健脾柔肝息風湯聯(lián)合針刺對抽動障礙模型大鼠紋狀體區(qū)細胞自噬及凋亡的影響

張南， 朱沁泉， 何煒星， 李博， 廖艷紅

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院張滌中醫(yī)兒科臨床研究所，湖南長沙 410007）

抽動障礙（tic disorder）是一種起病于兒童和青少年時期的精神障礙疾病，以運動性或發(fā)聲性抽動為主要的臨床癥狀[1]。相關(guān)研究[2]表明，抽動障礙病理生理學和臨床癥狀之間的聯(lián)系可能在于皮質(zhì)-紋狀體-丘腦-皮質(zhì)（CSTC）回路。紋狀體作為大腦基底神經(jīng)節(jié)之一，主要負責調(diào)節(jié)肌肉張力和各種精細復(fù)雜的運動[3]。研究指出，紋狀體受損可導致紋狀體神經(jīng)元凋亡[4]，引起抽動行為[5]，而提高紋狀體自噬會改善運動性功能障礙[6]。張滌教授根據(jù)多年臨床治療抽動障礙的經(jīng)驗，研制了健脾柔肝息風湯。目前，該湯劑在本院廣泛應(yīng)用于兒童抽動障礙治療，取得了良好的療效[7]。課題組前期進行抽動障礙動物模型研究[8]發(fā)現(xiàn)，健脾柔肝息風湯可以通過調(diào)節(jié)腦皮質(zhì)和紋狀體多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)功能平衡減輕抽動障礙大鼠腦皮質(zhì)和紋狀體損傷，改善抽動癥狀。而針刺作為中醫(yī)特色外治法，亦能顯著改善兒童抽動障礙的抽動癥狀[9]，已廣泛應(yīng)用于臨床。既往吳靈芝等[10]臨床研究表明，中藥復(fù)方配合針刺太沖、三陰交、足三里、神門、內(nèi)關(guān)、合谷、百會、風池等穴位可顯著改善多發(fā)性抽動癥狀，降低復(fù)發(fā)率。因此，本研究在健脾柔肝息風湯治療基礎(chǔ)上輔以針刺療法治療抽動障礙大鼠，探討其治療作用及機制，以期為臨床應(yīng)用提供更多的選擇方案，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級SD 大鼠60 只，雌雄各半，鼠齡4 周，體質(zhì)量80 ～100 g， 由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2021-0002。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院創(chuàng)新實驗中心動物房，動物使用許可證號：SYXK（湘）2020-0010。動物飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22 ～24 ℃、相對濕度50% ～60%，明暗光照各12 h。動物實驗過程嚴格按照《實驗動物管理條例》執(zhí)行，并獲得本院動物倫理委員會的批準（審批號：IACUC20210047）。

1.2 藥物健脾柔肝息風湯中藥組成：鉤藤10 g，全蝎6 g，僵蠶10 g，白芍10 g，茯苓10 g，甘草2 g。中藥材均購自亳州市惠蒼藥業(yè)銷售有限公司。按照《中華人民共和國藥典》要求制備煎劑，濃縮至生藥含量為1.2 g/mL，于冰箱冷藏備用，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室提供。

1.3 試劑亞氨基二丙腈（IDPN，上海Aladdin 公司生產(chǎn)，純度98%）；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）染色試劑盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒（武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司）；兔多克隆Bcl-2 抗體、兔單克隆Bax 抗體、兔單克隆Beclin1 抗體、山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗和兔抗小鼠IgG 二抗（英國Abcam 公司）；兔單克隆cleaved-caspase-3 抗體、小鼠單克隆LC3抗體和GAPDH抗體（美國CST公司）。

1.4 儀器無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，型號： 0.30 mm×40 mm）；酶標儀（美國Rayto公司，型號：RT-6100）；電泳儀（北京六一儀器廠，型號：DYY-6C）；正置白光拍照顯微鏡（日本Olympus公司，型號：CX31）；透射電子顯微鏡（日本HITACHI 公司，型號：HT7700）；超薄切片機（德國Leica公司，型號：UC7）。

