黑果腺肋花楸果中原花青素和花色苷的提取及其結(jié)合?；悄懰徕c能力研究

王旭輝 鐘方麗 王曉林郭 浩 陳 浩

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）原產(chǎn)于北美，屬薔薇科腺肋花楸屬灌木，果實(shí)具有多種生物活性[1]。目前，尚未見黑果腺肋花楸果實(shí)作為飼料添加劑在動(dòng)物養(yǎng)殖方面大規(guī)模使用的報(bào)道，但已有學(xué)者對(duì)其在動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用開展了研究。原花青素食用安全，具有抗炎、抗氧化等功效[2]。田躍等[3]研究表明，在肉雞日糧中添加葡萄籽原花青素可以提高肉雞平均日增重，降低料重比，改善肉雞機(jī)體的免疫能力。自然條件下游離的花青素較少，常與糖通過糖苷鍵形成花色苷[4]?；ㄇ嗨氐目寡趸饔糜兄诰S持畜禽生產(chǎn)過程中的氧化狀態(tài)平衡，改善畜禽的健康[5]。黑果腺肋花楸果中多酚類物質(zhì)主要包括花青素、原花青素等，在飼料中添加富含多酚的黑果腺肋花楸果渣，可提高羔羊肌肉組織的抗氧化能力[6]。黑果腺肋花楸果渣可作為改善豬生長(zhǎng)性能、抗氧化酶活性和肉品質(zhì)的飼料添加劑[7]。

關(guān)于黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷提取的研究已有報(bào)道[8-9]，但未見同時(shí)提取原花青素、花色苷的工藝研究。本試驗(yàn)以黑果腺肋花楸果為原料，擬采用單因素試驗(yàn)探究其原花青素、花色苷同時(shí)提取工藝并進(jìn)行正交優(yōu)化，與超聲波、微波、超聲波-微波協(xié)同、添加表面活性劑幾種輔助方式提取效果作對(duì)比，測(cè)定提取物與?；悄懰徕c的結(jié)合率，為黑果腺肋花楸在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑果腺肋花楸果購(gòu)自吉林省黑果花楸農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司。

表兒茶素對(duì)照品購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

TU-1950 紫外分光光度計(jì)購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，XH-300UL-2 雙頻超聲波微波紫外光組合催化合成儀購(gòu)自北京祥鵠科技發(fā)展有限公司，F(xiàn)A3204B電子分析天平購(gòu)自上海天美天平儀器有限公司，SK5210HP 超聲波清洗器購(gòu)自上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，H1580 醫(yī)用離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷提取工藝

采用乙醇水溶液提取黑果腺肋花楸果中原花青素、花色苷，將黑果腺肋花楸果置于60 ℃干燥6～8 h，粉碎，過80目篩。稱取黑果腺肋花楸果干粉2.0 g，在設(shè)定的提取條件下提取，定容，搖勻。

1.3.2 原花青素提取量的測(cè)定

1.3.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的表兒茶素對(duì)照品5.0 mg，置于10 mL 容量瓶中，加適量無水甲醇溶解，定容，配制成質(zhì)量濃度為0.5 g/L的對(duì)照品溶液。

1.3.2.2 供試品溶液的制備

按提取工藝進(jìn)行提取，過濾，濾液用提取溶劑定容，即為供試品溶液。

1.3.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各2.0 mL，置于25 mL棕色容量瓶中（錫箔包裹嚴(yán)實(shí)，避光），加入4%香草醛甲醇溶液5 mL，混合均勻，加入3 mL濃鹽酸，混勻，甲醇定容，水浴30 ℃避光下顯色30 min，以甲醇代替樣品液為空白，按照紫外可見分光光度法，在300～700 nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為500 nm。

