有較強(qiáng)的抗氧化作用。筆者研究也發(fā)現(xiàn),甜菜堿可以提高阿霉素小鼠心臟中抗氧化酶的活性,并降低阿霉素小鼠心臟中過氧化物的水平。

阿霉素可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,Mizutani等[18]發(fā)現(xiàn)經(jīng)阿霉素處理的人早幼粒白血病細(xì)胞表現(xiàn)出caspase-3蛋白的激活,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。線粒體依賴的內(nèi)源性通路在阿霉素心臟毒性中起著關(guān)鍵作用,這一途徑是通過上調(diào)促凋亡蛋白,如B淋巴細(xì)胞瘤-2基因關(guān)聯(lián)X蛋白,促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放,導(dǎo)致caspase-9激活,進(jìn)而導(dǎo)致效應(yīng)器caspase-3激活[19]。此外,阿霉素還可通過死亡受體(death receptor,DR)等外源性途徑介導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡。Zhao等[20]證實(shí)了阿霉素誘導(dǎo)的人多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞中DR的上調(diào),如腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體、凋亡相關(guān)因子、DR4和DR5,這些上調(diào)的DR與其同源配體結(jié)合,觸發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Veskovic等[10]發(fā)現(xiàn),甜菜堿可以通過AKT/mTOR與自噬通路減輕肝臟氧化應(yīng)激、炎癥以及凋亡,從而發(fā)揮對(duì)于非酒精性脂肪肝的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn),在阿霉素處理的小鼠心臟中,caspase-3活性明顯升高,TUNEL染色顯示心肌細(xì)胞的凋亡水平也明顯增加;但經(jīng)過甜菜堿治療,小鼠心臟中caspase-3的活性被明顯抑制,TUNEL陽性率也明顯降低。這說明,阿霉素治療會(huì)引起較為嚴(yán)重的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生,但甜菜堿可以明顯減輕心肌細(xì)胞凋亡。

AKT和GSK-3β是胰島素信號(hào)通路的兩種重要蛋白激酶。當(dāng)胰島素與其受體結(jié)合時(shí),Thr308位點(diǎn)被磷酸化從而激活A(yù)KT,活化的AKT磷酸化GSK-3β并抑制其激酶活性[21],而 GSK-3β活性升高會(huì)破壞線粒體膜電位,增加細(xì)胞內(nèi)活性氧積累[22]。既往研究[23-24]表明,阿霉素誘導(dǎo)的損傷心臟中,AKT的活性明顯降低,而AKT磷酸化的增強(qiáng)促進(jìn)了心肌細(xì)胞的存活,預(yù)防了阿霉素誘導(dǎo)的心功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn),阿霉素處理的小鼠心臟中,p-AKT的含量顯著降低,GSK-3β的活性明顯增高;經(jīng)過甜菜堿治療,AKT的活性明顯增加,而GSK-3β的活性則被明顯抑制。這說明,甜菜堿對(duì)阿霉素心臟毒性的保護(hù)作用可能是通過AKT/GSK-3β通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,甜菜堿可以減輕阿霉素引起的心臟氧化應(yīng)激損傷和心肌細(xì)胞凋亡,而這些作用可能是通過激活A(yù)KT/GSK-3β實(shí)現(xiàn)的。