1.5 抽動障礙模型構(gòu)建與分組將60 只SD 大鼠隨機分為空白組（12 只）和造模組（48 只），組內(nèi)大鼠雌雄各半。造模組大鼠給予腹腔注射IDPN 溶液（150 mg·kg-1·d-1），空白組大鼠給予腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)注射1周[11]。按Diamond評分標準[12]進行評分。運動行為評分：安靜或正常運動，計0 分；過度興奮，計1 分；探究行為增加并伴有不連續(xù)吸鼻，計2 分；不停跑動，計3 分；不停跑動伴有驚跳，計4分。刻板行為評分：無刻板行為，計0 分；軀體旋轉(zhuǎn)行為，計1 分；頭頸部瘋狂出現(xiàn)上下運動，計2分；頭頸部的上下運動加旋轉(zhuǎn)行為，計3分；頭向側(cè)擺并伴有頭頸部的上下運動跳，計4分。評估大鼠行為學表現(xiàn)，以≥1 分為造模成功。將造模成功的抽動障礙大鼠，隨機分為模型組、健脾柔肝息風湯組（以下簡稱湯劑組）、針刺組和健脾柔肝息風湯聯(lián)合針刺組（以下簡稱聯(lián)合組），每組12只。

1.6 給藥干預(yù)本課題組前期多次進行動物實驗摸索健脾柔肝息風湯劑量，確定12.0 g·kg-1·d-1治療效果最佳。本研究造模成功后第3 天，湯劑組大鼠于每日上午10∶00 給予健脾柔肝息風湯12.0g·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)6周；而空白組、造模組和針刺組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃。針刺組根據(jù)中國針灸學會發(fā)布的《實驗動物常用穴位名稱與定位第2 部分：大鼠》中穴位定位，選取太沖、三陰交、足三里、神門、內(nèi)關(guān)、合谷、百會、風池等穴位進行針刺：毫針快速刺入皮下，且與皮膚呈垂直狀，緩緩捻入，深度為0.6 cm，有滯緊感后快速捻轉(zhuǎn)160 次/min，上下提插，幅度180°～360°，行針1 min 后留針30 min，然后出針。每日1 次，連續(xù)6 次，休息1 d 為1 個療程，共6 個療程[13]。聯(lián)合組大鼠按照上述方法給予健脾柔肝息風湯灌胃聯(lián)合針刺治療。

1.7 觀察指標與方法

1.7.1 大鼠行為學評價 分別于造模后、藥物干預(yù)結(jié)束后當天進行各組大鼠行為學評價。將單只大鼠放置于透明的觀察籠中，處于安靜、避光的環(huán)境，于籠內(nèi)適應(yīng)5 min，并監(jiān)控記錄5 min 活動，單只觀察完畢后，酒精清理籠內(nèi)排泄物及氣味。由2 人分別觀察影像，參考Diamond 評分標準[12]進行雙盲評分。

1.7.2 樣本采集 最后一次行為學評價結(jié)束后采用二氧化碳吸入法處死各組大鼠，迅速摘取腦組織，于冰盒上分離紋狀體。各組取6只大鼠左側(cè)紋狀體放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于蘇木素-伊紅（HE）染色和TUNEL 染色，右側(cè)紋狀體（尺寸：1 mm × 1 mm × 1 mm 正方體）放入電鏡固定，溶液中固定用于透射電鏡分析；各組剩余6只大鼠左右側(cè)紋狀體取出后于-80 ℃冰箱中保存，用于Western Blot檢測。