1.3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取表兒茶素對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，于25 mL 棕色容量瓶中，按照1.3.2.3的方法，以甲醇代替樣品液為空白，按照紫外可見分光光度法測(cè)定500 nm處的吸光度值（A）。以吸光度值為縱坐標(biāo)，表兒茶素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=7.088 1x+0.019 3，R2=0.999 4，表兒茶素在0.01～0.12 g/L之間線性良好。

1.3.2.5 原花青素提取量的計(jì)算

吸取每次試驗(yàn)所得供試品溶液2 mL，按照1.3.2.3 的方法，以未加顯色劑的供試品溶液為空白，按照紫外可見分光光度法，測(cè)定500 nm處的吸光度值（A），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中原花青素的濃度及提取量。

式中：W為原花青素提取量（mg/g）；c為根據(jù)吸光度值計(jì)算出的溶液質(zhì)量濃度（g/L）；V為提取液體積（mL）；m為黑果腺肋花楸果粉取樣量（g）。

1.3.3 花色苷提取量的測(cè)定

吸取2 份1 mL 供試品溶液，置于10 mL 容量瓶中，分別用pH值1.0、4.5的緩沖液稀釋定容，40 ℃恒溫水浴平衡30 min，分別在510、700 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值[10-11]，計(jì)算花色苷的提取量。

式中：W為花色苷提取量（mg/g）；DF為稀釋因子；A為吸光度，A=(A510nm-A700nm)pH值1.0-(A510nm-A700nm)pH值4.5；M為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量，取值為449.2；m為黑果腺肋花楸果粉取樣量（g）；V為供試品溶液體積（mL）；ε為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的消光系數(shù)，取值為26 900；L為光程，取值為1 cm。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

以黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷總提取量為考察指標(biāo)，原花青素、花色苷提取量為次要指標(biāo)，進(jìn)行單因素提取試驗(yàn)。稱取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，考察提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)（0、10%、30%、50%、70%、90%）、提取溫度（25、40、50、60、70、80 ℃）、提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）、液料比（5、10、20、30、40、50、60、70 mL/g）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5）對(duì)原花青素、花色苷提取量及總提取量的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以原花青素、花色苷總提取量為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)，L9(34)正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。試驗(yàn)中固定提取溫度為80 ℃，提取次數(shù)為2次。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.3.6 工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)確定的最佳提取工藝條件重復(fù)3 次，計(jì)算干浸膏的質(zhì)量。

1.3.7 輔助提取方法研究

1.3.7.1 微波輔助提取稱取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，微波功率設(shè)定為500 W，按照1.3.6 中的方法進(jìn)行提取[12]，其中微波輔助提取的時(shí)間設(shè)定為30 min，提取結(jié)束后過濾，濾液用提取溶劑定容，測(cè)定濾液的吸光度值，計(jì)算提取量。

1.3.7.2 超聲輔助提取

稱取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，超聲功率設(shè)定為300 W，按照1.3.6 中的方法進(jìn)行提取[13]，超聲輔助提取的時(shí)間設(shè)定為30 min。

1.3.7.3 微波-超聲協(xié)同輔助

稱取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，微波功率設(shè)定為500 W，超聲功率設(shè)定為300 W，按照1.3.6 中的方法進(jìn)行提取[12-13]，輔助提取的時(shí)間設(shè)定為30 min。

1.3.7.4 表面活性劑輔助

稱取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，加入果粉重量2%的表面活性劑十二烷基硫酸鈉，按照1.3.6中的方法進(jìn)行提取[13]。

1.3.8 體外結(jié)合?；悄懰徕c能力的測(cè)定

1.3.8.1 溶液的配制

取Na2HPO435.8 g 溶于500 mL 的蒸餾水中，搖勻，得到溶液A；取NaH2PO47.8 g 溶于250 mL 的蒸餾水中，混勻，得到溶液B。吸取22.5 mL溶液A和77.5 mL溶液B，混勻，即為pH 值6.3 的磷酸鹽緩沖液。稱取牛磺膽酸鈉0.016 g 溶解于磷酸鹽緩沖液中，配制0.3 mmol/L 的牛磺膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.8.2 牛磺膽酸鈉結(jié)合率的測(cè)定