1.7.3 HE 染色法觀察紋狀體病理形態(tài) 將已固定好的左側(cè)紋狀體組織制成石蠟切片（厚3 μm），經(jīng)脫蠟至水后，蘇木素染核，鹽酸分化，氨水返藍，伊紅染漿，脫水封片，于顯微鏡下觀察紋狀體病理形態(tài)特點。

1.7.4 TUNEL 染色法觀察紋狀體內(nèi)細胞凋亡 將紋狀體石蠟切片脫蠟至水，滴加蛋白酶K 工作液進行修復(fù)，磷酸緩沖液（PBS）洗滌，滴加破膜工作液，室溫孵育20 min，PBS 洗滌。切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育20 min，PBS 洗滌，滴加Buffer 常溫孵育10 min。加反應(yīng)液，切片平放于濕盒內(nèi)，37 ℃溫箱孵育1 h，加Streptavidin-HRP 反應(yīng)液，37 ℃溫箱孵育30 min。滴加新鮮配制的3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性凋亡細胞核呈棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。蘇木素復(fù)染細胞核，純水洗滌，分化液分化，氨水返藍，二甲苯透明，中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察拍照，同時隨機選取5個視野，統(tǒng)計紋狀體內(nèi)細胞凋亡數(shù)目，計算細胞凋亡率，細胞凋亡率（%）=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.7.5 透射電鏡（TEM）觀察紋狀體自噬體形態(tài)將右側(cè)紋狀體組織放入由低到高梯度酒精中脫水，滲透包埋，包埋樣本放于60 ℃烤箱聚合48 h，取出樣本于超薄切片機制成70 nm 超薄切片，150 目方華膜銅網(wǎng)撈片，于2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色8 min，70%酒精清洗3 次，超純水清洗3次；2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min，超純水清洗3次；濾紙稍吸干，室溫干燥過夜。于透射電鏡下觀察紋狀體組織自噬體形態(tài)。

1.7.6 Western Blot 法檢測紋狀體中相關(guān)蛋白表達 將紋狀體裂解后提取蛋白質(zhì)，采用BCA 蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。上樣30 μg 蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉， 加入按體積比稀釋的一抗Bcl-2 抗體（1∶1 000）、Bax 抗體（1∶1 000）、cleaved-caspase-3 抗體（1∶1 000）、LC3抗體（1∶1 000）、Beclin1抗體（1∶1 000）和內(nèi)參GAPDH（1∶10 000）4 ℃過夜孵育，TBST 洗滌3次，加入按照體積比1∶10 000稀釋的與一抗同種屬的二抗室溫孵育2 h，TBST 洗滌3 次，滴加新鮮配制的增強化學發(fā)光試劑（ECL）進行充分反應(yīng)，顯影、定影。將膠片進行掃描存檔，使用Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值，計算目的蛋白的相對表達量，目的蛋白的相對表達量=目的蛋白的光密度值/內(nèi)參蛋白的光密度值。

1.8 統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠運動及刻板行為評分比較表1 結(jié)果顯示：造模后，與空白組比較，其余4 組（即為造模組）大鼠運動及刻板行為評分顯著升高（均P＜0.05）。藥物干預(yù)結(jié)束后，與空白組比較，模型組大鼠運動及刻板行為評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，湯劑組、針刺組和聯(lián)合組大鼠運動及刻板行為評分顯著降低（P＜0.05）；聯(lián)合組大鼠運動及刻板行為評分顯著低于湯劑組或針刺組（P＜0.05）；湯劑組大鼠運動及刻板行為評分低于針刺組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）

表1 各組大鼠運動及刻板行為評分比較Table 1 Comparison of motor and stereotyped behavior scores in each group of rats（±s，分）

表1 各組大鼠運動及刻板行為評分比較Table 1 Comparison of motor and stereotyped behavior scores in each group of rats（±s，分）

注：①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與湯劑組比較；④P＜0.05，與針刺組比較

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2.2 各組大鼠紋狀體病理學變化比較圖1 結(jié)果顯示：空白組大鼠紋狀體細胞呈圓形，排列緊密有序，間質(zhì)清晰；模型組大鼠紋狀體組織疏松，細胞腫脹，呈不規(guī)則形狀，部分細胞出現(xiàn)固縮性壞死，細胞數(shù)量明顯減少，排列混亂。與模型組比較，湯劑組和針刺組大鼠紋狀體細胞損傷程度有所改善，固縮性壞死和細胞腫脹等情況減少，細胞間隙明顯緊密；與湯劑組或針刺組比較，聯(lián)合組大鼠紋狀體細胞趨于正常。結(jié)果表明，聯(lián)合組治療效果最佳。

圖1 各組大鼠紋狀體病理學變化比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of pathological changes in the striatum in each group of rats（HE staining，×100）

2.3 各組大鼠紋狀體細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達比較圖2、圖3 和表2 結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠紋狀體細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，湯劑組、針刺組和聯(lián)合組大鼠紋狀體細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與湯劑組或針刺組比較，聯(lián)合組大鼠紋狀體細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Bax 和cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；湯劑組大鼠紋狀體細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved-caspase-3、Bcl-2 表達水平與針刺組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠紋狀體細胞凋亡水平（TUNEL法，×200）Figure 2 Levels of apoptosis in striatal cells in each group of rats（TUNEL method，×200）

圖3 各組大鼠紋狀體中Bcl-2、Bax和cleavedcaspase-3蛋白的Western Blot 電泳條帶圖Figure 3 Western Blot electrophoresis band of Bcl-2，Bax and cleaved-caspase-3 in the striatum of each group of rats

表2 各組大鼠紋狀體細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達比較Table 2 Comparison of apoptosis and apoptosis-related proteins expressions in striatal cells in each group of rats（±s）

表2 各組大鼠紋狀體細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達比較Table 2 Comparison of apoptosis and apoptosis-related proteins expressions in striatal cells in each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與湯劑組比較；④P＜0.05，與針刺組比較

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2.4 各組大鼠紋狀體組織自噬體形態(tài)變化比較圖4結(jié)果顯示：空白組大鼠紋狀體細胞正常，核膜光滑且完整連續(xù)，雙層結(jié)構(gòu)清晰可見，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻；模型組大鼠紋狀體細胞呈不規(guī)則形狀，核膜粗糙且不連續(xù)，出現(xiàn)鋸齒樣，雙層結(jié)構(gòu)混亂，部分胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)自噬體。與模型組比較，湯劑組和針刺組大鼠紋狀體不規(guī)則形狀細胞減少，自噬體數(shù)量增多，且湯劑組的自噬水平略高于針刺組；與湯劑組或針刺組比較，聯(lián)合組大鼠紋狀體細胞趨于正常，核膜較光滑完整，出現(xiàn)大量的自噬體。表明聯(lián)合組治療效果最佳。

圖4 各組大鼠紋狀體組織自噬體形態(tài)圖（透射電鏡，藍色箭頭指示自噬體）Figure 4 Morphological features of autophagosomes in striatal tissue of each group of rats（under TEM，blue arrows indicate autophagosomes）

2.5 各組大鼠紋狀體中自噬相關(guān)蛋白LC3 和Beclin1 蛋白表達比較圖5、表3 結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠紋狀體中LC3 和Beclin1 蛋白表達水平無顯著性差異（P＜0.05）；與模型組比較，湯劑組、針刺組和聯(lián)合組大鼠紋狀體中LC3和Beclin1 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；聯(lián)合組大鼠紋狀體中LC3 和Beclin1 蛋白表達水平顯著高于湯劑組和針刺組（P＜0.05）。LC3 和Beclin1 參與自噬體的形成，均為重要的自噬標志性分子，LC3表達水平可判斷自噬是被誘導還是被抑制，而Beclin1 可評估自噬活性的強弱程度[14]。結(jié)果表明，正常情況下（空白組）紋狀體自噬水平很低，而紋狀體病理生理狀態(tài)下（模型組），部分自噬被激活，但不顯著；健脾柔肝息風湯和針刺在紋狀體病理狀態(tài)下均能激活自噬，其中健脾柔肝息風湯聯(lián)合針刺引起的自噬水平最高。

圖5 各組大鼠紋狀體中LC3和Beclin1蛋白的Western Blot電泳條帶圖Figure 5 Western Blot electrophoresis bands of LC3 and Beclin1 proteins in the striatum of each group of rats

表3 各組大鼠紋狀體中LC3和Beclin1蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of protein expression levels of LC3 and Beclin1 in the striatum of each group of rats（±s）

表3 各組大鼠紋狀體中LC3和Beclin1蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of protein expression levels of LC3 and Beclin1 in the striatum of each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與湯劑組比較；③P＜0.05，與針刺組比較

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3 討論

抽動障礙是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。抽動障礙發(fā)展機制尚不明確，但控制運動和行為的CSTC 回路在其進展中起關(guān)鍵作用[15]。有研究[15-16]表明，紋狀體是CSTC 回路的主要調(diào)節(jié)元件，在抽動障礙疾病中具有核心作用。Makki 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，兒童紋狀體的微觀結(jié)構(gòu)異常會加重抽動障礙。本研究通過腹腔注射IDPN 構(gòu)建抽動障礙大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：抽動障礙大鼠紋狀體內(nèi)部分自噬被激活，但不顯著；細胞凋亡水平增加，紋狀體受損嚴重，運動及刻板行為評分升高，出現(xiàn)明顯的抽動癥狀。盡快阻斷上述病理進程、保護紋狀體細胞是改善抽動障礙抽動的關(guān)鍵。本研究單用健脾柔肝息風湯或針刺對抽動障礙大鼠抽動癥狀均有改善作用，表現(xiàn)為提高大鼠紋狀體自噬水平，降低紋狀體細胞凋亡水平，改善紋狀體損傷從而減輕抽動癥狀。