稱取25 mg黑果腺肋花楸果提取物，60%的乙醇溶液溶解，定容，即為供試品溶液。吸取供試品溶液1、2、3、4、5、6 mL分別置于具塞試管中，用60%乙醇溶液補(bǔ)至6 mL，分別加入4 mL?；悄懰徕c標(biāo)準(zhǔn)溶液。以磷酸鹽緩沖液替代黑果腺肋花楸果提取物溶液為空白對(duì)照組，以磷酸鹽緩沖液替代?；悄懰徕c標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)照組。試驗(yàn)組、對(duì)照組、空白對(duì)照組均在37 ℃水浴恒溫振蕩1 h，8 000 r/min 離心10 min。取2.5 mL 上清液，加入7.5 mL 60%硫酸，搖勻，70 ℃水浴20 min，取出，冰浴5 min，測(cè)定387 nm的吸光度，計(jì)算膽酸鹽結(jié)合率[14]。

式中：A1為試驗(yàn)組的吸光度值；A0為對(duì)照組的吸光度值；A鹽為空白對(duì)照組的吸光度值。

以供試品溶液與?；悄懰徕c的結(jié)合率為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，計(jì)算供試品的IC50值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，采用WPS和Origin 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑對(duì)提取量的影響（見圖1）

圖1 提取溶劑對(duì)提取量的影響

由圖1 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，原花青素提取量及總提取量均先增加后下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)提取量最高?？赡苁且?yàn)樵ㄇ嗨刈鳛槎喾踊衔铮兹苡谒投鄶?shù)有機(jī)溶劑，當(dāng)體系極性與原花青素極性相近時(shí)，更容易將其萃取[15]。花色苷提取量也呈先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)提取量最大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大到90%時(shí)，提取量明顯下降?？赡芑ㄉ站哂兴苄?，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高抑制了花色苷的溶出。綜合考慮以原花青素、花色苷總提取量為主要考察指標(biāo)，選擇30%的乙醇水溶液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～70%之間提取量較高。因此，選擇30%、50%、70% 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 提取溫度對(duì)提取量的影響（見圖2）

圖2 提取溫度對(duì)提取量的影響

由圖2 可知，原花青素、花色苷提取量隨溫度升高不斷增加，80 ℃時(shí)原花青素、花色苷及總提取量最高。乙醇的沸點(diǎn)為78.3 ℃，當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，提取溶劑已處于微沸狀態(tài)，繼續(xù)提高水浴溫度意義不大，且水浴溫度越高所需能耗越大。因此，選擇80 ℃為提取溫度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)提取量的影響（見圖3）

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取量的影響

由圖3可知，原花青素提取量在0.5～1.5 h逐漸增加，1.5 h時(shí)提取量最高，1.5 h后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取量下降。可能是時(shí)間過短，原花青素提取不夠充分，時(shí)間過長(zhǎng)，原花青素酚羥基被破壞，影響提取量[16]。花色苷提取量0.5 h最大，且隨提取時(shí)間延長(zhǎng)變化不大。原花青素、花色苷總提取量1.5 h時(shí)最大，綜合考慮選擇1.5 h為提取時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。提取時(shí)間大于1.5 h后，總提取量有所下降，而在0.5～1.5 h 之間總提取量較高，且差別不明顯。因此，選擇0.5、1.0、1.5 h 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.4 液料比對(duì)提取量的影響（見圖4）