健脾柔肝息風湯以白芍、茯苓為君，鉤藤、僵蠶、全蝎為臣，以甘草調(diào)和，共奏健脾化痰、柔肝養(yǎng)陰息風之效。本課題組前期實驗研究[18-19]結(jié)果顯示，健脾柔肝息風湯對抽動障礙大鼠的運動性抽動行為有良好的緩解作用，主要通過降低腦組織多巴胺受體1、2 表達及調(diào)節(jié)多巴胺能系統(tǒng)及代謝產(chǎn)物平衡。本研究結(jié)果表明，健脾柔肝息風湯可有效改善抽動障礙大鼠抽動癥狀，其主要是通過調(diào)節(jié)紋狀體區(qū)細胞自噬和凋亡水平發(fā)揮作用。

近年來，針刺在治療抽動障礙方面具有積極的臨床療效[20]。本研究選取百會（督脈）、神門（手少陰心經(jīng)）、風池（足少陽膽經(jīng)）、內(nèi)關(guān)（手厥陰心包經(jīng)）、合谷（手陽明大腸經(jīng)）、足三里（足陽明胃經(jīng)）、太沖（足厥陰肝經(jīng)）、三陰交（足太陰脾經(jīng)）等穴位。取百會為治療抽動障礙要穴，太沖、三陰交、足三里、神門、內(nèi)關(guān)、合谷、風池為常用重要的腧穴，共奏醒神開竅、安神定志、通督定癇的效果[20-22]。本研究結(jié)果顯示，健脾柔肝息風湯聯(lián)合針刺對抽動障礙大鼠的治療效果較單用健脾柔肝息風湯或針刺治療更加顯著，表明健脾柔肝息風湯聯(lián)合針刺治療，在各自發(fā)揮作用的同時相輔相成。

自噬是一種維持正常細胞活動的蛋白降解方式。對多種神經(jīng)疾病模型大鼠紋狀體進行分析的結(jié)果顯示，紋狀體區(qū)細胞自噬水平提高可改善紋狀體損傷，緩解運動障礙[23-24]。自噬具有十分復(fù)雜的調(diào)控機制，許多蛋白參與其中，其中Beclin1 和LC3 是與自噬相關(guān)的關(guān)鍵蛋白[25]。研究[26-27]表明，紋狀體內(nèi)Beclin1 和LC3 蛋白高表達，可引起自噬激活，從而減輕紋狀體神經(jīng)元損傷和運動障礙。研究[27-28]還發(fā)現(xiàn)，Beclin1 可介導凋亡與炎癥機制，具有抗凋亡作用。Wang 等[29]研究顯示，失調(diào)的自噬途徑會導致腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡，使腦內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)和促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，抽動障礙大鼠紋狀體中Bax 和cleaved-caspase-3 蛋白高表達，而Bcl-2 蛋白低表達，Beclin1 和LC3 蛋白差異不顯著，細胞凋亡率升高，紋狀體受損明顯；經(jīng)健脾柔肝息風湯聯(lián)合針刺干預(yù)后，抽動障礙大鼠紋狀體中Bax和cleaved-caspase-3 蛋白低表達，而Bcl-2、Beclin1 和LC3 蛋白高表達。提示聯(lián)合治療通過激活紋狀體內(nèi)大量細胞自噬，抑制細胞凋亡，從而減輕紋狀體損傷。

綜上所述，健脾柔肝息風湯輔以針刺治療可提高抽動障礙大鼠紋狀體區(qū)細胞自噬水平，并抑制細胞凋亡，改善抽動障礙大鼠紋狀體損傷，從而緩解抽動癥狀。本研究為臨床聯(lián)合應(yīng)用健脾柔肝息風湯和針刺治療抽動障礙提供了依據(jù)。