圖4 液料比對(duì)提取量的影響

由圖4 可知，原花青素提取量隨液料比增加呈增加趨勢(shì)，液料比為70 mL/g時(shí)提取量最高。隨著溶劑用量的增加，溶質(zhì)不斷從原料中析出，當(dāng)液料比達(dá)到70 mL/g時(shí)，溶質(zhì)析出呈最高水平，較液料比60 mL/g 時(shí)變化不大。液料比為40 mL/g時(shí)，花色苷提取量最大，增加液料比提取量略有下降，但總體變化不大。而總提取量液料比70 mL/g時(shí)最大，因此，選擇液料比70 mL/g進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)?？偺崛×侩S著液料比加大而提高，當(dāng)液料比達(dá)到60 mL/g 后，雖然總提取量隨著液料比加大而繼續(xù)提高，但提高幅度有限。因此，選擇65、70、75 mL/g 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)提取量的影響（見圖5）

圖5 提取次數(shù)對(duì)提取量的影響

由圖5 可知，第3 次提取原花青素提取量為0，花色苷提取量明顯變小。前2 次提取原花青素、花色苷總提取量之和為10.87 mg/g，因此，選擇提取2次進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果（見表2、表3）

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析

由表2可知，根據(jù)R值判斷各因素影響提取量大小排序?yàn)锽＞C＞A，表明提取時(shí)間對(duì)提取量的影響最大，其次為液料比，乙醇體積分?jǐn)?shù)影響最小。最優(yōu)條件為A2B3C1，即提取溶劑為50%的乙醇水溶液、提取時(shí)間為1.5 h、提取液料比為65 mL/g、提取溫度為80 ℃、連續(xù)提取2次。

由表3 方差分析可知，各因素對(duì)總提取量無顯著性差異。

2.3 工藝穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（見表4）

表4 工藝穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表4 可知，3 批樣品中原花青素提取量平均值為10.37 mg/g，花色苷提取量平均值為0.88 mg/g，總提取量平均值為11.25 mg/g。3批試驗(yàn)結(jié)果原花青素、花色苷總提取量接近，平行性較好，證明該提取條件穩(wěn)定，可以作為黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷同時(shí)提取的工藝參數(shù)。

2.4 輔助試驗(yàn)結(jié)果（見表5）

由表4 可知，輔助試驗(yàn)中原花青素及總提取量均比工藝驗(yàn)證批次平均提取量略高，花色苷提取量微波輔助高于工藝驗(yàn)證批次平均提取量，其他與工藝驗(yàn)證平均提取量相同或略低，花色苷提取效果受輔助條件影響更小。幾種輔助條件下原花青素及總提取量升高，可能是因?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)增大了溶劑分子的運(yùn)動(dòng)速度和穿透力，加快了原花青素的提取。在微波場(chǎng)中，由于微波的輻射作用，物料內(nèi)部溫度迅速升高，壓力增大，使原花青素快速溶出[17]。表面活性劑的雙親結(jié)構(gòu)可降低溶液的表面張力，增強(qiáng)溶劑對(duì)物料潤(rùn)濕和滲透作用，起增溶效果，加快了原花青素的提取[18]。

2.5 體外結(jié)合?；悄懰徕c能力試驗(yàn)的結(jié)果（見圖6）

圖6 ?；悄懰徕c結(jié)合率結(jié)果

由圖6 可知，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷提取物與牛磺膽酸鈉結(jié)合率（y，%），隨著加入樣品質(zhì)量濃度（x，g/L）的增大而逐漸增大，且呈線性關(guān)系，擬合方程為：y=25.24x+29.151，IC50值為0.83 g/L，說明黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷提取物具有與?；悄懰徕c結(jié)合的能力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用紫外分光光度法、pH示差法分別測(cè)定黑果腺肋花楸果提取液中原花青素、花色苷的含量，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷同時(shí)提取工藝，最佳工藝條件為提取溶劑為50%的乙醇水溶液，時(shí)間為1.5 h、溫度為80 ℃、液料比為65 mL/g、提取為2 次，在優(yōu)化條件下原花青素提取量為10.37 mg/g、花色苷提取量為0.88 mg/g，總提取量為11.25 mg/g。黑果腺肋花楸果提取物與?；悄懰徕c具有結(jié)合能力，IC50值為0.83 g/L。